3D打印可控式張力帶技術(shù)通過刺激表皮生長和新血管形成來促進(jìn)皮膚再生

買合木提·亞庫甫 劉 旭 陳洪濤

皮膚常因急性或慢性傷口而受損，如大面積燒傷、外傷等引起的損傷。這些損傷不僅破壞了皮膚的屏障功能，還改變了對(duì)溫度、疼痛和觸摸的感覺[1]。雖然大多數(shù)皮膚缺損可以自然愈合，但是成人皮膚傷口的愈合是一個(gè)復(fù)雜的過程，需要許多不同組織和細(xì)胞的共同參與，一些急、慢性皮膚損傷仍需要住院治療[2，3]。大量證據(jù)表明，通過加速傷口愈合過程，可以促進(jìn)皮膚的再生[4～6]。因此，尋找一種有效的方法促進(jìn)皮膚再生，恢復(fù)受損皮膚的功能是一個(gè)迫切的要求。

近年來，3D打印技術(shù)作為一種新興技術(shù)，從最初被用作手術(shù)前的可視化模型和工具模型，到目前已開始應(yīng)用于組織工程、診斷平臺(tái)、支架、藥物發(fā)現(xiàn)和毒理學(xué)中[7]。大量研究發(fā)現(xiàn)，3D打印技術(shù)可以作為一種仿生支架，可以促進(jìn)軟骨修復(fù)、心臟修復(fù)、傷口愈合和皮膚再生等[8～11]。雖然傳統(tǒng)的3D打印技術(shù)在傷口修復(fù)和皮膚再生方面的應(yīng)用已經(jīng)取得了很大的進(jìn)展，但是張力帶的布置方法和張力大小對(duì)創(chuàng)緣皮膚的增殖和再生并不清楚。因此，探究新型3D打印可控式張力帶技術(shù)作為一種新的方法在創(chuàng)面愈合和皮膚再生中的規(guī)律和作用機(jī)制值得進(jìn)一步研究。

本研究討論了新型3D打印可控式張力帶技術(shù)在皮膚缺損治療中的作用，并探討了不同張力大小對(duì)創(chuàng)面愈合過程和皮膚再生的影響，闡明了其作用規(guī)律和機(jī)制，為臨床應(yīng)用提供理論支持。

材料與方法

1.材料：60只雄性新西蘭大白兔購自新疆醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心；Panowin-F3000 打印機(jī)購自上海磐紋科技有限公司；戊巴比妥鈉購自武漢力博瑞生物科技有限公司；慶大霉素購自北京索萊寶科技有限公司；甲醛購自國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；胃蛋白酶購自上海生工生物工程有限公司；pan-cytokeratin、CD31和VEGF單克隆抗體、山羊抗兔二抗購自美國Abcam公司。

2.構(gòu)建皮膚缺損動(dòng)物模型：選用6月齡、體質(zhì)量2～3kg的新西蘭大耳白兔頭部制備動(dòng)物模型，因?yàn)轭^部皮膚位置相對(duì)固定，避免了實(shí)驗(yàn)過程中張力帶周圍皮膚被牽扯過來。術(shù)前對(duì)兔進(jìn)行體溫和體重檢測(cè)，將戊巴比妥鈉按25mg/kg于耳緣靜脈注射進(jìn)行全身麻醉，麻醉顯效后，進(jìn)行常規(guī)消毒手術(shù)區(qū)，鋪無菌巾，將兔固定在操作臺(tái)上，用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為8%的硫化鈉對(duì)兔頭進(jìn)行脫毛，自兩耳根后緣連線間，橫向切開長約2.5cm皮膚切口，切開皮膚及皮下組織，血管鉗向前鈍性分離頭部皮膚與顴骨骨膜的疏松附著，分離范圍為兩側(cè)近眶骨上緣1cm，前部距鼻翼2cm處。手術(shù)后立即肌肉注射慶大霉素80000單位，連續(xù)注射3天。

