基于蛋白質組學技術的多囊卵巢綜合征患者卵泡液研究

高丹丹，孫振高，馬英杰，王欣磊，張祎，李麗

(1.山東中醫藥大學中醫學院，濟南 250014；2.山東中醫藥大學附屬醫院，濟南 250014；3.山東中醫藥大學第一臨床學院，濟南 250014)

多囊卵巢綜合征(PCOS)是育齡期婦女常見的內分泌及代謝紊亂性疾病，作為無排卵性不孕的主要原因，其卵泡微環境的分子多樣性尚未完全闡明[1]。PCOS約占女性無排卵性不孕的80%[2]，臨床表現有高度的異質性[3]，主要表現為高雄激素血癥、排卵功能障礙、多囊卵巢、不孕癥、胰島素抵抗、肥胖、脂代謝異常、慢性低度炎癥等[4]，有約6%～20%的育齡期婦女生活受到影響[5]，且長期并發癥風險高，目前認為調整生活方式是治療PCOS的方法之一[6]。相關研究表明，PCOS可能涉及到的發病機制有下丘腦-垂體-卵巢軸功能異常、腎上腺內分泌功能異常、胰島素抵抗和高胰島素血癥，同時還與環境及遺傳因素有關[7]。

PCOS病理發展的分子機制尚不清楚[8]，現研究者試圖利用蛋白質組學技術尋找突破。蛋白質組學是指一個細胞所表達的全部蛋白質的總和[9]，以蛋白質為研究對象，彌補了基因組學的局限性，提供了蛋白質作為細胞功能的額外信息，其主要研究細胞、組織、器官、機體等蛋白質的表達、翻譯后的修飾以及蛋白質間的相互作用。在疾病研究中，蛋白質組學具有多種功能，主要包括新標志物的發現，某些疾病相關蛋白的篩選和鑒定，發病機制的研究和探索，早期臨床診斷標準的發現，尋求新的治療方法等。

卵泡液是由血漿滲出液和顆粒細胞、卵泡膜細胞的分泌物組成，為卵母細胞提供了生長發育的微環境，其主要成分為蛋白質、類固醇激素、多糖、代謝物、活性氧(ROS)以及抗氧化物等，這些成分在卵泡發育、成熟及排卵過程中起著重要作用[10]。卵泡液成分可反映卵巢細胞分泌過程的細微變化，以及病理條件下血漿成分的變化；同時利用蛋白質組學鑒定卵泡液成分彌補了通過觀察卵母細胞發育階段和形態來評價卵母細胞質量的不足。

一、蛋白質組學技術的發展

蛋白質組(proteome)概念最早于1994年提出，蛋白質組學技術的誕生為生命科學的發展提供了更廣闊的前景[11]。蛋白質組是一個在時間和空間上動態變化的整體[12]，近年來蛋白質組學技術在疾病研究方面越來越受到重視，其在闡明疾病病理機制方面有重要作用，可以篩選出差異蛋白，找到疾病治療靶點[13]。

蛋白質組學技術主要分為兩種，一種是基于雙向凝膠電泳(2-DE)定量技術，主要是熒光差異凝膠電泳，該技術在傳統2-DE技術基礎上與熒光染技術相結合，避免了傳統2-DE重復性差，提高了敏感度[14]。另一種是基于液相色譜-串聯質譜技術(LC-MS/MS)定量技術，該技術主要包括非標記定量技術、同位素標記定量技術兩種，LC-MS/MS在大規模檢測、鑒定和定量方面具有巨大的潛力[15]，其中絕對定量技術(iTRAQ)是目前研究中應用最多的，其樣本可以是經胰蛋白酶酶切的多肽，該技術可以絕對定量蛋白質，具有靈敏度高、數據準確、蛋白質覆蓋率高、重復性好等優勢[16]。

二、蛋白質組學技術在卵泡液研究中的應用

卵泡液提供了卵母細胞生長發育的微環境，因此，PCOS患者卵泡液蛋白表達譜可以反映PCOS患者卵泡微環境的改變和卵泡發育相關的獨特病理生理學信息。1996年Spitze等[17]開啟了對人類卵泡液蛋白質組的研究。

