白藜蘆醇激活JNK通路抑制膠質瘤細胞生長

林曉敏 劉 佳

膠質母細胞瘤(glioblastoma，GBM)是臨床常見且極具危害性的原發性腦腫瘤。根據美國腦腫瘤登記中心2018年發表數據可知，GBM年均發生率為3.2人/10萬人，且為原發性中樞神經系統腫瘤患者死亡的主要原因之一[1]。目前，手術是GBM的首選治療方式，但大腦功能的特殊性和GBM的高度侵襲性使腫瘤難以根除。因此，GBM的臨床治療原則是在最大程度上安全切除腫瘤的基礎上輔以不同形式的放療、化療、生物治療或聯合治療[2]。盡管如此，長期放、化療使GBM細胞往往表現出放療抗性和化療耐受性，而腫瘤一旦復發患者通常在6個月內離世，因此罹患GBM患者的術后平均生存時間仍僅有12～16個月，雖較未接受治療的患者3個月生存期稍延長，但5年生存率依舊低于10%[1, 3]。因此，尋求安全有效的抗GBM新藥或應對TMZ繼發耐藥的備選藥物，探索其安全可靠性，分析其抗癌的細胞分子生物學效應，將有助于改善GBM的臨床治療現狀，具有明顯的理論價值和臨床意義。

白藜蘆醇(resveratrol，Res)，化學名稱為3,5,4′-三羥基-1,2-二苯乙烯，是從植物中提取的天然多酚類化合物，已被許多研究證明，具備抗腫瘤、化學預防的重要生物活性，可抑制多種腫瘤細胞體外的啟始、促進和發展[4]。除此之外，白藜蘆醇對于膠質母細胞瘤表現出良好的抗癌作用。本課題組前期研究發現，經白藜蘆醇處理后的甲狀腺癌和膀胱癌細胞，電鏡下觀察到線粒體出現腫脹損傷，因此猜測白藜蘆醇對腫瘤細胞有誘導氧化損傷的作用[5]。研究發現，作為MAP激酶家族的一員，c-Jun氨基末端激酶(c-Jun N-terminalkinase，JNK)活化后所激活的JNK通路與氧化應激息息相關，參與細胞增殖、分化和凋亡的調控[6]。目前，對于白藜蘆醇、氧化應激、JNK這三者之間潛在關系的研究尚未發現。本研究對白藜蘆醇的進一步研究發現，白藜蘆醇對鼠膠質瘤細胞C6具備很強的抑制作用，并對細胞內活性氧(reactive oxygen species，ROS)具備誘導堆積作用，同時影響JNK通路的活化狀態，進而導致細胞發生凋亡，這為尋找和求證白藜蘆醇的抗腫瘤機制提供了另一有力的科學依據，同時也為評估白藜蘆醇作為治療膠質瘤備選藥物的研究價值提供參考。

材料與方法

1.材料：大鼠膠質母細胞瘤C6細胞系受贈于上海市第十人民醫院中心實驗室，購買于中國科學院上海生命科學研究院細胞資源中心[7]。C6細胞在含10%FBS及100U/ml青霉素和100μg/ml鏈霉素的DMEM培養基中, 37℃、5.0% CO2條件下培養。每2～3天以1∶4傳代培養。

2.主要試劑：白藜蘆醇購(美國Sigma-Aldrich公司)，p-MKK7、c-Jun、Bak多克隆抗體(沈陽萬類生物公司)，JNK、p-JNK單克隆抗體(上海碧云天生物技術有限公司)，Bcl-2多克隆抗體(博奧森生物公司)，β-actin單克隆抗體、IgG(美國Proteintech公司)，噻唑藍(廣州阜通生物公司)，活性氧檢測試劑盒(上海碧云天生物技術有限公司)，FITC Annexin V Apoptosis Detection Kit I(美國BD公司)，PrimeScript RT reagent Kit(日本TaKaRa公司)，PCR檢測引物由北京擎科生物科技有限公司設計合成，引物序列見表1。

