BI-1在心肌缺血再灌注損傷中的作用及機制研究

鐘小蘭 班努·庫肯 景江新

RoleandMechanismofbi-1inMyocardialIschemia-reperfusionInjury.ZhongXiaolan,Bannu·Kuken,JingJiangxin.DepartmentofCardiology,TheSecondAffiliatedHospitalofXinjiangMedicalUniversity,Xinjiang830063,China

AbstractObjectiveTo investigate the role and mechanism of BI-1 in myocardial ischemia-reperfusion injury.MethodsRat models of myocardial ischemia-reperfusion injury and oxidative stress injury of H9c2 cardiomyocytes were constructed. The expression of BI-1 was evaluated by RT-qPCR and Western blot, and subcellular localization of BI-1 was observed by laser confocal microscopy. BI-1 overexpression plasmids and BI-1 shRNA were transfected into H9c2 myocardial cells. BI-1 expression, cell survival rate, activity of LDH, caspase-3 and caspase-9, and apoptotic rate of cardiomyocytes were detected.ResultsCompared with the sham group, the myocardial infarction area appeared in the I/R group, and the LDH level was significantly increased (P=0.000). Both mRNA and protein level of BI-1 were increased in heart tissues of rats with ischemia-reperfusion injury in a time-dependent manner (P<0.01). In cardiomyocyte oxidative stress injury model, the expression level of BI-1 was increased with H2O2stimulation (P<0.01). Overexpression of BI-1 decreased the activity of LDH (P<0.05) and the number of apoptotic cells (P<0.01), but inhibited the activity of caspase-3, caspase-9 and increased the cell survival rate (P<0.01). Knockdown of BI-1 increased the activity of LDH (P<0.01), decreased the cell survival rate (P<0.05), and increased the number of apoptosis of cardiomyocytes (P<0.01). In addition, BI-1 was located on mitochondria by laser confocal observation.ConclusionIschemia reperfusion injury and oxidative stress promoted the expression of BI-1 in cardiomyocytes, which could inhibit the apoptosis of cardiomyocytes caused by oxidative stress, exerting a protective role in the myocardium.

KeywordsCardiac ischemia-reperfusion injury; Bax inhibitor-1; Apoptosis; Oxidative stress injury

冠狀動脈急性和持續性缺血缺氧所導致的心肌壞死稱為急性心肌梗死[1]，如今社會老齡化嚴重，飲食習慣改變，生活節奏加快，急性心肌梗死的發生率在我國不斷升高，居高不下的高病死率給人們的身體健康和社會的穩定發展帶來很大的危害[2，3]。支架置入術、直接冠狀動脈介入治療及溶栓治療等技術的不斷進步，明顯降低了急性心肌梗死的病死率[4]。但是，心肌梗死患者因缺少改善冠狀動脈血管再灌注損傷的有效方案，預后受到極大的影響。研究表明心肌缺血再灌注損傷中有大量心肌細胞凋亡現象[5，6]。心肌凋亡是造成損傷進一步惡化的重要事件，而凋亡作為程序性細胞死亡，是可以經過調控被阻斷的，因此靶向凋亡有助于緩解損傷。近年來發現的存在于細胞中的凋亡抑制因子BI-1(Bax inhibitor-1)，能夠通過抑制線粒體相關凋亡途徑來阻止細胞凋亡相關過程[7]。研究表明，BI-1是一種抗凋亡蛋白，可保護細胞免受許多不同的固有死亡刺激包括內質網應激引起的細胞凋亡等，BI-1可以抑制Bax介導TNF相關的凋亡誘導配體(TNF related apoptosis inducing ligand，TRAIL)誘導的細胞凋亡[8～10]。控制心肌缺血再灌注損傷的關鍵途徑之一是抑制心肌細胞凋亡。BI-1作為細胞凋亡調控蛋白，其對缺血再灌注心肌是否具有保護作用以及如何發揮作用，仍然不清楚。因此，本實驗旨在研究BI-1在心肌缺血再灌注損傷和氧化應激損傷下抗心肌細胞凋亡的作用，進一步探討其發揮心肌保護的作用機制。

