吡咯喹啉醌通過(guò)降低氧化應(yīng)激和RANKL/OPG比率減少去卵巢大鼠骨量流失研究

鄭鵬驥 陸楊 張象 胡偵明

重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院骨科，重慶 400016

絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥是最常見(jiàn)的原發(fā)性骨質(zhì)疏松癥，其特征是骨質(zhì)疏松相關(guān)脆性骨折的發(fā)病率顯著增加[1]。盡管雌激素缺乏是骨質(zhì)疏松癥的主要原因，但由于心血管事件和乳房及子宮癌的風(fēng)險(xiǎn)增加限制通過(guò)補(bǔ)充雌激素用來(lái)治療或預(yù)防這類疾病[2]。甲狀旁腺素(PTH)是美國(guó)食品和藥物管理局(FDA)批準(zhǔn)的唯一臨床試劑，可用于促進(jìn)骨形成，但是使用期限不能超過(guò)2年[2]。目前的骨質(zhì)疏松癥治療主要是抗骨吸收劑，但可能出現(xiàn)嚴(yán)重的不良反應(yīng)，如骨形成的減弱[3]。因此，有必要尋求具有可長(zhǎng)期用于治療絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥的藥物。越來(lái)越多的研究表明，活性氧(ROS)誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激隨著衰老而增加，這與絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥的病理生理學(xué)有關(guān)[4-5]。過(guò)量的ROS可以抑制成骨細(xì)胞的分化和增殖、增強(qiáng)破骨細(xì)胞的分化，最終導(dǎo)致更多的骨吸收[6]。吡咯喹啉醌(PQQ)是一種氧化還原循環(huán)平面鄰醌，最初被鑒定為甲醇脫氫酶的輔酶[7]。最近，PQQ由于其在自由基清除中的作用而受到越來(lái)越多的關(guān)注。然而，PQQ對(duì)雌激素缺乏引起的骨質(zhì)疏松癥的保護(hù)作用尚不清楚。本研究使用OVX大鼠模型評(píng)估了PQQ在抗雌激素缺乏誘導(dǎo)的骨質(zhì)疏松癥中的作用和潛在機(jī)制。

1 材料和方法

1.1 動(dòng)物和研究設(shè)計(jì)

30只12周齡(225～260 g)雌性SD大鼠購(gòu)自上海實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后進(jìn)行試驗(yàn)。所有實(shí)驗(yàn)期間大鼠均飼養(yǎng)在23 ℃恒溫條件下12 h光暗循環(huán)的房間中，且所有大鼠都可以自由飲水和接受標(biāo)準(zhǔn)的嚙齒動(dòng)物飲食。大鼠隨機(jī)分成3組(每組n=10)，即OVX組、OVX + PQQ組和Sham組；其中OVX組和OVX + PQQ組進(jìn)行手術(shù)切除雙側(cè)卵巢，而Sham組進(jìn)行假手術(shù)，具體手術(shù)方案參考已發(fā)表的文獻(xiàn)[8]。除OVX+PQQ組外的所有大鼠均飼喂標(biāo)準(zhǔn)大鼠飲食。OVX + PQQ組大鼠在標(biāo)準(zhǔn)大鼠食物中加入4 mg/kg PQQ。藥物治療12周后，麻醉后通過(guò)頸脫位對(duì)所有大鼠進(jìn)行安樂(lè)死，收集股骨和血液樣本。

1.2 檢測(cè)指標(biāo)

骨密度和骨微觀結(jié)構(gòu)使用微型計(jì)算機(jī)斷層掃描(Micro-CT)分析，取出右股骨并保存在10 %福爾馬林液體中，隨后進(jìn)行Micro-CT平掃。使用隨儀器提供的3D Creator軟件(SkyScan)，對(duì)二維圖像生成三維渲染。使用軟件自動(dòng)計(jì)算以下3D參數(shù)，包括骨密度(BMD)、骨小梁厚度(Tb.th)、骨體積分?jǐn)?shù)(BV/TV)、骨小梁數(shù)量(Tb.N)、骨小梁分離度(Tb.Sp)、結(jié)構(gòu)模型指數(shù)(SMI)。