3.構(gòu)建3D打印可控式張力帶和滑輪裝置：通過UG、3-Matic等三維數(shù)據(jù)處理軟件設(shè)計(jì)可控式張力帶和滑輪裝置并建模，優(yōu)化數(shù)據(jù)，輸出三維打印設(shè)備可識(shí)別的標(biāo)準(zhǔn)模板庫STL文件，將STL文件導(dǎo)入3D打印機(jī)，將3D打印材料先在一個(gè)平面內(nèi)(x，y)鋪一層材料，z軸向上移動(dòng)一個(gè)單位(為3D打印設(shè)備設(shè)定的適配參數(shù))后重復(fù)上一操作。在計(jì)算機(jī)設(shè)置中可以設(shè)置打印機(jī)的速度、打印密度以調(diào)節(jié)快速成型模型的各項(xiàng)特征，即可初步構(gòu)建出可控式張力帶和滑輪裝置的制備。

4.皮膚損傷動(dòng)物的分組治療：將模型動(dòng)物隨機(jī)分為4組治療：①正常對(duì)照組(A組)：不植入可控式張力帶和滑輪裝置；②無張力帶組(B組)：植入可控式張力帶和滑輪裝置，但不及硅膠袢張力；③常規(guī)張力帶組(C組)：植入可控式張力帶和滑輪裝置，每日牽拉1次，每次牽拉力量使硅膠袢直徑變細(xì)至原先的2/3；④快速張力帶組(D組)：植入可控式張力帶和滑輪裝置，每日牽拉1次，每次牽拉力量使硅膠袢直徑變細(xì)至原先的1/2。硅膠袢直徑越細(xì)，牽拉力越大，張力帶速度越快。

5.皮膚創(chuàng)面愈合檢測(cè)：分別于手術(shù)后3、7和14天時(shí)間點(diǎn)觀察傷口變化，是否結(jié)痂，有無感染，用游標(biāo)卡尺測(cè)量各組創(chuàng)面面積，計(jì)算創(chuàng)面收縮率。創(chuàng)面收縮率(%)=(原創(chuàng)面面積-檢測(cè)時(shí)創(chuàng)面面積)/原創(chuàng)面面積×100%。

6.標(biāo)本的采集與處理：在手術(shù)后14天測(cè)量完創(chuàng)面收縮面積后，采集新西蘭大耳白兔頭部缺損皮膚組織。采集時(shí)需修剪其表面毛發(fā)，全身麻醉情況下于相鄰滑輪裝置連線外1cm處切取1cm×1cm大小的全層皮膚組織塊。并將切取的組織塊標(biāo)本放入10%的甲醛溶液中固定，常規(guī)脫水、透明、浸蠟、包埋，制成連續(xù)切片(厚度5mm)。

7.HE染色檢測(cè)各組小鼠皮膚組織病理變化：將標(biāo)本用蒸餾水清洗，蘇木精染色(60℃)30～60s，流水洗去蘇木精，1%鹽酸乙醇浸潤1～3s，流水洗，促藍(lán)液返藍(lán)5～10s，流水洗15～30s，0.5%伊紅染色30～60s，蒸餾水洗1～2s，80%、95%和100%乙醇梯度脫水，每步1～2s，二甲苯浸泡3次，中性樹脂封片。封片后于顯微鏡下拍照，觀察組織病理變化。

8.免疫組織化學(xué)染色檢測(cè)皮膚組織中pan-cytokeratin、CD31和VEGF的表達(dá)：將制備好的皮膚組織標(biāo)本與0.4%胃蛋白酶在5mm HCl中37℃孵育20min，提取抗原。用3%過氧化氫在甲醇中孵育5min，阻斷內(nèi)源性過氧化物酶；用2%牛血清蛋白孵育，阻斷非特異性蛋白結(jié)合。用一抗(兔抗pan-cytokeratin、CD31和VEGF均為1∶1000稀釋比)在4℃孵育過夜后，切片在室溫條件下與山羊抗兔二抗孵育2h。采用Te DAB基片系統(tǒng)進(jìn)行顯色。最后，用蘇木精染色封片進(jìn)行拍照。