材料與方法

1．材料： 體質量約250g，7～8周齡的清潔級雄性Sprague Dawley大鼠，來自新疆醫科大學實驗動物中心。大鼠H9c2心肌細胞購自中國科學院上海細胞生物研究所。DMEM(Dulbecco′s-modified Eagle′s medium)培養基購自美國Gibco公司；Prime Script TM RT reagent Kit with gDNA Eraser(Perfect Real Time)購自大連TaKaRa公司；線粒體熒光探針(Mito Tracker)購自上海翊圣生物科技有限公司；BI-1單克隆抗體購自圣克魯斯生物技術(上海)有限公司；鼠抗GAPDH多克隆抗體購自天津三箭生物技術有限公司；辣根過氧化物酶標記的山羊抗兔二抗(Goat Anti-Rabbit IgG Secondary Antibody)、辣根過氧化物酶標記的山羊抗鼠二抗(Goat Anti-Mouse IgG Secondary Antibody)購自北京義翹神州科技有限公司；ECL化學發光試劑盒購自上海碧云天生物技術有限公司；乳酸脫氫酶活性檢測試劑盒購自南京建成生物公司；pcDNA3.1(-)-BI-1質粒購自上海吉瑪公司；shRNA NC和BI-1 shRNA質粒購自上海吉瑪制藥技術公司；Turbofect轉染試劑購自賽默飛世爾科技(中國)公司。37℃恒溫細胞培養箱購自自黑龍江東拓儀器制造有限公司；組織切片儀購自徠卡顯微系統(上海)貿易有限公司；熒光定量PCR儀購自賽默飛世爾科技(中國)公司；激光掃描共聚焦顯微鏡購自德國Carl Zeiss公司產品；凝膠成像儀和蛋白電泳儀購自美國伯樂公司。

2.大鼠心肌缺血再灌注損傷(Ischemia-reperfusion injury，I/R)模型的建立：按照文獻方法制備模型[11]：用10%水合氯醛麻醉Sprague-Dawley大鼠，仰臥位固定大鼠，通過左胸廓切開術打開胸腔暴露心臟。將5/0絲線縫合在左冠狀動脈前降支(Left anterior descending，LAD)周圍，使用活結打結。關閉開胸手術，左冠狀動脈前降支結扎15、30或45min后，允許心臟再灌注不同的時間(1、2、4、8h)，再灌注期結束后，收集血液，并迅速取出左心室游離壁缺血區心臟。假手術組冠狀動脈不結扎,模型制備方法和上述相同。

3.乳酸脫氫酶(lactate dehydrogenase, LDH)活性測定：根據LDH測定說明書測定LDH活性：收取假手術組和缺血再灌注組血清，將相同體積的蒸餾水、待測樣本和標準液分別加到標準管、空白管、對照管和測定管中。再向各管添加250μl基質緩沖液，將50μl輔酶Ⅰ加到待測管里，充分混勻后在37℃水浴鍋中孵育15min，將2，4-二硝基苯肼加入到各管中，37℃孵育15min，添加2.5ml氫氧化鈉(0.4mmol/L)溶液于各管中，靜置5min，測定各管吸光度，利用公式LDH活性(U/L)=(ODu-ODc)/(ODS-ODB)×Cs×N×1000進行計算。

4.大鼠心肌細胞氯化三苯基四氮唑(triphenyl tetrazolium chloride，TTC)染色：建立大鼠缺血再灌注損傷模型后，將各組細胞心臟取出，用PBS沖洗幾次，吸干水分后置于-20℃冷凍30min，用組織切片儀切取冷凍的心臟，將切取的冷凍切片置于2%TTC溶液中，于室溫浸泡20min，注意避光，用4%多聚甲醛固定染好的心臟切片，觀察灰白色區域(梗死區)和磚紅色區域(非梗死區)并拍取照片。

5.心肌細胞培養及處理：在含10%胎牛血清的DMEM培養基的培養瓶中培養H9c2細胞，放于37℃、5%CO2培養箱中培養。每天按時觀察細胞狀態，用1mmol/L 過氧化氫(hydrogen peroxide，H2O2)刺激心肌細2、4、8、16h后收集細胞RNA樣和蛋白樣用于檢測，不同濃度(0.25、0.50、0.75、1.00mmol/L)H2O2刺激細胞16h收集細胞RNA樣和蛋白樣用于后續實驗。

