乳腺癌患者血漿EDA片段拷貝數變化的臨床意義

李涌濤 劉雨雄 張晨光 蔣威華 許文婷 歐江華

復發和轉移是導致乳腺癌患者預后較差的主要原因[1～4]。現有研究顯示，纖維連接蛋白(fibronectin, FN)是細胞外基質的重要組成成分，通過上皮-間質遷移，在改變細胞與周圍基質的黏附能力中扮演重要角色。其中纖維連接蛋白EDA片段與腫瘤的生長和轉移密切相關[5]。外周血標本留取相對無創且可多次留取，在臨床工作中優勢明顯[6]。筆者對乳腺癌患者外周血漿的EDA片段基因的拷貝數進行檢測，結合患者的預后進行了研究，現報道如下。

資料與方法

1.研究對象:選取筆者醫院2014年1～12月行手術的乳腺癌患者，同時選擇同時期行手術的良性乳腺病患者。所有入選患者均留取了外周血標本，且均簽署標本留取知情同意書。最后研究組入選98例患者，對照組選擇100例病理為乳腺腺病的患者。患者均為女性，乳腺癌組患者中位年齡46歲(28～67歲)，其中，漢族70例，維吾爾族25例，哈薩克族3例；無淋巴結轉移13例，有淋巴結轉移85例。

2.納入標準：研究組均有明確的浸潤性乳腺癌病理診斷，手術時無遠處轉移，未進行術前化療，非妊娠、哺乳期患者，且臨床病理及隨訪資料完整；對照組病理結果為良性病變，且留取外周血標本。排除標準：炎性乳腺癌，乳腺癌患者在治療中出現遠處轉移，在治療后及隨訪中乳腺癌患者外周血標本留取不全。

3.乳腺癌患者隨訪情況：所有乳腺癌患者術后均行輔助化療，依據治療指南繼續行后續放療、內分泌等綜合治療。所有乳腺癌患者在化療結束時均未發現復發或遠處轉移。隨訪患者5年，其中28例患者出現復發或轉移。3例患者胸壁或區域淋巴結局部復發，6例單純骨轉移，5例肝轉移，7例肺轉移，1例腦轉移，1例區域淋巴結復發及骨轉移，5例多臟器轉移。

4.標本留取：所有患者均在手術前抽取外周血，加入抗凝管中，經離心后分離上層血漿，置于-80℃冰箱保存。乳腺癌患者在化療結束后再次抽取外周血離心后留取標本。隨訪過程中發現復發或轉移時再次抽取外周血離心后留取標本。未發現復發或轉移患者在隨訪5年時抽取外周血離心后留取標本。

5.研究方法：對標本進行DNA提取，采用美國Omega基因組DNA提取試劑盒。采用AccuCopyTM多重基因拷貝數檢測試劑盒進行PCR擴增：取2μl DNA模板與2μl內對照DNA混合液混勻后，加入10μl 2× PCR Master Mix, 1μl多重PCR引物混合液以及5μl ddH2O。PCR循環程序：95℃ 10min; 11cycles×(94℃ 20s,65℃ 40s,72℃ 1min 30s);24cycles×(94℃ 20s, 59℃ 30s, 72℃ 1.5min); 60℃ 60min; 4℃ for ever。取1μl PCR產物稀釋20倍后，取1μl與0.5μl Liz500 SIZE STANDARD，8.5μl Hi-Di 混勻，95℃變性5min后上ABI3130XL測序儀。根據每個基因的樣本DNA/內對照DNA擴增產物長度及熒光標記信息，利用GeneMapper4.0對ABI3130XL測序儀生成的數據文件進行分析，輸出每個產物峰的峰高以及峰面積。輸出結果采用EXCEL進行整理、統計和分析。

6.拷貝數確定：取一定量的DNA片段混合物，然后與適量的樣本DNA混合，進行PCR擴增，產物經毛細管電泳后，對(樣本DNA與競爭DNA)擴增產物根據其長度差異進行分離，分析每個基因片段的S/I(峰面積比)值，利用參照基因S/I值對目標基因S/I值進行校正后獲取目標基因的準確拷貝數(圖1)。拷貝數取整數，筆者將拷貝數>2確定為多拷貝。