隨后對(duì)股骨進(jìn)行生物力學(xué)檢測(cè)，在CT測(cè)量后，對(duì)右股骨進(jìn)行如前所述的3點(diǎn)彎曲試驗(yàn)。使用三點(diǎn)彎曲方法在大鼠安樂(lè)死后股骨離體標(biāo)本進(jìn)行評(píng)估機(jī)械骨強(qiáng)度。使用MTS 858 Mini Bionix框架進(jìn)行測(cè)試。將每個(gè)股骨放置在兩個(gè)鈍邊緣上，其邊緣為22 mm。通過(guò)骨干中軸上的沖孔圓形凹口連續(xù)施加垂直載荷直至斷裂。位移率設(shè)定為1 mm/min。測(cè)試后，計(jì)算機(jī)記錄載荷-位移曲線，從載荷-變形曲線計(jì)算極限載荷(N)，能量(J)和剛度(N/mm)。

將股骨于液氮中冷凍并在RIPA緩沖液裂解，然后等份裝載(20 mg蛋白質(zhì))，使用SDS-PAGE分離蛋白質(zhì)。將蛋白質(zhì)在100 V下轉(zhuǎn)移至0.2 mm的聚偏二氟乙烯膜上60 min。使用以下一抗：OPG(1∶2 000，Cell Signalling)、RANKL(1∶750，Santa Cruz BT)、FOXO1(1∶500，Santa Cruz BT)和PPARγ(1∶500，Santa Cruz BT)，然后使用合適二抗處理。化學(xué)發(fā)光HRP底物檢測(cè)抗原抗體復(fù)合物，并使用LI-COR C-Digit印跡掃描儀進(jìn)行可視化，并使用相關(guān)的Image Studio 5.2軟件進(jìn)行光密度分析。

隨后進(jìn)行組織學(xué)檢測(cè)，將股骨固定在福爾馬林中并在升序乙醇系列中脫水。隨后，將股骨嵌入甲基丙烯酸甲酯中并切成4 μm切片用于染色。切片用蘇木精-伊紅(HE)染色以評(píng)估微結(jié)構(gòu)。用Osteomeasure軟件(OsteoMetrics，Decatur，GA，USA)進(jìn)行組織形態(tài)學(xué)分析。

1.3 生化分析

使用大鼠特異性試劑盒(南京建成生物工程研究所，中國(guó)南京)檢測(cè)血清TRACP-5b、I型膠原C-末端交聯(lián)端肽(CTX-I)、總抗氧化活性(T-AOC)、丙二醛(MDA)和超氧化物歧化酶(SOD)水平，檢測(cè)根據(jù)制造商的說(shuō)明書進(jìn)行。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

數(shù)據(jù)使用均數(shù)+標(biāo)準(zhǔn)差表示。采用單因素方差分析進(jìn)行兩組之間的比較。經(jīng)方差分析后，Bonferroni檢驗(yàn)確定兩組之間比較差異是否有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (P<0.05)。

2 結(jié)果

2.1 PQQ對(duì)OVX誘導(dǎo)的骨量丟失的影響

手術(shù)12周時(shí)大鼠的股骨Mciro-CT掃描結(jié)果如圖1 A 所示，骨密度和股骨微觀參數(shù)如表1中B～G所示，與Sham組相比， OVX組的股骨骨密度和骨微觀參數(shù)顯著降低(P<0.05)； OVX組的小梁間距顯著增加(P<0.05)，而OVX + PQQ上述指標(biāo)明顯優(yōu)于OVX組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。骨組織形態(tài)計(jì)量學(xué)參數(shù)顯示，PQQ對(duì)去卵巢大鼠股骨骨量和骨密度有保護(hù)作用。