6.細胞轉染：將H9c2細胞以1×105個/孔接種于12孔板，待細胞密度生長至約70%時，將pcDNA3.1(-)-BI-1、pcDNA3.1(-)、BI-1shN和shNC質粒(序列為: BI-1-shRNA:5′-GCATCCTTATCACTGCATTTG-3′,shNC:5′-GTTCTCCGAACGTGTCACGT-3′)按照Tubfect轉染試劑的說明書轉染到H9c2細胞中，放于37℃、5% CO2培養箱中小心培養一定時間后，收集細胞RNA樣和蛋白樣用于后續實驗。

7.Cell Counting Kit-8(CCK-8)法檢測細胞存活率：將轉染pcDNA3.1(-)-BI-1、pcDNA3.1(-)、BI-1-shRNA和shNC質粒的H9c2細胞株按照1×105個/毫升鋪于96孔板中，放在37℃、5%CO2培養箱中培養，用1mmol/L的H2O2刺激細胞16h，同時設置未用H2O2刺激的細胞作為對照組，然后去除上清液，每個孔加入100μl混合培養液(CCK8工作液和培養液比例為1∶10)，繼續自培養箱中培養2h后，用酶標儀讀取各孔細胞在450nm處的吸光值。

8.實時熒光定量PCR(RT-qPCR)：按照實驗要求收取細胞RNA樣，利用Trizol試劑提取細胞的RNA，測定濃度后，參照TaKaRa公司兩步法反轉錄試劑盒說明書反轉成cDNA，使用Applied Biosystems 7300實時PCR系統完成RT-qPCR，用2-△△Ct法分析定量結果。實驗所用的引物見表1。

表1 引物序列

9.Western blot法檢測：收取蛋白樣，提取出蛋白質后，通過BCA法測定上清液中蛋白質的濃度，配置SDS-PAGE膠，濃縮膠80V、30min，分離膠120V、1.5h的程序進去電泳，結束后根據蛋白大小濕轉或半干轉至PVDF膜上，室溫下用50g/L脫脂奶粉封閉2h，用Tris-HCl緩沖鹽溶液(TBST)按比例稀釋特異性一抗，將封閉后的PVDF膜轉移至一抗稀釋液中4℃孵育過夜，TBST洗5洗，每次5min，再將PVDF膜轉移至TBST稀釋好的二抗中，37℃孵育2h，TBST洗5洗，每次5min，將PVDF膜置于ECL發光成像儀中顯影照相，分析結果。

10.激光共聚焦顯微鏡檢測了BI-1的亞細胞定位：培養H9c2細胞于激光共聚焦皿中，待細胞密度合適時，將重組質粒GFP-BI-1轉染于細胞里，培養24h后，加入Mitotracker探針，37℃、5%CO2培養箱中培養45min，PBS清洗3次,每次5min，加入40g/L多聚甲醛固定20min，PBS清洗3次,每次5min，加入Hoechst 33258染核10min，PBS清洗3次,每次5min，在激光共聚焦顯微鏡下觀察細胞。

11.caspase-3、caspase-9活性檢測：在指定的時間段內，用1mmol/L的H2O2處理細胞。用50μl細胞裂解液裂解細胞10min，在4℃條件下以12000r/min離心1min，通過Bradford法(DingGuo Biotechnology)測定上清液中的蛋白質濃度。含有等量蛋白質的上清液用于caspase-3比色測定或caspase-9活性測定,在37℃下孵育1～2h后，用微量滴定板讀數器測量405nm處的吸光度。

12.流式細胞儀(flow cytometry，FCM)檢測心肌細胞凋亡：用1mmol/L H2O2處理H9c2心肌細胞，胰酶消化后，用含10%胎牛血清的DMEM進行中和，1000r/min離心10min棄上清，PBS洗3次，沉淀置于70%的乙醇中于4℃固定過夜，用流式細胞儀檢測各組細胞的細胞凋亡水平，收集數據進行顯著性分析。

結 果

1.缺血再灌注損傷模型中BI-1的表達量：建立缺血再灌注損傷模型，通過RT-qPCR檢測不同缺血時間和不同再灌注時間細胞中BI-1的基因水平，Western blot法檢測BI-1的蛋白水平，測定乳酸脫氫酶活性和TTC染色觀察心肌梗死范圍。與假手術組比較，缺血再灌注組乳酸脫氫酶活性明顯升高(P=0.000，圖1A)，出現了心肌梗死區，心肌梗死組織大面積呈現灰白色(圖1B)；不同缺血時間(15、30、45min)后再灌注8h，細胞中BI-1的基因水平和蛋白水平均明顯升高，且隨缺血時間依賴性升高(P=0.000,圖1C,圖1D)；缺血45min后，再灌注不同時間(1、2、4、8h), BI-1的基因和蛋白表達量也明顯升高，且隨再灌注時間依賴性升高(P<0.01,圖1E,圖1F)。