9.統(tǒng)計(jì)學(xué)方法：采用SPSS 18.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。所有的值都記錄為至少3個(gè)獨(dú)立實(shí)驗(yàn)的平均SEM。采用雙尾t檢驗(yàn)來評(píng)價(jià)各組間的差異，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1.3D打印可控式張力帶和滑輪裝置：通過UG、3-Matic等三維數(shù)據(jù)處理軟件設(shè)計(jì)可控式張力帶和滑輪裝置見圖1。包括滑輪裝置模型圖(圖1A、B)；3D打印模塊圖(圖1C、D)；3D打印滑輪裝置動(dòng)物實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ蛨D，藍(lán)色區(qū)域代表皮膚缺損，藍(lán)色線代表硅膠袢，藍(lán)色線的接觸點(diǎn)代表滑輪裝置(圖1E)；3D打印滑輪裝置動(dòng)物實(shí)驗(yàn)?zāi)M圖，藍(lán)色模塊代表可控式張力帶裝置的滑輪裝置，安裝在皮膚缺損周圍，此時(shí)皮膚缺損動(dòng)物模型中未安裝硅膠袢(圖1F)。

圖1 3D打印可控式張力帶和滑輪裝置示意圖

2.各組實(shí)驗(yàn)兔體溫變化：4組動(dòng)物的體溫變化見表1，在植入3D打印可控式張力帶裝置手術(shù)前后，實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組比較，動(dòng)物的體溫變化差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，說明3D打印可控式張力帶裝置不會(huì)對(duì)動(dòng)物的創(chuàng)面皮膚造成感染。

表1 各組動(dòng)物體溫變化

3.各組實(shí)驗(yàn)兔體質(zhì)量變化：4組動(dòng)物的體質(zhì)量變化見表2，手術(shù)前后對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組體質(zhì)量變化較小，其中植入張力大小不同的裝置各組間比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，說明無論是植入無張力帶裝置，還是常規(guī)張力帶和快速張力帶裝置，對(duì)動(dòng)物的正常生長都無明顯影響。

表2 各組動(dòng)物體質(zhì)量變化

4.創(chuàng)面愈合觀察：皮膚缺損模型大白兔植入3D可控式張力帶裝置術(shù)后于3、7和14天時(shí)檢測(cè)創(chuàng)面愈合情況見表3。對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組創(chuàng)面均有少量液體滲出，對(duì)有少部分感染。術(shù)后3天時(shí)，與對(duì)照組比較，無張力帶組的創(chuàng)面收縮差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，常規(guī)張力帶組和快速張力帶組顯著增加了創(chuàng)面收縮面積，色澤紅潤；術(shù)后7天時(shí)，張力帶組的創(chuàng)面收縮面積與對(duì)照組比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，而常規(guī)張力帶組和快速張力帶組創(chuàng)面明顯縮小且干燥，創(chuàng)口有結(jié)痂；術(shù)后14天時(shí)，常規(guī)張力帶組和快速張力帶組創(chuàng)傷部位干燥，基本愈合且新生表皮光滑有彈性，而對(duì)照組和無張力帶組創(chuàng)面結(jié)痂緩慢，未完全愈合且觸感粗糙。4組動(dòng)物術(shù)后創(chuàng)面收縮率由高到低依次是常規(guī)張力帶組、快速張力帶組、無張力帶組和對(duì)照組(P<0.05)。因此，適當(dāng)大小張力的3D可控式張力帶裝置可以促進(jìn)創(chuàng)面愈合和皮膚再生，其中常規(guī)張力帶組創(chuàng)面收縮率最大、愈合最快且創(chuàng)口最平滑。

表3 術(shù)后創(chuàng)面收縮率

5.3D打印可控式張力帶裝置對(duì)皮膚組織病理變化影響：HE染色結(jié)果顯示，術(shù)后7天，4組全層皮膚均可見炎性細(xì)胞，均有炎性反應(yīng)(圖2)。與對(duì)照組比較，無張力帶組、常規(guī)張力帶組和快速張力帶組全層皮膚的膠原纖維、炎性細(xì)胞均未明顯變化，表皮表面均趨于均勻。