圖1 治療12周大鼠股骨Micro-CT掃描結(jié)果注：與Sham組比較，*P <0.05，** P<0.01；與OVX組比較，#P< 0.05，##P<0.01。Fig.1 Micro-CT scans of femur in rats after 12 weeks treatment

2.2 組織學(xué)評(píng)估

治療12周時(shí)，三組大鼠股骨干骺端HE切片如圖2所示；去卵巢12周時(shí)，與Sham組相比較， OVX組的股骨干骺端骨小梁的量明顯降低，骨小梁連接較為稀疏；經(jīng)過(guò)12周PQQ干預(yù)，OVX + PQQ組大鼠股骨干骺端骨小梁數(shù)量明顯增加，且骨小梁連接更為緊密。

圖2 治療 12周大鼠股骨HE切片結(jié)果注：A Sham組；B OVX組；C OVX + PQQ組；(10×)。Fig.2 HE tissue section of femur in rats after 12 weeks treatment

2.3 生物力學(xué)性能

生物力學(xué)測(cè)試獲得的數(shù)據(jù)見(jiàn)圖3，Sham組具有最高的極限載荷、能量和剛度；與OVX組比較，OVX + PQQ組極限載荷、能量和剛度明顯增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

圖3 治療對(duì)大鼠股骨生物力學(xué)的影響注：與Sham組比較，*P<0.05，** P<0.01；與OVX組比較，#P<0.05，##P<0.01。Fig.3 Effects of treatment on femur biomechanics

2.4 治療后大鼠血清TRAP-5b、CTX-I、T-AOC、MDA和SOD的影響

與Sham組大鼠相比，OVX大鼠血清CTX-1、TRACP-5b和MDA水平均顯著升高，而T-AOC和SOD活性顯著降低，但這些參數(shù)通過(guò)補(bǔ)充PQQ得到改善(P<0.05)。

圖4 治療對(duì)大鼠生化指標(biāo)的影響注：與Sham組比較，*P<0.05，** P< 0.01。與OVX組比較，#P<0.05， ##P<0.01。Fig.4 Effect of treatment on biochemical indicators in rats

2.5 WB結(jié)果分析

與Sham組大鼠相比，OVX大鼠RANKL和RANKL/OPG比率均顯著升高，而OPG和FOXO1表達(dá)顯著降低；經(jīng)過(guò)PQQ干預(yù)后RANKL和RANKL/OPG比率均顯著降低，而OPG和FOXO1表達(dá)顯著增加(P<0.05)。

圖5 PQQ對(duì)OVX大鼠RANKL、OPG、FOXO1、RANKL與OPG的影響注：與Sham組比較，*P<0.05。與OVX組比較，#P< 0.05。Fig.5 The effect of PQQ on RANKL, OPG and FOXO1 and the ratio of RANKL to OPG in OVX rats

3 討論

OVX大鼠模型是絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥研究中成熟且廣泛使用的動(dòng)物模型[9]。在我們目前的研究中，我們使用大鼠模型來(lái)評(píng)估PQQ對(duì)雌激素缺乏誘導(dǎo)的骨質(zhì)疏松癥的影響。我們證實(shí)OVX導(dǎo)致雌激素缺乏誘導(dǎo)的大鼠骨質(zhì)流失。同時(shí)，我們證明PQQ補(bǔ)充可以顯著改善OVX誘導(dǎo)的骨質(zhì)流失。雖然雌激素缺乏的主要結(jié)果是骨吸收增加，但雌激素在細(xì)胞水平上影響骨量[10]。本研究中進(jìn)一步評(píng)估了OVX大鼠在補(bǔ)充PQQ后骨轉(zhuǎn)換等參數(shù)的變化。目前的研究表明，OVX不僅可以誘導(dǎo)破骨細(xì)胞骨吸收，還可以減少成骨細(xì)胞的骨形成和骨強(qiáng)度。相反，通過(guò)補(bǔ)充PQQ，破骨細(xì)胞的骨吸收和成骨細(xì)胞的骨形成和骨生物力學(xué)指標(biāo)顯著改善。我們的研究結(jié)果顯示，PQQ在預(yù)防雌激素缺乏引起的骨質(zhì)疏松癥中起著顯著的作用，它通過(guò)抑制破骨細(xì)胞骨吸收，刺激成骨細(xì)胞骨形成和增強(qiáng)骨強(qiáng)度。