2.H9c2心肌細胞氧化應激損傷模型中BI-1的表達量：建立H9c2心肌細胞氧化應激損傷模型，通過RT-qPCR、Western blot法檢測同一濃度H2O2刺激不同時間BI-1的基因和蛋白表達量和不同濃度H2O2刺激相同時間BI-1的基因和蛋白表達量。與對照組比較，用1mmol/L H2O2刺激心肌細2、4、8、16h后BI-1的基因水平和蛋白水平均明顯提高，且隨刺激時間依賴性升高(P<0.01，圖2A，圖2B)。不

圖1 BI-1在大鼠心肌缺血再灌注損傷細胞中的表達A.假手術組和缺血再灌注組乳酸脫氫酶活性測定；B.心肌細胞TTC染色(×200)；C. RT-qPCR檢測不同缺血時間BI-1的表達量；D. Western blot法檢測不同缺血時間BI-1的表達量； E. RT-qPCR檢測不同再灌注時間BI-1的表達量；F. Western blot法檢測不同再灌注時間BI-1的表達量。與假手術組比較， *P<0.01，**P=0.000

圖2 BI-1在氧化應激損傷心肌細胞中的表達A.RT-qPCR檢測1mM H2O2刺激心肌細不同時間后BI-1的表達量；B. Western blot法檢測1mmol/L H2O2刺激心肌細不同時間后BI-1的表達量；C. RT-qPCR檢測不同濃度H2O2刺激細胞16h后BI-1的表達量；D. Western blot法檢測不同濃度H2O2刺激細胞16h后BI-1的表達量。與對照組比較， *P<0.01，**P=0.000

同濃度H2O2(0.25、0.50、0.75、1.00mmol/L)刺激細胞16h后，BI-1的基因水平和蛋白水平均顯著提升，且隨刺激濃度依賴性升高(P<0.01,圖2C,圖2D)。

3.過表達BI-1對H2O2所致H9c2細胞損傷的影響：構建了pcDNA3.1(-)-BI-1重組質粒，轉染H9c2細胞并用1mmol/L H2O2刺激細胞，檢測過表達BI-1對H2O2所致H9c2細胞損傷的影響。RT-qPCR和Western blot法檢測BI-1的基因和蛋白表達量都高于對照組，pcDNA3.1(-)-BI-1重組質粒在H9c2細胞中成功表達(圖3A,圖3B)。過表達BI-1使乳酸脫氫酶的活性降低(P<0.05)，還能減少細胞毒性，使細胞存活率升高(P<0.01，圖3C,圖3D)；過表達BI-1抑制了氧化應激所引起的caspase-3、caspase-9活性上升(P<0.05，圖3G,圖3H)；過表達BI-1明顯抑制了氧化應激損傷所致細胞的凋亡(P<0.01,圖3E,圖3F)。

圖3 過表達BI-1對H2O2所致H9c2細胞損傷的影響A.RT-qPCR檢測pcDNA3.1(-)-BI-1的過表達效果；B. Western blot法檢測pcDNA3.1(-)-BI-1的過表達效果；C.乳酸脫氫酶活性測定；D.心肌細胞存活率測定；E.流式細胞儀檢測心肌細胞凋亡率；F.心肌細胞凋亡率統計；G. caspase-3活性檢測；H. caspase-9活性檢測。*P<0.05，**P<0.01，***P=0.000

4.干擾BI-1表達對H2O2所致H9c2細胞損傷的影響：構建了BI-1-shRNA重組質粒，轉染H9c2細胞并用1mmol/L H2O2刺激細胞，檢測干擾BI-1表達對H2O2所致H9c2細胞損傷的影響。RT-qPCR和Western blot法檢測BI-1的基因和蛋白表達量都低于對照組，BI-1-shRNA重組質粒在H9c2細胞中成功表達(圖4A,圖4B)。干擾BI-1表達使乳酸脫氫酶的活性升高(P<0.01)，細胞存活率下降(P<0.05，圖4C,圖4D)。干擾BI-1表達使H9c2細胞的凋亡數增加(P<0.01，圖4E,圖4F)。