表1 RT-PCR引物序列

3.MTT實驗：取對數生長期的C6細胞, 以1.5×104個/毫升的密度接種于96孔板, 每孔100μl。實驗組藥物終濃度分別為10、20、30、40、50、100μmol/L,對照組加入等體積含0.1%DMSO的培養基(0μmol/L)，置于培養箱中培養48h后，每孔內加入10μl MTT工作液，培養箱中孵育4h后，棄去上清，每孔加入100μl DMSO，搖床上振蕩30min以便充分溶解孔底的藍紫色結晶甲臜，多功能微孔板讀數儀(美國Thermo公司)測試各孔570nm處的吸光度。

4.凋亡實驗：取對數生長期的C6的細胞, 以105個/毫升的密度接種于6孔板,每孔1ml, 預培養24h后, 實驗組加入終濃度為20μmol/L Res, 對照組加入等體積含0.1%DMSO的培養基(0μmol/L)，培養箱中培養24h。將培養基連同胰酶消化后的細胞收集至離心管內，離心后冷PBS輕柔洗滌2次，加入1ml binding buffer進行細胞計數并進行適當稀釋。取2×104個細胞加入200μl Annexin V & PI工作液中，充分混勻后室溫下避光孵育10min，加入800μl binding buffer，200目濾網過濾后冰盒中保存，1h內流式細胞儀(美國BD公司)選取FITC及PE通道進行檢測。

5.細胞內駐留實驗：取潔凈的玻璃爬片置于12孔板內，對數生長期的C6的細胞, 以5×104個/毫升的密度接種于12孔板, 每孔1ml, 置于培養箱中培養24h后加藥，藥物終濃度為100μmol/L，置于培養箱中培養4h。以藥物處理4h為時間原點，PBS洗滌3次后將細胞分別使用完全培養基培養0、1、4、24h。在各個時間點收集細胞爬片，4%多聚甲醛室溫固定15min，滴加抗熒光淬滅封片液后封片，激光共聚焦顯微鏡(德國ZEISS公司)405nm通道激發，488nm通道接收的條件下進行觀察拍攝。

6.ROS檢測：將對數生長期的C6細胞, 以105個/毫升的密度接種于6孔板,每孔1ml, 預培養24h后, 實驗組加入終濃度為20μmol/L Res, 對照組加入等體積含0.1%DMSO的培養基(0μmol/L)培養48h。取2×104個細胞加入10μl DCFH-DA，充分混勻后置于培養箱中避光孵育20min。去除培養基，并用冷PBS清洗兩次，流式細胞儀(美國BD公司)FITC通道檢測。

7.Western blot法檢測：將經過100μmol/L Res處理及對照組處理后的C6細胞進行裂解和蛋白提取后，各取30μg置于10%聚丙烯酰胺凝膠電泳后轉至聚偏氟乙烯膜(PVDF)，5%脫脂奶粉封閉液常溫封閉2h后，抗體孵育后(p-MKK7 1∶500, JNK1∶800,p-JNK 1∶500,c-Jun 1∶800, Bak 1∶500, Bcl-2 1∶500, β-actin 1∶10000)，超靈敏多功能成像儀(美國GE公司)成像。轉有蛋白的PVDF在使用后均用TBST清洗，封閉液封閉2h，并保存于-20℃以待后續使用。

8.RT-PCR檢測相關mRNA表達：使用RNA Isolation Kit with Spin Column將經過100μmol/L Res處理及對照組(0μmol/L)處理后的C6細胞進行RNA提取。嚴格按照PrimeScript RT reagent Kit說明書對所提取RNA進行反轉錄，然后使用針對單個基因cDNA的引物(表1)進行聚合酶鏈反應(PCR)。對最終產物進行瓊脂糖電泳，并置于超靈敏多功能成像儀(美國Bio-Rad公司)進行成像。同一處理方法的細胞β-actin聚合酶鏈反應的產物作為定量對照。

結 果

1.白藜蘆醇對C6細胞增殖的抑制作用：10、20、30、40、50、100μmol/L的Res分別處理C6細胞48h后，使用MTT進行檢測。從MTT結果可以看到，隨著Res濃度的升高，細胞活性出現明顯降低的現象(圖1A)，各個濃度的Res對應的細胞增殖抑制率分別為12.42%±0.46%、33.46%±1.24%、51.56%±2.37%、62.44%±5.79%、71.12%±2.37%、76.65%±0.60%，Res對C6細胞的IC50為31.39μmol/L(圖1B)，Res對細胞增殖的抑制作用與藥物處理濃度呈正相關關系。