本研究進(jìn)一步探索補(bǔ)充PQQ來(lái)預(yù)防雌激素缺乏引起的骨質(zhì)疏松癥是否與OVX誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激減少有關(guān)。最近的研究強(qiáng)烈表明，雌激素缺乏會(huì)加速骨骼衰老，并顯著損害抗氧化應(yīng)激的防御機(jī)制[11]。最近的研究表明，雌激素缺乏會(huì)導(dǎo)致Bmi1的下調(diào)，從而增加T細(xì)胞中ROS，T細(xì)胞活化和RANKL的產(chǎn)生，破骨細(xì)胞生成和加速骨量丟失；進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)雌激素缺乏誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激，小鼠骨組織中抗氧化酶水平和活性降低，成骨和成骨細(xì)胞骨形成受損[12]。抗氧化劑使用導(dǎo)致OVX小鼠的成骨和成骨細(xì)胞骨形成的強(qiáng)烈改善[4]。目前的研究證實(shí)，雌激素缺乏可以誘導(dǎo)氧化應(yīng)激，降低抗氧化酶水平和活性，而PQQ補(bǔ)充可以通過(guò)增加OVX小鼠的抗氧化酶水平和活性來(lái)減少氧化應(yīng)激。

成骨細(xì)胞可以產(chǎn)生RANKL和OPG，以調(diào)節(jié)破骨細(xì)胞的形成和分化。由于OPG抑制破骨細(xì)胞生成，而RANKL支持破骨細(xì)胞的骨吸收，因此OPG/RANKL的比例是破骨細(xì)胞分化和隨后骨吸收的關(guān)鍵因素。據(jù)報(bào)道，氧化應(yīng)激對(duì)RANKL的反應(yīng)增加，并作為破骨細(xì)胞生成的細(xì)胞內(nèi)第二信使，通過(guò)RANKL-TRAF6-Rac1氧化酶依賴性途徑介導(dǎo)破骨細(xì)胞增殖分化[6]。FOXOs的特征是存在一個(gè)稱為叉頭盒的有翼螺旋DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域，代表了針對(duì)氧化損傷的關(guān)鍵細(xì)胞防御機(jī)制[5]。氧化應(yīng)激促進(jìn)FOXOs易位到細(xì)胞核內(nèi)，翻譯后修飾包括磷酸化，泛素化和乙酰化。雌激素缺乏通過(guò)OPG/RANKL信號(hào)傳導(dǎo)途徑誘導(dǎo)了骨形成的生化標(biāo)志物顯著下降以及破骨細(xì)胞生成的增強(qiáng)和FOXO1降低。在本研究中，PQQ顯著下調(diào)了RANKL的蛋白質(zhì)表達(dá)，增強(qiáng)成骨細(xì)胞中OPG 和FOXO1的水平。本研究結(jié)果表明，PQQ不僅可以有效地阻止雌激素缺乏引起的骨質(zhì)疏松癥，還可以通過(guò)防御氧化應(yīng)激和改善RANKL/OPG比率。

綜上所述，我們目前的研究表明，雌激素缺乏引起的骨量丟失不僅與增加的氧化應(yīng)激和破骨細(xì)胞骨吸收有關(guān)，并且與成骨細(xì)胞骨形成減少有關(guān)。補(bǔ)充PQQ通過(guò)抑制氧化應(yīng)激和改善RANKL/OPG比率，在預(yù)防由雌激素缺乏引起的骨質(zhì)疏松癥中起重要的作用。因此，目前的研究表明，PQQ有預(yù)防和治療絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥的潛力。