CDK4與PD-L1在結直腸癌組織中的表達及相關性分析

王彩瑩 高成英 李長天

結直腸癌(colorectal cancer，CRC)是最常見的消化道惡性腫瘤之一。2018年，Freddie等[1]在《臨床醫師癌癥》雜志在線發表全球癌癥統計，對185個國家36種癌癥的發生率和病死率進行了推算，結直腸癌的發生率(6.1%)排名第4位，次于肺癌(11.6%)、乳腺癌(11.6%)、前列腺癌(7.1%)，病死率(9.2%)排名第2位，僅次于肺癌(18.4%)。估計2018年將發生180多萬例新的結直腸癌病例和88.1萬例死亡病例。

在結直腸癌的分子水平，細胞周期失調似乎是癌癥進展的一個關鍵因素，而細胞周期素依賴激酶(cyclin-dependent kinase，CDK)是細胞周期的核心因素。所以，針對CDK4/6的靶向治療是一種重新控制細胞周期的方案。近年來，CDK4抑制劑聯合免疫檢查點抑制劑治療癌癥為抗癌治療提出了新的治療方向。因此本研究通過檢測CDK4、程序性細胞死亡蛋白配體1(programmeddeath ligand 1,PD-L1)在結直腸癌組織中的表達情況，探討其與結直腸癌發生、發展和臨床病理特征的關系，進而探討CDK4與PD-L1的相關性，為CDK4抑制劑與PD-L1抑制劑的聯合治療提供參考。

資料與方法

1.一般資料:收集中國人民解放軍聯勤保障部隊第九四零醫院2013～2017年的結直腸癌病理組織標本120例，癌旁組織40例。所有納入患者均經病理學證實為結直腸腺癌。將160例組織做成組織芯片，通過HE染色在鏡下逐一進行病理診斷，鏡下排除結直腸癌組的5例脂肪組織。115例結直腸癌患者術前均未接受放療、化療，其中男性75例，女性40例。切除時患者年齡26～85歲，<60歲者56例，≥60歲者59例。腫瘤直徑<5cm者61例，≥5cm者54例。結腸癌56例(其中左半結腸癌33例，右半結腸癌23例)，直腸癌59例。高分化腺癌21例，中分化腺癌69例，低分化腺癌25例。其中，病理分型中含黏液有13例，不含黏液102例。有淋巴結轉移45例，無淋巴結轉移70例，浸潤深度T1+T2期27 例，T3+T4期88例。

2.組織芯片制作：數據庫中挑選確診為結直腸癌的患者的石蠟標本，鏡下標記切片上癌的區域，根據切片標記蠟塊，利用組織芯片儀制作空白蠟塊，同時將做好標記的供體蠟塊孔芯轉移到受體蠟塊，每個蠟塊6×7點組織陣列，含42個位點，第一排第1個與最后一排倒數第2個不插入組織，用于定位(圖1、圖2)。制作結直腸癌組織芯片蠟塊4個，共160例(本實驗組織芯片鏡下排除5例脂肪組織)。

圖1 組織芯片蠟塊

圖2 組織芯片切片

3.染色：將組織芯片以4μm厚度切片，60℃烤制3h，常規脫水脫蠟，EDTA高溫高壓修復3min，3%過氧化氫37℃下封閉10min，滴加一抗靜置于37℃烤箱2h，滴加二抗室溫靜置20min，DAB顯色，蘇木精復染細胞核，1%鹽酸乙醇分化，氨水返藍，最后不同濃度梯度乙醇脫水，吹干，二甲苯透明，中性樹膠封片。免疫組化采用Max Vision二步法。兔抗人CDK4單克隆抗體、兔抗PD-L1抗體、快捷型酶標羊抗鼠/兔IgG聚合物均購自福州邁新生物技術開發有限公司。

