miRNA-210-3p在大腸癌細胞遷移侵襲中的促進作用及其靶基因的生物信息學分析

潘 鑫 李婉明 于 敏 方 瑾

EffectofmiRNA-210-3pinInvasionofColorectalCancerCellsandBioinformaticAnalysisofTargetGenes.PanXin,LiWanming,YuMin,etal.DepartmentofCellBiology,KeyLaboratoryofCellBiology,MinistryofPublicHealth，KeyLaboratoryofMedicalCellBiology,MinistryofEducation,ChinaMedicalUniversity,Liaoning110122,China

AbstractObjectiveTo investigate the effect of miR-210-3p in colorectal cancer (CRC) cells migration and invasion and to analyze the enriched signaling pathways of target genes by bioinformatic methods.MethodsThe expression of miR-210-3p in colorectal cancer was analyzed by dbDEMC and OncomiR database. Real-time quantitative PCR was used to detecte the expression of miR-210-3p in five types of CRC cells (CL187,HCT-8,SW480, HCT-116,LoVo). miRNA mimics or inhibitor was transfected in CRC cells to up or down regulate the expression of miR-210-3p. Transwell assays were used to evaluated migration and invasion of CRC cells after transfection. Target gengs were pridected by miRDB, TargetScan7.2, starBase and miRPathDB. Gene ontology analysis and signal pathway enrichment were performed by DAVID.ResultsdbDEMC and OncomiR database showed that miR-210-3p was highly expressed in colorectal cancer, which was related to tumor metastasis and prognosis. Real-time quantitative PCR tested expression of miR-210-3p in highly invasiive cell lines(HCT-116 and LoVo) was significantly higher than that in moderate invasive cell lines SW480. And low invasive cell lines(CL187, HCT-8) revealed the lowest expression. Overexpression of miR-210-3p significantly enhanced SW480 cell migration and invasion, while LoVo cell migration and invasion was decreased after knockdown miR-210-3p. A total of 3035 target genes were predicted and the functions were mainly enriched in biological processes such as cell migration, adhesion, protein metabolism. The enriched pathways include cancer pathway, HIF signaling pathway and Rap1 signaling pathway. RGMA is significantly down regulated in clinical CRC tissues and may be the target gene of miR-210-3p.ConclusionmiR-210-3p can improve the migration and invasion abilities of colorectal cancer cells, which indicates that it might be a new biological target for colorectal cancer treatment.

KeywordsmiR-210-3p; Colorectal cancer; Invasion; Bioinformatic analysis; Target gene

大腸癌是消化系統常見的一種惡性腫瘤，其發生率和病死率居高不下。引發大腸癌患者死亡的主要原因是早期診斷不及時，確診時約30%的患者已發生轉移[1]。因此尋找腫瘤轉移的分子標志物對了解大腸癌轉移機制和提高患者預后有重要意義。microRNA(miRNA)是一類長約22個核苷酸的內源性非編碼RNA，與靶mRNA 3′UTR結合，促進其降解或抑制其翻譯，從而對基因表達進行負調控[2]。大量研究表明，miRNA在多種腫瘤中表達異常，參與腫瘤的發生、發展及轉移[3～5]。

miR-210-3p位于人11號染色體短臂，多項研究表明其在多種腫瘤中發揮著重要的作用。研究報道，在三陰性乳腺癌、非小細胞肺癌、胰腺癌等惡性腫瘤中，miR-210-3p的表達水平與患者的臨床病理特征相關，可以作為預后及診斷的生物學標志物[6～8]。在肺腺癌中，miR-210-3p通過抑制賴氨酰氧化酶樣4(LOXL4)促進癌細胞增殖和遷移，發揮癌基因作用；而在膀胱癌中，miR-210-3p則發揮抑制腫瘤生長和轉移的抑癌作用[9,10]。但在大腸癌中miR-210-3p的作用仍不清楚，本研究旨在探討miR-210-3p對大腸癌細胞遷移和侵襲能力的影響，預測相關靶基因及其富集的GO功能和信號轉導通路，為深入開展miR-210-3p對大腸癌的轉移機制的研究提供理論依據。

材料與方法

1.細胞系及主要試劑：選取不同轉移潛能的大腸癌細胞系，高轉移細胞系HCT-116和LoVo，中低轉移細胞系SW480，低轉移細胞系CL187、HCT-8，以上細胞系購自中國科學院上海細胞庫。miR-210-3p模擬物，miR-210-3p抑制劑，miRNA NC和Transfection Kit均購自廣州銳博生物科技有限公司；miRNA Isolation Kit購自美國Invitrogen公司；miRNA反轉錄引物、反轉錄試劑盒、檢測試劑盒(All-in-one miRNA qRT-PCR Detection Kit)購自廣州復能公司；胎牛血清、RPMI1640和DEME培養基購自以色列BI公司。