圖1 采用AccuCopyTM多重基因拷貝數檢測的不同拷貝數結果判讀圖

7.統計學方法：采用SPSS 19.0統計學軟件對數據進行統計分析，計數資料采用例數(百分比)[n(%)]表示，不同組間比較采用χ2檢驗，以P<0.05為差異有統計學意義。

結 果

1.乳腺癌與良性患者外周血EDA片段拷貝數檢測結果：98例初診乳腺癌患者的血漿標本纖維連接蛋白EDA片段拷貝數檢測，結果39.8%(39/98)的患者檢測到EDA片段多拷貝。而在同期留取的100例病理為乳腺腺病患者血漿標本中，僅有2.0%(2/100)檢測到EDA片段多拷貝，兩組患者比較，外周血漿中纖維連接蛋白EDA片段多拷貝乳腺癌患者明顯高于良性乳腺疾病患者，差異有統計學意義(χ2=43.062，P=0.000,表1)。

表1 乳腺腺病與乳腺癌患者血漿EDA片段拷貝數結果比較[n(%)]

2.乳腺癌患者治療前后血漿纖維連接蛋白EDA片段拷貝數檢測：乳腺癌患者手術前及手術+化療治療后留取外周血漿標本，治療前39.8%(39/98)的患者檢測到EDA片段多拷貝，治療后18.4%(18/98)的患者檢測到EDA片段多拷貝，兩組比較，乳腺癌患者外周血漿中纖維連接蛋白EDA片段多拷貝在治療前后有明顯變化，差異有統計學意義(χ2=10.91，P=0.001,表2)。

表2 治療前后乳腺癌患者EDA片段多拷貝結果比較[n(%)]

3.不同血漿纖維連接蛋白EDA片段拷貝數的乳腺癌患者結局情況：98例患者中28例出現復發或轉移。治療前39例患者檢測到血漿EDA片段多拷貝，41.0%(16/39)的患者出現復發或轉移；59例未檢測到血漿EDA片段多拷貝的患者中僅有20.3%(12/59)的患者出現復發或轉移，兩組比較，治療前乳腺癌患者外周血檢測到EDA片段多拷貝，其出現復發轉移的風險明顯升高，差異有統計學意義(χ2=4.923，P=0.026,表3)。

表3 患者血漿EDA片段多拷貝與乳腺癌復發轉移結局比較[n(%)]

4.血漿纖維連接蛋白EDA片段拷貝數變化在不同乳腺癌患者結局中的比較：隨訪患者5年，14例患者從EDA片段多拷貝未檢測到變為檢測到，57.1%(8/14)的患者結局為復發或轉移；而在EDA片段多拷貝一直未檢測到45例患者，僅8.9%(4/45)出現復發或轉移，兩組比較差異有統計學意義(χ2=15.345，P=0.000,表4)。9例患者從EDA片段多拷貝變為未檢測到，隨訪5年未發現復發或轉移，EDA片段呈持續多拷貝狀態的30例患者，53.3%(16/30)結局為復發或轉移，兩組比較差異有統計學意義(χ2=8.139，P=0.004,表4)。

表4 乳腺癌患者血漿EDA片段拷貝數變化在不同結局中的比較[n(%)]

討 論

乳腺癌發生率呈逐年升高趨勢，已成為女性發生率首位的惡性腫瘤[7]。復發轉移是導致乳腺癌患者死亡的主要原因[8]。其中纖維連接蛋白EDA片段在腫瘤細胞的黏附、遷移、增殖以及腫瘤生長中扮演了重要角色。EDA片段通過加強纖維連接蛋白與整合素的結合而促進腫瘤細胞的黏附和轉移，通過增加平滑肌肌動蛋白的合成而增強腫瘤細胞自身的運動能力，還可通過Ras-MAPK/ERK途徑增強細胞的DNA合成，促進細胞周期進展，導致細胞分裂增殖[9～11]。還有相關研究顯示EDA片段可促進腫瘤淋巴管及血管的形成，從而促進腫瘤的轉移[12，13]。這些都提示纖維連接蛋白EDA片段可以作為一個更好的檢測指標來輔助診斷和預測乳腺癌轉移。通過對EDA片段拷貝數檢測，能較好地反映該基因片段功能，更好地反映其在腫瘤生長轉移中的作用，因此筆者對不同預后的乳腺癌患者EDA片段拷貝數進行檢測，有一定的臨床意義。