圖1 細胞毒性實驗檢測白藜蘆醇對C6細胞增殖的影響

2.白藜蘆醇對C6細胞凋亡的促進作用：C6細胞貼壁生長24h后，加入20μmol/L Res繼續培養24h后，Annexin Ⅴ和PI雙染檢測細胞的凋亡情況。如圖2所示, 對照組細胞在培養24h后，未見明顯的細胞凋亡情況，而實驗組在20μmol/L Res處理24h后，細胞出現了明顯的凋亡現象，細胞凋亡比例為22.33%±1.71%(P=0.000)，表明Res可誘導C6細胞發生凋亡。

圖2 白藜蘆醇對C6細胞凋亡情況的影響

3.白藜蘆醇在細胞內的駐留部位及駐留時間：Res在405nm激發光下可產生綠色熒光并被激光共聚焦顯微鏡捕獲[8]。利用Res這一特性，可通過激光共聚焦觀察Res在細胞內的駐留時間。100μmol/L的Res處理C6細胞4h后，更換完全培養基分別培養0、1、4、24h。在Res處理4h后，整個細胞內部均可以觀察到強烈的顆粒感綠色熒光，且細胞核內呈現了更為強烈的綠色熒光,表明Res可以進入細胞，甚至駐留在細胞質、細胞核。撤去Res后，綠色熒光強度驟降，僅在細胞質內可見微弱的綠色熒光。在24h時，綠色熒光已幾乎不可見，表明細胞內Res濃度隨著時間的推移而降低，在24h后，只有少量Res殘留。

圖3 激光共聚焦顯微鏡觀察白藜蘆醇在C6細胞內的駐留部位及時間(×20)

4.白藜蘆醇誘導C6細胞內ROS堆積的作用：ROS是指體內一類氧的單電子還原產物，通常被認為是氧代謝的天然副產品，在細胞信號轉導和體內平衡中發揮重要作用，有研究發現，ROS累積被認為是Res在癌細胞中引起的生物學事件之一[5,9]。因此，為了進一步明確Res抑制C6細胞增殖，促進其凋亡的機制,筆者使用流式細胞儀檢測了經Res處理的C6細胞中ROS的水平。流式細胞儀實驗結果提示，在20μmol/L Res處理后，細胞內ROS水平較對照組顯著增加(P=0.01)，且增加的活性氧水平是對照組的1.5倍以上(圖4)。

圖4 白藜蘆醇對C6細胞內ROS水平的影響

5.蛋白水平及基因水平檢測JNK通路活化狀態：由于在細胞遭受氧化應激時，JNK通路可能通過上調某些促凋亡基因而發揮積極作用[10]。因此，可通過Western blot法和RT-PCR研究了Res誘導ROS積累在JNK通路中以及與JNK相關基因表達的潛在影響。在100μmol/L Res處理后，JNK通路上游蛋白，p-MKK7和p-JNK的表達水平均顯著高于對照組(P=0.000)。而p-JNK其所調控的c-Jun，無論是在mRNA水平還是蛋白水平上均呈現出表達顯著上調的狀態(P=0.000)。JNK通路下游蛋白，促凋亡蛋白Bak在100μmol/L Res處理后，表達水平較對照組顯著增加(P=0.000)，而抗凋亡蛋白Bcl-2表達量下降了9%(P=0.059，圖5)。

圖5 白藜蘆醇處理后C6細胞系JNK通路的活化狀態

討 論

GBM是惡性度極高的原發性腦腫瘤，具有侵襲性強、根治性切除難度大、復發率高、預后差的特點。因此，即使接受了最大程度的手術切除，仍需要輔助化療來降低腫瘤復發的風險。Res是一種天然的多酚類化合物，對GBM細胞有多種抑制作用，但對正常組織和細胞無毒性不良反應，提示其在GBMs輔助化療中的潛在價值[11～13]。本研究的MTT實驗結果證實，Res對C6細胞增殖的抑制作用呈現出濃度依賴性，且較低濃度的Res(10μmol/L和20μmol/L)對C6細胞即有較強的增殖抑制作用，提示C6細胞對Res極為敏感，這與Guo等[14]的研究結果相近。由于白藜蘆醇對細胞大小和形態影響較大，因此筆者選用較低濃度(20μmol/L)進行細胞凋亡實驗，以確保實驗結果的可靠性，其結果也進一步證明了低濃度的Res(20μmol/L)處理24h即可對C6細胞產生促凋亡作用。