4.結果判讀：CDK4陽性染色主要定位于細胞核，免疫組化染色結果的判斷采取半定量法進行評分，標準由兩部分構成，即a(細胞核著色的強度)和b(陽性細胞所占腫瘤細胞的比例)組成。a：0分為不著色，1分為著色弱(淡黃色)，2 分為中等著色(黃色)，3 分為強著色(棕黃色)；b：陽性細胞所占比例<5%為0分，陽性細胞所占比例在5%～25%為1分，陽性細胞所占比例在26%～50%為2分，陽性細胞所占比例在51%～75%為3分，陽性細胞所占比例>75%為4分。a×b之積等于0分者為表達陰性，記錄成免疫組織化學反應(-)，1～4分判斷為弱陽性(+)，5～8分判斷為中度陽性(++)，9～12分判斷為強陽性(+++)。實驗結果以評分為0分定義為陰性(-)，>0分統一定義為陽性(+)。

PD-L1陽性染色定位于腫瘤細胞的細胞膜，陽性表達即呈棕黃色或棕褐色顆粒，借鑒肺癌組織中的腫瘤比例評分(tumer proportion score，TPS)，即腫瘤陽性細胞占腫瘤細胞總數的百分比。染色結果可分為3組，即<1%為陰性，1%～49%為弱陽性，≥50%為陽性。本研究采用SP142抗體屬于通用性型抗體，且在結直腸癌中仍無對PD-L1有標準的檢測方法及評分標準，采用1%的cut off值來界定判斷其表達情況，即TPS≥1%的腫瘤均為表達陽性；否則為陰性[2]。

5.統計學方法：應用SPSS 18.0統計學軟件對數據進行統計分析。CDK4、PD-L1的表達與結直腸腺癌臨床病理特征的關系采用χ2檢驗；CDK4與PD-L1表達的相關性的采用Spearman秩相關性檢驗，以P<0.05為差異有統計學意義。

結 果

1.CDK4的表達與結直腸腺癌患者臨床病理特征的關系:CDK4在結直腸癌組織中的表達明顯高于癌旁組織，陽性率分別為43.5%(50/115)和7.5%(3/40)，差異有統計學意義(P<0.01,表1、圖3A、B)。CDK4在含黏液組與不含黏液組表達的陽性率分別為15.4%(2/13)和47.1%(48/102)，在淋巴結轉移組與淋巴結未轉移組的陽性率分別為55.6%(25/45)和33.3%(25/70)，差異有統計學意義(P<0.05)，提示 CDK4 蛋白與淋巴結轉移呈正相關，且在含黏液的組織學類型中表達更多。不同性別、年齡、分化程度、腫瘤直徑及腫瘤部位CDK4的陽性表達率比較，差異均無統計學意義(P>0.05，表2)。

表1 CDK4在結直腸腺癌和癌旁組織中的表達

圖3 CDK4和PD-L1在低分化腺癌組織中的表達(Max Vision二步法)

2.PD-L1的表達與結直腸腺癌患者臨床病理特征的關系：PD-L1在結直腸腺癌組織和癌旁組織中的陽性率為33.0%(38/115)和0(0/40)，在腺癌組織中的表達明顯高于癌旁組織，差異有統計學意義(P<0.01，表3、圖3C、D)。PD-L1在低、中、高分化組表達的陽性率分別為52.0%(13/25)、30.0%(21/69)和19.0%(4/21)，差異有統計學意義(P<0.05)；在淋巴結轉移組與無淋巴結轉移組的陽性率分別為55.6%(20/45)和25.7%(18/70)，差異有統計學意義(P<0.05)，PD-L1蛋白與組織分化程度呈負相關，分化越高，PD-L1表達越少，且與淋巴結轉移呈正相關(表2)。

表2 PD-L1和CDK4表達與結直腸腺癌臨床病理特征的關系

表3 PD-L1在結直腸腺癌和癌旁組織中的表達

3.CDK4和PD-L1在結直腸癌組織中表達的相關性：在115例結直腸腺癌組織中，CDK4陽性率43.5%(50/115)，PD-L1的陽性率為33.0%(38/115)，兩者的表達呈正相關(rs=0.204，P<0.05，表4)。

表4 PD-L1、CDK4在結直腸腺癌組織中表達的相關性

討 論

細胞周期依賴性蛋白激酶4是調控細胞周期循環的核心因子，Cyclin D-CDK4/6-INK4-Rb信號通路主要負責G1～S期的調控。本研究結果表明，CDK4 蛋白與淋巴結轉移呈正相關，且在含黏液的組織學類型中表達更多。這與已有的研究結果大致相同，CDK4蛋白與癌組織分化程度呈負相關，與淋巴結轉移呈正相關[32]。