EDA 片段序列高度保守，位于人類2號染色體外顯子5431～5701bp處。EDA片段在正常人血漿中含量很低或無法檢測到, 而在癌癥患者的血液樣本中EDA +FN含量可顯著升高[14，15]。相關研究顯示，結腸癌患者腫瘤組織與血清中的EDA水平明顯增加[16]。因此筆者檢測乳腺癌患者血漿中纖維連接蛋白EDA片段的拷貝數變化，結果在39%的乳腺癌患者血漿標本中檢測到EDA片段多拷貝，顯著高于僅有2%檢測到EDA片段多拷貝的同期良性乳腺疾病患者，這也與現有的相關研究結果相一致。顯示了血漿EDA片段拷貝數可以作為乳腺癌的一個更好輔助診斷檢測指標。

外周血漿液體標本相對于組織標本，檢測的損傷小，穩定性好，便于留取，同時可以多次留取進行動態觀察[17]。因此本研究選擇患者血漿標本進行研究。有關血漿中EDA片段拷貝數檢測的研究鮮見，通過研究發現，在治療前39.8%的患者中檢測到EDA片段多拷貝，治療后變為18.4%，也就是乳腺癌患者外周血漿中纖維連接蛋白EDA片段多拷貝在治療前后有明顯降低，兩組比較差異有統計學意義(P=0.001)。同時隨訪中，有9例患者從EDA片段多拷貝變為未檢測到，隨訪5年未發現復發或轉移，而EDA片段呈持續多拷貝狀態患者，有53.3%(16/30)結局為復發或轉移，兩組比較差異有統計學意義(P=0.004)。這也顯示了血漿EDA片段拷貝數可以作為一個乳腺癌治療效果參考的檢測指標。

相關研究發現,EDA片段在腫瘤轉移中扮演重要角色，在乳腺癌的發生、發展中，EDA片段可通過EMT促進腫瘤細胞的黏附和遷移[18]。筆者通過研究發現，在治療前檢測到血漿EDA片段多拷貝，41%的患者結局為復發或轉移。而在EDA片段一直未檢測到的患者中，僅20.3%出現復發或轉移。腫瘤生長必需有血管為之提供氧及營養物質。研究發現，EDA片段在腫瘤血管形成過程中有一定作用[19]。那么動態觀察血漿EDA片段拷貝數，發現乳腺癌及隨后的過程中EDA片段呈持續多拷貝狀態的患者，53.3%的患者結局為復發或轉移。從EDA片段多拷貝未檢測到變為檢測到，57.1%的患者出現復發或轉移。結合相關研究，動態監測血漿EDA片段拷貝數，可以作為乳腺癌復發或轉移的輔助預測指標，同時對復發風險高的患者的后續加強治療提供參考價值[20]。

綜上所述，通過對乳腺癌患者纖維連接蛋白EDA片段拷貝數檢測，筆者發現外周血漿液體標本留取方便，可多次留取進行動態觀察。外周血漿EDA片段多拷貝在乳腺癌患者中顯著高于良性乳腺疾病患者，提示EDA拷貝數檢測可以作為診斷乳腺癌的一個輔助診斷檢測指標。動態監測發現，呈持續EDA多拷貝及從未檢測到變為后期隨訪又檢測到EDA多拷貝的患者，50%的結局為復發或轉移，顯示了血漿EDA片段拷貝數檢測可以作為預測患者預后的輔助檢測指標，可以在今后的臨床工作中提供一種無創的手段來進行乳腺癌的診斷與預后的評估。