藥物在細胞內的作用部位與其抗腫瘤機制息息相關，因此在進行機制研究前，筆者需要明確Res在細胞內的駐留情況。Lan?on等[8]在研究人肝細胞對Res的攝取時發現，Res可通過被動擴散和載體介導的方式快速進入細胞，且主要分布于細胞質，細胞核內僅核仁可見微弱的綠色熒光信號。Yuan等[15]研究發現，Res在乳腺癌細胞中主要分布在細胞核。為了明確白藜蘆醇在細胞內的分布情況及濃度變化，本實驗中筆者使用激光共聚焦顯微鏡，觀察了不同時間點Res在細胞內的駐留部位及駐留時間，結果表明，Res可進入細胞，并同時駐留在細胞質和細胞核內，且細胞內的Res濃度呈現出時間依賴性，即其濃度隨著時間的推移而降低，且主要位于細胞質。而筆者前期的研究數據證明，Res可誘導未分化甲狀腺癌細胞線粒體內過量ROS堆積，導致其發生損傷，進而發生凋亡，這與筆者所發現的白藜蘆醇主要駐留在細胞質相吻合。ROS穩態是正常細胞和細胞信號轉導所必需的，在此研究中，ROS特異性染色結果證實了在Res治療后，C6細胞中的ROS顯著增加，加上筆者之前的研究已表明，抗氧化試劑NAC減少活性氧積累，一定程度增加了Res處理后THJ-16T細胞的存活，因此筆者提出猜想，Res對腫瘤細胞線粒體的促氧化劑作用是Res導致細胞凋亡的原因[5]。

目前關于白藜蘆醇抗膠質瘤的分子機制的研究很多，包括AKT/p53通路、PI3K/Akt/NF-κB通路等等[16,17]。而關于Res作為促氧化劑抑制細胞生長和促進細胞凋亡的信號通路卻鮮有報道。進一步查閱相關文獻，筆者發現作為MAP激酶家族一員的JNK，其在細胞遭遇氧化應激時發揮重要作用[18]。因此，筆者對JNK通路的活化狀態展開研究，以期能探明Res、ROS及JNK通路三者之間的關系。有研究表明MKK4和MKK7作為JNK上游的兩種MAP激酶家族的成員，可活化JNK，使之成為p-JNK，并發生胞質向胞核的易位[19]。為了保證有足量的JNK通路相關蛋白和RNA，筆者選用了高濃度Res(100μmol/L)進行實驗。本實驗結果表明，在Res處理后，p-MKK7和p-JNK蛋白量顯著增加，提示Res確實可激活JNK。進一步參考相關文獻發現，轉錄因子c-Jun是JNK最常見的靶向基因之一，而活化的c-Jun可激活下游某些促凋亡蛋白如Bak，而與Bak相關的抗凋亡蛋白Bcl-2亦可被活化的JNK所抑制[19]。而筆者對下游蛋白的研究結果，c-Jun、Bak表達顯著上調，Bcl-2表達減少，恰好證實了這一過程。整合以上實驗結果，筆者提出關于Res、ROS及JNK通路之間關系的猜想，即Res可能通過誘導腫瘤細胞ROS堆積使細胞發生氧化應激，進而激活JNK通路，引起細胞凋亡。

綜上所述，本實驗結果顯示，白藜蘆醇可進入細胞質及細胞核，但駐留時間很短。較低濃度的白藜蘆醇即對大鼠膠質瘤細胞C6有較強的增殖抑制和促凋亡作用，并首次發現白藜蘆醇可能通過誘導C6細胞內ROS堆積，激活JNK通路，誘導細胞凋亡。當然，對于白藜蘆醇的抗腫瘤機制的研究，仍有待于進一步完善。后續可加設抗氧化劑NAC組以及氧化劑H2O2組，觀察C6細胞增殖情況、凋亡情況的變化等，或者沉默JNK，觀察Res處理后C6細胞的凋亡情況以及相關凋亡蛋白的表達情況，以更充分地論證Res對C6膠質瘤細胞系的促氧化作用誘導JNK通路激活，促使細胞凋亡的發生。