紅景天甙聯合碳酸鈣對老年雌性大鼠骨量、骨代謝和氧化應激水平影響

張翔 顏衛文 王雅純

1. 海南醫學院第一附屬醫院神經內科，海南 海口 570100 2.海南醫學院第一附屬醫院核醫學科，海南 海口 570100 3.海南醫學院第一附屬醫院全科醫學科/老年科，海南 海口 570100

骨質疏松癥(OP)是一種全身性疾病，其特征在于骨基質和礦物質的減少，導致骨小梁的破壞和破裂以及骨的脆性增加，從而降低生物力學性質[1]。隨著年齡的增加，人體對鈣的吸收隨著成骨細胞產生的減少而減少，導致骨質流失逐漸增加，最終導致OP的發生[2]。預防和治療OP包括攝取足夠的維生素D和鈣，適當的運動和其他生活方式干預措施[3]。紅景天甙是紅景天根的活性成分，具有多種藥理作用，包括抗炎、抗癌、抗氧化等[4-5]。近年來的研究表明，紅景天甙對雌激素缺乏引起的大鼠骨質疏松癥有保護作用[6]。然而，沒有關于紅景天甙與碳酸鈣結合預防和治療OP的報道。因此，本研究旨在通過在老年雌性大鼠中采用紅景天甙與碳酸鈣結合，觀察其對骨密度、骨礦物質和氧化應激的影響，為臨床預防和治療OP提供依據。

1 材料和方法

1.1 實驗動物

選擇10只年齡為3個月，體重180～250 g的雌性無特定病原體(SPF)Sprague-Dawley(SD)大鼠作為對照組。選取40只年齡為24個月的雌性SPF SD大鼠作為實驗組。50只實驗動物購自上海實驗動物中心(編號SCXK 2012-000)。將大鼠飼養在塑料籠中，控制溫度和光照周期(24 ℃和12/12光周期)，濕度為40%并自由飲食。該研究經我院倫理委員會批準。

1.2 實驗試劑和實驗儀器

碳酸鈣、紅景天甙(Sigma-Aldrich，San Francisco，CA，USA)；超氧化物歧化酶(SOD)，丙二醛(MDA)和谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)(南京建成生物工程研究所，南京)。雙能X射線吸收測定儀(Hologic，Marlborough，MA，USA)；全自動生化分析儀(深圳市邁瑞生物醫藥電子有限公司)；連續波長多功能酶標儀(Tecan，Salzburg，Austria)。

1.3 實驗方案

40只老年雌性SPF大鼠適應性喂養一周，然后隨機分成4組，每組10只動物，即模型組(OP組)，紅景天甙組(H組)，碳酸鈣組(Ca組)和紅景天甙聯合碳酸鈣組(H+Ca組)，10只3月齡大鼠作為對照組(NC組)。所有大鼠在SPF系統中飼養，飼喂普通飼料，并在實驗過程中自由飲食。H組大鼠每天一次用20 mg/kg紅景天甙灌胃給藥; Ca組大鼠每天一次灌胃給予20 mg/kg碳酸鈣；H+Ca組大鼠每天一次用20 mg/kg紅景天甙和20 mg/kg碳酸鈣灌胃給藥；NC和OP組大鼠每天灌胃生理鹽水連續12周。

1.4 測量骨密度

在最后一次胃內給藥結束后，給大鼠禁食8 h。大鼠稱重后，腹膜內注射50 mg/kg 2%戊巴比妥鈉用于麻醉。將大鼠的四肢固定，通過雙能X射線吸收測定法測量腰椎(L4-L6)和雙側股骨的骨密度。

1.5 檢測血清指標

測量骨密度后，從腹主動脈抽取血液，并在4 ℃以1 200 r/min離心10 min。分離血清并在-80 ℃冰箱中冷凍保存。血清樣品使用ELISA試劑盒(Blue Gene，China)測量血清I型膠原C端肽(CTX-1)、骨鈣素、堿性磷酸酶(ALP)、I型前膠原N端肽(PINP)和抗酒石酸酸性磷酸酶5b(TRACP-5b)。按照檢測試劑和說明檢測血清SOD、MDA和GSH-Px。通過連續波長多功能酶分析儀在550 nm處測量各組SOD的含量；在532 nm處測定各組的MDA含量，在412 nm處檢測各組GSH-Px含量。

