基于生物信息學分析篩選腎上腺皮質癌核心基因

張德蓮 蔡昕添 洪 靜 朱 晴 吳 婷 李南方

ScreeningHubGenesofAdrenocorticalCarcinomaBasedonBioinformaticsAnalysis.ZhangDelian,CaiXintian,HongJing,etal.HypertensionCenterofthePeople′sHospitalofXinjiangUygurAutonomousRegion,HypertensionInstituteofXinjiang,NHCKeyLaboratoryofHypertensionClinicalResearch,Xinjiang830001,China

AbstractObjectiveTo study hub genes of adrenocortical carcinoma, and to explore possible prognostic evaluation and screening of molecular biomarkers for diagnosis by bioinformatics methods, which provides bioinformatic evidence support for potential therapeutic targets of adrenocortical carcinoma.MethodsThe data of GSE14922, GSE19750 and GSE90713 chips were downloaded from GEO database, and a series of bioinformatics methods were used to process, analyze and screen the differential genes of GSE14922 chips. Then select hub genes through CytoHuhha plug-in, and finally use the online analysis tools GEPIA and GSE19750, GSE90713 chip data to carry out survival analysis and diagnostic test analysis of hub genes.ResultsTotally 90 differential genes were obtained from the GSE14922 chip. The 6 hub genes obtained through the CytoHuhha plug-in are: BUB1, CDK1, CENPF, NDC80, ASPM and DLGAP5. The results ofKaplan-Meiersurvival curve analysis showed that the above hub genes have a significant impact on the diagnosis and survival prognosis of adrenocortical carcinoma patients. The results of ROC analysis show that the above hub genes have better diagnostic significance for patients with adrenocortical carcinoma.ConclusionThe 6 hub genes obtained through bioinformatics analysis play an important role in the progression of adrenal cortical cancer, and provide a new theoretical basis for revealing the potential diagnosis, prognostic markers and therapeutic targets of adrenal cortical cancer.

KeywordsAdrenocortical carcinoma; Hub genes; Biomarkers; Bioinformatics

腎上腺皮質癌(adrenocortical carcinoma，ACC)是一種罕見的惡性內分泌系統腫瘤，年發生率為(0.7～2.0)/百萬。ACC的預后極差，即使早期診斷并通過手術將其切除的情況下，其復發和轉移的風險仍然很高，5年總生存率仍低于40%[1]。近年來盡管ACC的臨床診治流程取得了巨大的優化，但由于早期診斷困難及缺乏有效的治療策略，只有少數患者可獲得顯著的生存益處[2]。越來越多的證據表明，多基因的異常表達參與了ACC的癌變與進展[1]。因此，探究ACC的發生、增殖和復發的分子機制，發現新的治療靶點，從而制定出有效的診斷和治療策略，對于改善ACC患者的預后具有極為重要的作用。近年來微陣列技術和生物信息學分析被廣泛應用于檢測與分析基因組學的綜合表達情況。本研究從GEO數據庫下載了3份基因芯片數據集，并對其進行分析，以獲得ACC癌組織與非癌組織之間的差異基因(differentially expressed genes， DEGs)。隨后，通過生物信息學分析進一步探討ACC發生的分子機制，并揭示ACC潛在的診斷、預后標志物和治療靶點。

材料與方法

1.原始芯片數據來源：本研究中原始DNA微陣列數據是從GEO數據庫中獲得的。根據不同平臺中的注釋信息，將探針信號轉化為的相應基因名字。共獲得3份芯片數據集(GSE14922、GSE19750和GSE90713)。其中，基于GPL6480平臺(Agilent-014850 Whole Human Genome Microarray 4x44K G4112F)的GSE14922芯片，包含4個正常的腎上腺皮質組織、8個腺瘤組織和4個原發性腎上腺皮質癌組織；基于GPL570平臺[(HG-U133_Plus_2) Affymetrix Human Genome U133 Plus 2.0 Array]的GSE19750芯片，包含4個正常的腎上腺皮質組織和44個原發性腎上腺皮質癌組織；基于GPL15207平臺(Affymetrix Human Gene Expression Array)的GSE90713芯片，包含5個正常的腎上腺皮質組織和58個原發性腎上腺皮質癌組織。

2.芯片數據預處理和差異基因篩選：利用R語言軟件(3.6.3版)中的Affy包對GSE14922芯片的原始數據進行初步分析，并將微陣列文件轉換成基因表達譜數據。然后使用穩健的多陣列平均法來標準化表達譜數據。此外，使用Limma軟件包計算和分析樣本組與對照組之間的差異基因，采用t檢驗和fold-change(FC)對癌組織和正常組織間的基因表達進行顯著性分析。然后，使用Benjamini-Hochberg法計算調整后的P值(FDR)。GSE14922芯片DEGs篩選的最終結果以火山圖的形式展現。統計學差異標準為FDR<0.01，|logFC|≥2。