2.細胞培養及轉染： HCT-8、SW480、HCT-116和LoVo細胞培養于含10%胎牛血清的RPMI 1640培養基，CL187細胞培養于含10%胎牛血清的DMEM培養基，置于37℃、5% CO2培養箱中培養。將對數生長期的細胞接種于培養皿中，培養至細胞匯合度達到30%～50%。將miR-210-3p 模擬物、miR-210-3p抑制劑、miRNA-NC按照轉染試劑盒說明書提供的方法轉染至SW480細胞中，繼續培養用于后續實驗。

3.miRNA的提取及實時熒光定量PCR實驗：在無RNA酶條件下嚴格按照miRNA提取試劑盒說明書提取細胞miRNA。將miRNA反轉錄合成cDNA后，進行實時熒光定量PCR擴增。以U6為內參，采用2-ΔΔCt法計算miRNA表達。

4.Transwell遷移、侵襲實驗：實驗分為空白對照組、陰性對照組、miR-210-3p 模擬物組、miR-210-3p 抑制劑組。用無血清培養基制備細胞懸液，調整細胞濃度至2.0×105個/毫升，接種至無基質膠包被或包被Matrigel基質膠的Transwell小室上層，下室加入600μl含10%胎牛血清的培養基，培養48h后，95%乙醇固定30min，4%臺盼藍染色30min，于顯微鏡下計遷出細胞數。隨機選擇5個視野計算平均值。

5.生物信息學分析：使用dbDEMC和OncomiR數據庫分析miR-210-3p在大腸癌組織中的表達。利用TargetScan7.2、starBase、miRDB和miRPathDB進行miR-210-3p靶基因的預測，利用DAVID數據庫對靶基因進行生物學過程富集分析和基于KEGG的Pathway信號通路的富集分析，利用GEPIIA數據庫分析關鍵靶基因在臨床病理組織中的表達。

結 果

1.miR-210-3p在大腸癌組織和癌細胞中的表達：dbDEMC數據庫分析顯示，大腸癌組織中miR-210-3p表達量明顯高于癌旁組織(P<0.01)；轉移組織中miR-210-3p的表達量顯著高于原發癌組織(P=0.000)；OncomiR數據庫分析顯示，miR-210-3p高表達患者生存期低于miR-210-3p低表達組(P<0.05，圖1)。熒光定量PCR結果顯示，miR-210-3p在高轉移性細胞LoVo、HCT-116中的表達水平高于中低轉移性細胞SW480及低轉移性細胞CL187和HCT-8(圖2)。

2.miR-210-3p模擬物、抑制劑轉染對大腸癌細胞遷移、侵襲能力的影響：Transwell遷移和侵襲實驗結果顯示，上調中低轉移性SW480細胞內miR-210-3p的表達后，遷出和侵入小室的細胞數目明顯多于對照組(圖3A，P<0.05)；下調高轉移性LoVo細胞內miR-210-3p的表達后，遷出和侵入小室的細胞數目明顯低于對照組(圖3B，P<0.05)。

圖1 miR-210-3p的表達與大腸癌患者的生存分析

圖2 不同轉移潛能大腸癌細胞中miR-210-3p的表達

圖3 轉染miR-210-3p模擬物、抑制劑對大腸癌細胞遷移和侵襲能力的影響A.SW480細胞遷移和侵襲結果；B. LoVo細胞遷移和侵襲結果；與空白對照比較，*P<0.05

3.miR-210-3p靶基因的預測和分析：利用miRDB、TargetScan7.2、starBase和miRPathDB數據庫對miR-210-3p的靶基因進行預測，得到3035個靶基因。選取兩兩數據庫的交集進行GO生物學功能注釋以及KEGG通路富集分析，在生物功能方面，靶基因功能主要富集在細胞遷移、細胞黏附、血管生成等；在細胞組分方面，主要富集在細胞核、胞質、吞噬小泡中；在分子功能方面，主要富集在轉錄因子活性、鐵鋅離子轉運等；KEGG信號轉導通路主要富集在癌癥通路、HIF信號通路、Rap1信號通路等多個遷移相關信號轉導通路(圖4)。為了更為準確地篩選靶基因，筆者將預測到靶基因數據導入String數據庫中分析蛋白間的相互作用，FGFRL1、E2F3、PTEN、BMP2、RGMa等編碼蛋白質在相互作用網絡圖(PPI)中發揮穩定結構的作用(圖5)。

圖4 候選基因GO分析以及KEGG分析藍色.KEGG信號通路；黃色.分子功能；綠色.細胞組分；紅色.生物學過程

圖5 候選基因PPI分析

4.關鍵靶基因驗證：用GEPIA數據庫進一步驗證分析存在相互作用的靶基因在大腸癌組織(275例)和正常組織(349例)中的表達情況，結果發現，APC、GPD1L、ISCU、RGMa在大腸癌組織中的表達低于正常組織，其中RGMa的表達差異有統計學意義(P<0.05，圖6)。