圖4 干擾BI-1表達對H2O2所致H9c2細胞損傷的影響A. RT-qPCR檢測干擾BI-1表達后BI-1的表達量；B. Western blot法檢測干擾BI-1表達后BI-1的表達量；C. 乳酸脫氫酶活性測定；D. 心肌細胞存活率測定；E. 流式細胞儀檢測心肌細胞凋亡率；F. 心肌細胞凋亡率統計。*P<0.05， **P<0.01，***P=0.000

5.激光共聚焦觀察BI-1的亞細胞定位：構建GFP-BI-1重組質粒，通過激光共聚焦觀察BI-1的亞細胞定位，BI-1定位于線粒體上，和線粒體標志物存在共定位(圖5)。

圖5 激光共聚焦觀察BI-1的亞細胞定位A.激光共聚焦觀察BI-1-GFP的定位；B.激光共聚焦觀察線粒體的定位；C.激光共聚焦觀察細胞核的定位；D.激光共聚焦觀察BI-1與線粒體的共定位

討 論

隨著人們生活方式的不斷改變，急性心肌梗死患者病死率不斷上升，作為心血管危重癥，其危害性很大。筆者在心肌梗死早期利用溶栓治療或放置支架進行干預[12，13]。然而心肌梗死后使用冠狀動脈搭橋術常出現心肌缺血再灌注損傷，引起心肌細胞凋亡和死亡，進而引發冠狀動脈疾病[14]。心肌缺血再灌注損傷是復雜的病理學過程，研究表明該損傷與氧自由基的產生、白細胞激活和腺嘌呤核苷三磷酸(adenosine triphosphate，ATP)合成障礙等有關，對急性心肌梗死患者的預后產生很大的影響，但其生理機制尚未完全清楚。研究發現BI-1作為一種凋亡抑制因子，已參與了機體各種病理和生理過程。因此，本實驗利用過表達和干擾等技術探討BI-1在心肌缺血再灌注損傷和氧化應激損傷中的作用及其機制。

研究表明BI-1在腦、心臟、腎臟、肝臟等大部分組織中均有表達，在很多疾病中都發揮關鍵作用。有文獻報道BI-1基因對于哺乳動物肝臟和腎臟心肌缺血再灌注損傷具有內在抵抗力。另外發現在腦損傷和急性腦梗死模型中, BI-1能夠通過抑制海馬區內ERS調控其誘導的細胞凋亡[15]。本實驗中筆者首先檢測了BI-1在大鼠心肌缺血再灌注損傷中的表達量，結果發現BI-1基因和蛋白表達量均升高；在氧化應激模型中，BI-1的表達量也明顯上升，筆者認為表達量上調是由缺血再灌注和氧化應激損傷所誘導產生的。猜想BI-1表達量上升可能會起到心肌保護作用，所以構建了BI-1過表達和干擾重組質粒，轉染細胞后檢測過表達和干擾BI-1對H2O2所致H9c2細胞損傷的影響，結果發現過表達BI-1能夠明顯抑制氧化應激引起的細胞損傷和凋亡，由此可見BI-1具有心肌保護作用。caspases-3、caspase-9凋亡執行蛋白酶在細胞凋亡過程中起關鍵作用，筆者檢測了過表達BI-1對caspase-3、caspase-9活性的影響，發現過表達BI-1能夠降低caspase-3、caspase-9活性，進一步說明了BI-1能夠在細胞中發揮抗凋亡功能。之前研究發現，在調節細胞凋亡過程中，線粒體發揮著樞紐作用。而通過激光共聚焦發現BI-1定位于線粒體上，和線粒體標志物存在共定位，更進一步證明了BI-1的抗凋亡作用。

綜上所述，凋亡抑制因子Bax inhibitor-1(BI-1)在缺血再灌注損傷和氧化應激中表達量增加，能夠抑制損傷所導致的心肌細胞凋亡，從而起到心肌保護作用。然而這可能僅是一方面，有關BI-1抗心肌細胞凋亡的作用機制還需要進一步探討，為BI-1在急性心肌梗死靶向治療中的應用提供更多的依據。