圖2 術(shù)后7天大白兔皮膚組織病理學(xué)觀察(HE，×200)

6.3D打印可控式張力帶裝置對(duì)皮膚表皮生長的影響：為進(jìn)一步探究皮膚缺損后張力大小不同的3D打印可控式張力帶裝置促進(jìn)創(chuàng)面愈合和皮膚再生的機(jī)制,筆者使用pan-cytokeratin抗體對(duì)術(shù)后7天全層皮膚組織進(jìn)行染色(棕色為陽性細(xì)胞)。與對(duì)照組比較，無張力帶組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,常規(guī)張力帶組和快速張力帶組均表現(xiàn)為表皮厚度增加，但是常規(guī)張力組的表皮厚度要遠(yuǎn)多于快速張力帶組(圖3)。

圖3 術(shù)后7天大白兔皮膚表皮厚度變化(免疫組化,×200)

7.3D打印可控式張力帶裝置對(duì)皮膚新血管形成的影響：為進(jìn)一步鑒定張力大小不同的3D打印可控式張力帶置對(duì)全層皮膚的血管形成的影響，采用組織切片免疫組織化學(xué)分析CD31和VEGF在術(shù)后7天的表達(dá)水平，以此來檢測(cè)各組血管新生情況。免疫組化結(jié)果顯示，CD31和VEGF主要表達(dá)在胞質(zhì)內(nèi)(圖4A、B)，為棕黃色顆粒，與對(duì)照組比較，無張力帶組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，常規(guī)張力帶組和快速張力帶組中CD31和VEGF蛋白表達(dá)均上升，其中常規(guī)張力帶組的CD31和VEGF表達(dá)水平高于快速張力帶組(圖4C、D)。因此，適當(dāng)大小張力的3D打印可控式張力帶裝置上調(diào)了全層皮膚中CD31和VEGF蛋白表達(dá)，其中常規(guī)張力帶組最顯著，進(jìn)一步促進(jìn)了全層皮膚中新血管的形成。

圖4 術(shù)后7天大白兔皮膚免疫組織化學(xué)染色及結(jié)果分析圖

討 論

皮膚是一個(gè)復(fù)雜的器官，是抵御外部損傷因子的第一道屏障[12]。作為人體最大的器官，皮膚容易受到各種損傷，損傷發(fā)生后，必須盡快重建其結(jié)構(gòu)和功能[13]。嚴(yán)重的皮膚損傷可能會(huì)危及生命。皮膚再生和傷口愈合是一個(gè)復(fù)雜的過程，需要一個(gè)復(fù)雜的生物和分子事件的協(xié)調(diào)整合，包括炎癥、增殖和重塑[14]。目前使用廣泛的傷口敷料、藥膏和醫(yī)療設(shè)備來治療皮膚缺損，但創(chuàng)面愈合仍然是一項(xiàng)艱巨的臨床挑戰(zhàn)。盡管國內(nèi)外許多研究者對(duì)創(chuàng)面愈合和皮膚再生有不少的報(bào)道，但其機(jī)制尚未有明確的定論。因此，提供一種促進(jìn)創(chuàng)面愈合和皮膚再生的技術(shù)并明確其作用機(jī)制顯得格外重要。

對(duì)于創(chuàng)面的修復(fù)和愈合，傳統(tǒng)采用的是“綁鞋帶技術(shù)”，但此技術(shù)是靜態(tài)張力裝置，創(chuàng)面愈合時(shí)間相對(duì)較慢[15～17]。傳統(tǒng)“綁鞋帶技術(shù)”的局限性推動(dòng)了3D打印技術(shù)的發(fā)展。3D打印是一種新興的技術(shù)，在皮膚組織的制劑開發(fā)、臨床移植、醫(yī)學(xué)檢測(cè)以及基礎(chǔ)研究等方面具有潛在的幫助作用[18～20]。有研究表明，3D打印技術(shù)在復(fù)雜的面部傷口上，可以促進(jìn)表皮和真皮層的皮膚組織再生[10,21]。