程序性死亡蛋白1(PD-1)是一種免疫抑制受體，由于持續的炎癥刺激而在活化T細胞的表面表達。PD-L1是PD-1的主要配體，表達于惡性腫瘤細胞、活化的T細胞、B 細胞、巨噬細胞和樹突狀細胞，其表達說明宿主免疫反應減弱，預后較差[4]。但是，Li等[5]研究結果則表明，PD-1和PD-L1表達越高，CRC患者預后越好。Rosenbaum等[6]對已知微衛星不穩定性(microsatellite instability，MSI)和突變狀態的181例結直腸癌患者進行PD-L1免疫組織化學檢測顯示，PD-L1表達與分化程度低、微衛星不穩定性、BRAF突變相關。本研究顯示，PD-L1蛋白與組織分化程度呈負相關，分化越高，PD-L1表達越少，且與淋巴結轉移呈正相關。

本研究顯示CDK4與PD-L1的表達呈正相關，差異有統計學意義(rs=0.204，P<0.05)，但是相關研究顯示，PD-L1在腫瘤中的的表達并不是穩定的。Zhang等[7]對小鼠動物模型及人類原發性前列腺癌的研究發現，PD-L1蛋白穩定性受Cyclin D-CDK4和Cullin 3SPOPE3連接酶的調控。體內抑制CDK4/6可提高PD-L1蛋白水平，主要通過抑制Cyclin D-CDK4介導的斑點型鋅指結構蛋白(speckle-type POZ protein，SPOP)磷酸化，從而促進復合物/細胞周期體(APC/CCdhl)降解SPOP。SPOP功能缺失會破壞泛素介導的PD-L1降解，導致小鼠腫瘤和原發性人類前列腺癌標本中PD-L1水平升高，腫瘤浸潤淋巴細胞(TILs)數量減少。因此，將CDK4/6抑制劑治療與抗PD-L1免疫治療結合使用，可以增強腫瘤的消退，顯著提高小鼠腫瘤模型的整體生存率。此研究說明了CDK調控PD-LI蛋白穩定性的分子機制，揭示了聯合CDK4/6抑制劑與PD-1/PD-LI免疫檢查點抑制劑可以提高癌癥的治療效果。

腫瘤細胞中PD-L1上調有兩種不同機制，即先天性免疫抵抗和適應性免疫抵抗[8]。前者指的是腫瘤細胞內的致癌信號導致PD-L1的表達上調，例如ALK基因重排和EGFR突變型肺癌[9,10]。相反，適應性免疫抵抗是指腫瘤細胞在抗腫瘤免疫反應產生局部炎癥信號時，誘導PD-L1表達[11]。Goel等[12]通過研究乳腺癌小鼠模型發現，CDK4/6抑制劑不僅能誘導腫瘤細胞周期阻滯，還能促進抗腫瘤免疫，表現為增強腫瘤抗原的表達、細胞毒性T細胞識別并抑制調節性T細胞增殖。最終，CDK4抑制劑通過增加免疫檢查點阻斷進一步增強腫瘤消除。

近年來，免疫治療成為繼手術、放療、化療、靶向治療后一種新的腫瘤治療方式。免疫檢查點抑制劑、CAR-T細胞、腫瘤疫苗等新的免疫治療策略不斷顯現。免疫治療聯合細胞周期素依賴激酶抑制劑方案也在計劃與實施中以實現對PD-1/PD-L1通路的更好阻斷，從而發揮對腫瘤更好的抑制效果。CDK4/6抑制劑與抗PD-L1或抗PD-1抗體結合的臨床試驗已在乳腺癌和肺癌患者中進行。筆者今后仍需開展CDK4/6抑制劑聯合抗 PD-1/PD-L1 抗體治療實體腫瘤更多的臨床試驗，從而進一步明確該方案的確切療效，并探索可能出現的不良反應以及更有效的免疫指標，為臨床治療結直腸癌提供新的治療方案，對結直腸癌患者的預后提供一定的幫助。