3.蛋白質相互作用網絡的構建與核心基因的篩選：蛋白質相互作用網絡分析是一種識別各種蛋白質之間聯系關系的方法。為了進一步了解AAC分子機制，將DEGs列表輸入到STRING(版本11.0)數據庫的搜索工具中。利用該工具，選擇相互作用關系評分>0.7的蛋白質構建相互作用網絡[3]。使用Cytoscape 3.7.2軟件對從STRING數據庫中獲得的蛋白質相互作用網絡進行可視化處理，并利用CytoHuhha插件的Stress算法、MCC算法、DMNC算法和MNC算法從蛋白質相互作用網絡中計算排名前10的基因[4]。最后利用韋恩圖取交集，將4種算法皆排名前10的基因選作核心基因。

4.核心基因的生存預后分析：GEPIA在線分析工具是一個基于TCGA數據庫和GTEx項目的在線分析網站。通過使用GEPIA在線分析工具對所篩選到的核心基因進行生存分析，以檢查上述核心基因表達水平的改變與患者的存活率之間的關系，繪制核心基因的Kaplan-Meier生存曲線并計算高低表達間的生存是否存在統計學差異，以P<0.05為差異有統計學意義[4]。

5.核心基因的診斷價值評價：本研究利用GSE63060和GSE63061數據集的數據對上述核心基因的診斷價值進行了評價。本研究采用R語言中的pROC軟件包繪制ROC曲線并通過計算ROC曲線下面積(AUC)來評價每一個核心基因的診斷性能。當AUC值>0.7時，則該核心基因被認為具有較好的診斷性能。

結 果

1.芯片數據預處理和差異基因篩選的結果：從GSE14922數據集中共獲得到16個樣本的芯片檢測數據。在進行質量控制及數據的預處理后，對每個芯片的序列分別進行了分析，共獲得了19553個基因的表達水平信息。根據FDR<0.01和|logFC|≥2的標準，共選擇了90個DEGs，包括53個上調基因和37個下調基因，火山圖見圖1。

圖1 差異表達基因的火山圖紅色.顯著上調基因；綠色.顯著下調基因；黑色.表達差異無統計學意義基因

2.蛋白質相互作用網絡的構建與核心基因的篩選：利用STRING數據庫對90個差異表達基因進行了蛋白質相互作用的網絡分析并將分析結果導入Cytoscape軟件中，得到的相互作用網絡由87個節點以及453條邊組成，詳見圖2A。利用Cytoscape軟件的CytoHuhha插件分析篩選核心基因，在4種算法的計算下均排名前10的DEGs被認為核心基因。最終通過韋恩圖取交集獲得腎上腺皮質癌的核心基因有BUB1、CDK1、CENPF、NDC80、ASPM和DLGAP5，詳見圖2B。

3.核心基因的生存預后分析：利用在線分析工具GEPIA對上述核心基因進行生存預后分析，詳見圖3。從Kaplan-Meier生存曲線的結果中可以認為BUB1基因(HR=7.7，P=0.000)、CDK1基因(HR=11，P=0.000)、CENPF基因(HR=4.6，P=0.000)、NDC80基因(HR=4.9，P=0.000)、ASPM基因(HR=12，P=0.000)和DLGAP5基因(HR=7.8，P=0.000)對腎上腺皮質癌患者的生存預后具有顯著影響。

4.核心基因的診斷價值評價：在GSE63060和GSE63061數據集的數據中BUB1基因(AUC=0.963)、CDK1基因(AUC=0.977)、CENPF基因(AUC=0.989)、NDC80基因(AUC=0.955)、ASPM基因(AUC=0.957)和DLGAP5基因(AUC=0.966)對在ACC患者與對照人群中表達水平的差異具有較好的診斷意義，可用于ACC患者的診斷，詳見圖4。