1.卵泡液中差異蛋白的篩選：Ambekar等[18]采用LC-MS/MS分析PCOS患者卵泡液蛋白質組成，鑒定出186種蛋白質存在差異豐度。差異蛋白主要包括雙向調節蛋白、硫酸乙酰肝素蛋白多糖2、腫瘤壞死因子(TNF)、α誘導蛋白6、纖溶酶原和淋巴管內皮透明質酸受體1等，這些蛋白參與卵泡成熟和排卵過程。卵丘-卵母細胞復合體(COC)基質的形成、擴張和粘液化是排卵、受精的關鍵，雙向調節蛋白的差異表達使得COC基質的擴張出現缺陷；還有部分蛋白質與血管生成及纖溶系統相關。另外還從卵泡液中鑒定出了一些新的蛋白質，包括超盆地蛋白(suprabasin)、S100鈣結合蛋白A7(S100-A7)、鋅指2螺旋酶、轉錄輔助激活劑，但這些蛋白質在卵巢中的功能還尚未明確。

Li等[19]使用串聯質譜(TMT)標記的定量蛋白質組學技術識別PCOS患者卵泡液外泌體中的蛋白質組特征，鑒定出86種差異蛋白，其中S100-A9蛋白通過激活核因子kappa B(NF-κB)信號途徑顯著增強炎癥反應并影響類固醇生成。Domingues等[20]使用液相色譜-離子阱-飛行時間質譜儀(LCMS-IT-TOF)分析PCOS患者的卵泡液蛋白質組，發現胎球蛋白A和維生素D配體蛋白只在PCOS組中表達，補體C3在PCOS組中過度表達。Patil等[21]利用LC-MS/MS鑒定出PCOS患者卵泡液中10種差異表達的糖蛋白，其中蛋白酶抑制劑SERPINA1和ITIH4上調、下調尤為明顯，SERPINA1能夠抑制組織重塑和促血管生成的蛋白酶，ITIH4可以維持細胞外基質(ECM)的穩定。Zhang等[1]使用LC-MS/MS的定量技術對肥胖、超重的PCOS患者和正常體重的PCOS患者進行卵泡液蛋白質組分析，發現炎癥、免疫、代謝相關的生物過程在PCOS的兩個亞群中都有富集，且肥胖會加劇卵泡微環境的異常。

在Ambekar等[18]和Patil等[21]的研究中均提到關于卵泡血管生成蛋白質的改變，血管生成改變可能導致卵泡發育停止、卵母細胞生長受損以及PCOS患者常見的黃體形成缺陷；而且均發現與ECM相關，這些蛋白可能導致ECM不穩定，影響COC的擴增，繼而導致卵母細胞質量和受精能力下降。Li等[19]和Zhang等[1]研究發現差異蛋白與炎癥反應相關，這些蛋白能觸發炎癥相關的信號通路，在諸多細胞過程中發揮重要作用。上述觀點提示在卵泡液的研究中差異蛋白多與血管生成、COC基質的擴增、ECM的穩定以及炎癥反應等相關，而這些過程與卵泡發育密切相關。

2.子宮內膜、卵巢、血液中差異蛋白的篩選：有研究使用電離串聯飛行時間質譜方法，發現PCOS患者子宮內膜上差異表達蛋白與細胞凋亡、氧化應激、炎癥以及細胞骨架、凝血功能相關，參與細胞重塑的幾種蛋白如微管調節因子(Stathmin)、蛋白二硫化物異構酶(PDI)、酶調節劑(SERPINA1)、甲狀腺素運載蛋白(Transthyretin)、熱休克蛋白、載脂蛋白A1和膜聯蛋白A4在PCOS中的代謝功能均發生顯著改變，從而影響子宮內膜的容受性，降低妊娠率[22]。差異凝膠電泳(DIGE)和質譜技術分析顯示了PCOS患者卵巢中膜相關孕激素受體組分1(PGRMC1)、視黃醇結合蛋白1(RBP1)、熱休克蛋白90B1、鈣調蛋白1、膜聯蛋白A6和原肌球蛋白2的差異表達；這些差異蛋白與胰島素抵抗、類固醇的生成、纖溶、凝血以及細胞凋亡等有關[23]。其中PGRMC1可激活細胞色素P450，在類固醇合成中起重要作用；熱休克蛋白90B1與多種細胞內受體和轉錄因子相互作用，在PCOS發病機制中可能具有促進細胞增殖的作用。最近Rashid等[24]利用基質輔助激光解析電離飛行時間質譜(MALDI-TOF MS)技術發現，參與轉錄調節、胚胎發生、DNA修復、蛻膜細胞倍性、免疫調節、細胞內轉運和降解過程的蛋白質在PCOS患者的血清蛋白質譜中差異表達。

3.診療策略：通過對PCOS患者卵泡液、卵巢、子宮內膜和血清蛋白質組學的研究，發現在這些生物液和組織中有相似的差異蛋白和發病機制，主要涉及類固醇的生成、COC基質的擴增、ECM的穩定、血管生成、細胞凋亡、炎癥及凝血等。陳莉等[25]在綜述中也發現PCOS患者不同組織的蛋白質組學結果存在不同，但仍存在一定的聯系。相較于之前對PCOS的研究中更多集中在炎癥反應和氧化應激，蛋白質組學技術使PCOS的治療得到更多方面和維度的思考。