討 論

miRNAs是一種內源性非編碼RNA，與靶基因mRNA的3′UTR結合，在轉錄或轉錄后水平抑制mRNA的翻譯，影響蛋白表達，從而發揮生物學功能[2]。近年來，大量研究證實miRNA不僅參與調控包括細胞增殖、分化、凋亡以及新陳代謝等各種正常的生理功能，更與多種腫瘤的發生、發展、轉移以及耐藥相關[11]。在大腸癌中，已報道多種miRNA存在表達異常，通過上調或下調表達抑制或者促進大腸癌細胞的增殖和轉移[12～14]。因此，研究miRNA作用對于提高對大腸癌轉移機制的認識，開發新的腫瘤轉移標志物具有重要的臨床意義。

圖6 關鍵基因在大腸癌組織及正常組織中的表達水平(腫瘤組織：n=275;正常組織：n=349)A～D分別為APC、GPD1L、ISCU、RGMa在腫瘤組織和正常組織中的表達情況。*P<0.05

大量研究證明miR-210-3p在多種腫瘤中表達異常，參與調控細胞增殖、凋亡、遷移、侵襲和藥物敏感度等過程。Ren等[15]研究發現,miR-210-3p通過靶向SIN3A調節非小細胞肺癌細胞增殖和凋亡，Zhang等[16]研究結果顯示,miR-210-3p可促進乳腺癌細胞遷移，Xie等[17]則發現下調miR-210-3p的表達可提高膽管癌的耐藥性。然而miR-210-3p在大腸癌轉移中的作用機制尚不清楚。信息學分析結果顯示，miR-210-3p在大腸癌組織中的表達量高于癌旁組織，以及其在轉移組織中的表達量顯著高于原發癌組織，并且miR-210-3p高表達的患者生存時間明顯低于miR-210-3p低表達組；熒光定量PCR結果進一步發現，miR-210-3p在高轉移性大腸癌細胞中的表達量顯著高于中低轉移性大腸癌細胞，提示miR-210-3p的高表達可能起到促進大腸癌侵襲、轉移的作用。在過表達miR-210-3p后，筆者觀察到中低轉移性SW480細胞的遷移和侵襲能力明顯增強，而降低miR-210-3p表達后，高轉移性LoVo細胞遷移和侵襲能力又明顯減弱，說明miR-210-3p具有促進大腸癌細胞遷移和侵襲能力的作用。

為進一步探究miR-210-3p促進大腸癌遷移和侵襲的分子機制，筆者利用miRDB、TargetScan7.2、starBase和miRPathDB數據庫對miR-210-3p的靶基因進行預測，發現在生物功能方面，靶基因功能主要富集在細胞遷移、細胞黏附、血管生成等；細胞組分主要富集在細胞核、胞質、吞噬小泡中；分子功能富集在轉錄因子活性、鐵鋅離子轉運等；KEGG信號轉導通路主要富集在癌癥通路、HIF信號通路、Rap1信號通路等多個遷移相關信號轉導通路。進一步分析靶基因的編碼蛋白間的相互作用，發現FGFRL1、E2F3、PTEN、BMP2、RGMa等編碼蛋白質在相互作用網絡圖中發揮穩定結構的作用，Yang等[10]已鑒定出FGFRL1可作為miR-210-3p的靶基因抑制膀胱癌的生長和轉移，表明筆者的分析具有可行性和可信性。在臨床大腸癌的腫瘤組織中，筆者發現關鍵基因的編碼蛋白APC、GPD1L、ISCU、RGMa在大腸癌組織中低表達，其中RGMa的表達差異有統計學意義(P<0.05)。

排斥性導向分子a(repulsive guidance molecule，RGMa)是排斥性導向分子家族成員之一，被認為是細胞遷移、分化、鐵穩態和凋亡等許多基本過程的關鍵分子，可通過新生素抑制血管新生，還可通過調控Smad信號抑制前列腺癌的細胞生長和黏附，發揮抑癌作用[18～20]。

已有報道顯示其在結腸癌中經常發生遺傳和表觀失活而導致腫瘤發生惡性轉變，在膠質母細胞瘤中還受miR-127-3p的抑制而調控細胞的惡性增殖。筆者通過生物信息學分析，預測出RGMa極有可能也是miR-210-3p的潛在靶基因，可能在大腸癌中起到抑制腫瘤轉移的作用，因此后續將通過相關實驗驗證miR-210-3p與RGMa之間的相關性，以探索大腸癌的轉移機制。

綜上所述，miR-210-3p在大腸癌組織及轉移性大腸癌組織中呈高表達，其過表達可增強大腸癌的細胞遷移和侵襲能力，發揮促癌作用。筆者預測了包括RGMa等在內的靶基因及其富集的信號通路，為miR-210-3p成為大腸癌轉移的早期診斷指標和治療靶點提供依據。