圖2 蛋白質相互作用網絡圖與核心基因的篩選A.蛋白質相互作用網絡圖(紅色模塊代表表達上調蛋白質，綠色模塊代表表達下調蛋白質)；B.韋恩圖

圖3 腎上腺皮質癌相關核心基因生存預后分析A.ASPM基因；B.BUB1基因；C.CDK1基因；D.CENPF基因；E.DLGAP5基因；F.NDC80基因

圖4 6個核心基因診斷ACC的ROC曲線

討 論

ACC是一種罕見且侵襲性極高的癌癥[1]。據報道兒童期AAC的發病絕大多數與TP53的種系突變密切相關，但對于成人ACC的發病機制和主要分子機制卻了解甚少[5]。越來越多的數據表明，成人ACC的發病是多基因參與、多通路相互作用的結果[6]。因此，需要更好地理解ACC發病機制和相關分子機制，以揭示ACC潛在的診斷、預后標志物和探索新的治療靶點，從而更積極地改善患者預后。

BUB1基因及其重要旁系同源物BUB1B基因均參與編碼絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，在有絲分裂中發揮核心作用[7]。編碼的蛋白質部分通過將有絲分裂檢查點復合物的成員磷酸化并激活紡錘體檢查點來發揮功能[8]。BUB1基因還在DNA損傷修復、抑制后期促進復合物/環體的活化中發揮重要作用[9，10]。目前的研究表明，BUB1基因的突變與幾種非整倍性相關的腫瘤密切相關[9]。CDK1基因主要編碼細胞周期蛋白依賴性激酶1，是一種高度保守的蛋白激酶復合物的催化亞基[10]。因其對于真核細胞周期的G1/S和G2/M相變至關重要，所以又被稱為M期促進因子。其主要參與細胞周期調控、DNA損傷修復和檢查點轉錄等生物學過程[11]。目前已有的研究表明與CDK1相關的疾病主要包括視網膜母細胞瘤和乳腺癌，其主要參與途徑包括卵母細胞減數分裂和ERK信號轉導[12]。位于染色體1q41上的CENPF基因所編碼蛋白質主要起著絲粒-線粒體復合體的作用，并且可作為相間G2期間核基質的重要組成部分。作為染色體分離的調節劑，CENPF以細胞周期依賴性方式表達。有研究表明CENPF通過對信號轉導、葡萄糖代謝和表觀遺傳調控等作用，在腺體細胞性腫瘤進程中扮演著重要角色[13]。

NDC80基因是一種蛋白質編碼基因，其編碼的蛋白質由N末端微管結合結構域和與復合物其他成分相互作用的C末端卷曲螺旋結構域組成[14]。NDC80通過介導紡錘體裝配檢查點信號和染色體比對在染色體分離中發揮重要作用。染色體分離功能障礙是染色體不穩定的重要原因之一，而染色體的不穩定性是腫瘤細胞的共同特征之一，是腫瘤形成與進展的重要機制[15]。ASPM基因位于1q31染色體上，編碼異常紡錘體微管裝配體蛋白。ASPM基因的表達對于胚胎成神經細胞中正常的有絲分裂紡錘體功能和神經發生的調節至關重要[16]。

有研究表明，ASPM與肝細胞癌、卵巢癌、胰腺癌和前列腺癌的不良預后顯著相關[17]。DLGAP5基因主要編碼有絲分裂紡錘體蛋白，該蛋白可促進微管蛋白聚合物的形成，從而在微管的末端附近形成微管蛋白片[18]。DLGAP5作為細胞周期調節劑參與多種癌癥的形成和發展，目前已有報道DLGAP5在結腸癌、乳腺癌、肝癌和膀胱癌等癌癥中存在過度表達的情況，并且該基因及其產物可能是潛在的腫瘤治療靶點[19]。

綜上所述，本研究通過基因組學高通量測序結合生物信息學分析的方法對4個正常的腎上腺皮質組織、8個腺瘤組織和4個原發性腎上腺皮質癌組織進行了全基因組基因的表達分析，以探索與ACC發生和進展相關的差異表達基因,共發現90個DEGs。通過構建PPI網絡并通過4種不同算法獲得6個核心基因。采用不同數據庫和數據芯片進行預后分析與診斷試驗分析進一步證實，BUB1、CDK1、CENPF、NDC80、ASPM和DLGAP5基因的表達水平既可用于評估ACC患者的預后情況又具有良好的預測診斷性能。本研究為探討ACC的分子細胞機制以及潛在治療靶點提供了生物信息學證據支持，并意味著其可作為提高ACC診斷準確性及靶向藥物開發的潛在生物學標志物。雖然本研究具有上述優點，但仍存在部分局限性。首先，缺乏核心基因與臨床病理數據的相關性分析。其次，本研究未進行Western blot法檢測分析或免疫組化染色來評價核心基因編碼蛋白在ACC腫瘤組織中的表達情況。因此，在未來的研究中需進一步收集臨床數據與病理學證據并進行Western blot法檢測分析及免疫組化染色，進一步驗證生物信息學方法分析結果的準確性。