本研究探討了新型的3D打印可控式張力帶技術(shù)對(duì)皮膚缺損動(dòng)物模型中創(chuàng)面愈合和皮膚再生的影響及其機(jī)制。從體溫和體重結(jié)果顯示，植入3D打印可控式張力帶裝置并不會(huì)對(duì)模型動(dòng)物的創(chuàng)面感染和動(dòng)物生長有顯著影響，同時(shí)通過對(duì)4組動(dòng)物的創(chuàng)面愈合觀察和創(chuàng)面收縮率分析顯示，植入3D打印可控式張力帶裝置各組在術(shù)后3、7和14天時(shí)與對(duì)照組比較，無張力帶組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，而常規(guī)張力帶組和快速張力帶組的創(chuàng)傷部位干燥，結(jié)痂和愈合速度快且新生表皮光滑有彈性，色澤紅潤，其中常規(guī)張力帶組創(chuàng)面愈合收縮率顯著高于快速張力帶組。這些結(jié)果表明，改變3D打印裝置的張力大小可以加速創(chuàng)面愈合效率和皮膚再生，且常規(guī)張力帶組效率最高。從HE染色圖來看，術(shù)后7天時(shí)，各組均有炎性反應(yīng)，創(chuàng)面周圍全層皮膚可見炎性細(xì)胞。炎性細(xì)胞的浸潤是創(chuàng)傷愈合初期創(chuàng)面及周圍全層皮膚的一種炎性反應(yīng)，與對(duì)照組比較，無張力帶組、常規(guī)張力帶組和快速張力帶組的全層皮膚表皮均趨于均勻，未見明顯的組織病理學(xué)變化[22]。因此，適當(dāng)大小張力的3D打印裝置對(duì)創(chuàng)傷周圍全層皮膚無顯著病理學(xué)改變。

有研究表明，創(chuàng)面愈合和皮膚再生與張力強(qiáng)度有關(guān)[23]。Xiong 等[5]研究者發(fā)現(xiàn)刺激表皮生長和血管形成可以促進(jìn)皮膚再生。為了進(jìn)一步探究3D打印裝置促進(jìn)創(chuàng)面愈合和皮膚再生的分子機(jī)制，筆者通過免疫組織化學(xué)染色分析pan-cytokeratin、CD31和VEGF的表達(dá)。pan-cytokeratin是構(gòu)成生皮表皮、毛皮毛囊的主要蛋白質(zhì)，有助于傷口愈合和皮膚再生[10]。CD31是血小板-內(nèi)皮細(xì)胞黏附分子，通常位于血管內(nèi)皮細(xì)胞、血小板和中性粒細(xì)胞等細(xì)胞，可以被招募到組織損傷部位并直接促進(jìn)血管生成[24]。VEGF是血管內(nèi)皮生長因子，具有促進(jìn)血管通透性、血管增殖和形成的作用[25～27]。本研究結(jié)果表明，在術(shù)后7天時(shí)，與對(duì)照組比較，無張力帶組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，常規(guī)張力帶組和快速張力帶組增加了表皮厚度，上調(diào)了CD31和VEGF的表達(dá)，并且常規(guī)張力帶組的變化顯著于快速張力帶組。因此，3D打印可控式張力帶裝置通過調(diào)整張力大小可以促進(jìn)表皮生長，通過上調(diào)CD31和VEGF的表達(dá)促進(jìn)血管的形成，其中常規(guī)張力大小最為適合，進(jìn)而對(duì)創(chuàng)面愈合和皮膚再生起到關(guān)鍵的推動(dòng)作用。

綜上所述，3D打印可控式張力帶技術(shù)可以通過控制張力大小促進(jìn)皮膚缺損動(dòng)物模型中創(chuàng)面愈合和表皮生長，上調(diào)CD31和VEGF的表達(dá)促進(jìn)了新血管的形成，進(jìn)而促進(jìn)了皮膚的再生。其中常規(guī)張力帶組的創(chuàng)面愈合速率、表皮生長和血管形成最顯著。本研究為采用3D打印技術(shù)修復(fù)皮膚缺損臨床應(yīng)用提供了科學(xué)依據(jù)。