PCOS是一種非特異性的慢性炎癥性疾病，被認為是卵巢功能障礙的原因之一[26]。TNF是由巨噬細胞分泌的一種小分子蛋白，有炎癥介質的作用，屬于炎癥因子的一種。之前的動物實驗發現黃酮類芹菜素可以顯著降低TNF-α、白介素-6和總氧化狀態[27]。Wu等[28]在動物實驗中發現熱休克蛋白與TNF、白介素-6、C反應蛋白呈現出明顯的負相關關系，熱休克蛋白可以作為PCOS炎癥指標檢測的一項。Alivandi等[29]在動物實驗中發現大豆異黃酮苷可以改善PCOS的炎癥及氧化狀態。有研究發現糖基化終產物可溶性受體(sRAGE)對PCOS產生的炎癥反應具有一定的保護作用，認為sRAGE具有一定的抗炎效果[30]。有文獻報道維生素D可以拮抗晚期糖基化產物(AGEs)，認為PCOS尤其伴有糖代謝異常的患者在治療上可以選擇應用維生素D[31]。還有研究發現AGEs是一種促炎分子，可與細胞表面受體相互作用，介導促炎通路和氧化應激的觸發[32]。

卵泡中褪黑色素是在卵泡發育后期從顆粒細胞中釋放出來的，在卵母細胞成熟過程中起積極作用[33]。褪黑色素的主要作用包括抗氧化和清除自由基[34]。有研究證實在臨床試驗中使用褪黑色素可明顯改善PCOS患者未成熟卵泡的質量，顯著提高IVF-ET的妊娠率[35]。2009年的一篇綜述詳述了褪黑色素可能成為改善卵巢功能和卵母細胞質量的藥物[36]。之后有文獻論述了褪黑色素可能通過改善卵泡代謝提高卵母細胞和胚胎質量[37]。

動物實驗證實氯化血紅素和L-精氨酸能改善多囊卵巢(PCO)大鼠的氧化狀態、炎癥反應、激素失衡和代謝紊亂等，提示氯化血紅素和L-精氨酸對PCOS均有保護作用[38]。有學者認為酪蛋白激酶2α可能是PCOS一個有前途的臨床治療靶點[39]。最新的動物研究發現microRNA-135a可能通過血管內皮生長因子C信號途徑促進PCOS中顆粒細胞的凋亡和DNA損傷反應，提示microRNA-135a是PCOS的一個治療靶點[40]。

目前對于PCOS的治療沒有特效藥，臨床醫生的主要目標是解決PCOS患者的生育要求，保證月經定期來潮和避免并發癥的發生，比如克羅米芬、醋酸環丙孕酮炔雌醇片、二甲雙胍等藥物的應用。在動物實驗中應用抗炎、抗氧化、改善信號途徑等的藥物可以對PCOS產生一定效果。近年來，利用蛋白質組學技術發現了一些新的差異蛋白，并對這些蛋白參與PCOS疾病的發生發展做出了一些假設并得到驗證；但關于卵泡液的蛋白質組學研究尚處于起步階段，一些新的治療靶點的發現，將對未來藥物的研發提供理論依據，但具體的治療途徑等還需進一步的研究探討。

三、結語

PCOS是一種常見的生殖內分泌代謝性疾病。近年來隨著蛋白質組學的發展，尤其是差異蛋白質組學技術的提高，科研人員利用該技術對PCOS的發病機制進行研究，通過對卵泡液的研究，篩選出了新的差異蛋白，這些差異蛋白揭示了PCOS發病的相關機制。PCOS患者卵泡液蛋白質組學的改變多與類固醇的生成、COC基質的擴增、ECM的穩定、血管生成、細胞凋亡、炎癥反應及凝血功能等有關。對卵巢、子宮內膜及血清的蛋白質組學研究中發現PCOS還與氧化反應有密切聯系。關于PCOS炎癥反應的治療有較多研究，且已經有了一些具體的治療措施，如使用黃酮類芹菜素、熱休克蛋白、大豆異黃酮苷、糖基化終產物可溶性受體以及褪黑色素等。關于PCOS治療不能忽視的一點是生活方式的調節。現階段利用蛋白質組學技術對卵泡液的研究尚處于起步階段，篩選出的差異蛋白并不能完全掌握其在疾病中的具體發病機制，需要更加深入的研究，找到疾病有效且安全的治療靶點，以期促進新藥物研發，給PCOS患者提供有效、便捷、經濟的治療手段。