1.6 骨礦物質含量的測定

分離大鼠的左股骨，并除去附著的軟組織。將股骨在110 ℃的烘箱中烤至48 h至恒重。通過分析天平稱量骨骨干重，并計算骨干重與體重的比率。然后，將股骨在室內型電阻爐中700 ℃下焚燒6 h。通過分析天平對灰分重量進行加權，并計算骨灰重量與體重和骨灰重量與骨干重(%)的比率。

1.7 統計學處理

實驗結果使用均數±標準差表示；通過SPSS 20.0軟件對數據進行統計學分析。獨立樣本t檢驗用于兩組之間的比較，并且單因素方差分析(ANOVA)用于多組之間的比較。P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 各組大鼠骨密度的變化

與NC組相比，OP、H、Ca組大鼠腰椎和雙側股骨骨密度明顯降低(P<0.05或P<0.01)；與OP組相比，H、Ca、H+Ca組大鼠腰椎和雙側股骨骨密度明顯增加(P<0.05)；與H、Ca組比較，H+Ca組大鼠腰椎和雙側股骨骨密度明顯升高(P<0.05)；H+Ca組和NC組骨密度比較差異無統計學意義(P>0.05)。結果表明，紅景天甙和碳酸鈣均可顯著改善老年大鼠的骨密度，并且聯合使用顯示出更顯著的效果，見表1。

表1 各組大鼠腰椎和雙側股骨的骨密度比較

2.2 每組大鼠的骨礦物質代謝比較

與NC組比較，OP組骨干重、骨干重與體重比、骨灰重、骨灰重與體重比顯著降低(P<0.05或P<0.01)；與OP組相比，H、Ca、H+Ca組大鼠的這些指標均明顯升高(P<0.05或P<0.01)；與H組和Ca組相比，H+Ca組大鼠的這些指標均顯著升高(P<0.05)；H+Ca和NC組間這些指標的比較差異無統計學意義(P> 0.05)。結果顯示，紅景天甙和碳酸鈣均可顯著降低骨質疏松癥大鼠的骨礦物質損失，并且該組合顯示出更顯著的效果，見表2和3。

表2 各組大鼠骨干重的比較

2.3 各組大鼠血清骨代謝指標比較

與NC組相比，OP組大鼠血清ALP、CTX-1、骨鈣素、TRACP-5b和PINP水平顯著升高(P<0.05或P<0.01)；與OP組相比，H、Ca、H+Ca組大鼠ALP、CTX-1、骨鈣素、TRACP-5b和PINP水平明顯降低(P<0.05)；與H組和Ca組相比，H+Ca組大鼠血清ALP、CTX-1、骨鈣素、TRACP-5b和PINP水平顯著降低(P<0.05)；H+Ca和NC組之間的這一水平比較差異無統計學意義(P>0.05)。結果顯示，紅景天甙和碳酸鈣可明顯降低骨質疏松癥大鼠的血清ALP、CTX-1、骨鈣素、TRACP-5b和PINP水平，并且聯合治療顯示出更顯著的效果，見表4。

表4 各組大鼠骨代謝水平比較Table 4 Comparisons of calcium and phosphorus levels in rats among

2.4 各組大鼠血清SOD、GSH-Px活性和MDA含量的變化

與NC組相比，OP、H、Ca組大鼠血清SOD和GSH-Px活性顯著降低(P<0.05或P <0.01)，MDA含量明顯升高(P<0.05或P<0.01)。與OP組相比，H、Ca、H+Ca組大鼠血清SOD和GSH-Px活性明顯升高(P<0.05或P<0.01)，MDA含量明顯降低(P<0.05或P<0.01)；與H、Ca組比較，H+Ca組大鼠血清SOD和GSH-Px活性均顯著升高(P<0.05)，MDA含量明顯降低(P<0.05)；H+Ca和NC組之間的這些水平的比較差異無統計學意義(P>0.05)。結果顯示，紅景天甙和碳酸鈣均可顯著提高血清SOD和GSH-Px活性，降低MDA含量，并且聯合治療顯示出更顯著的效果，見圖1。

圖1 組間超氧化物歧化酶(SOD)活性、丙二醛(MDA)含量和谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)活性的比較注：與NC組相比，*P<0.05，**P<0.01；與OP組相比，#P<0.05，##P<0.01；與H組比較，△P<0.05；與Ca組比較，▲P <0.05。Fig.1 Comparison of superoxide dismutase (SOD), activity malondialdehyde (MDA) content and glutathione peroxidase (GSH-Px) activity among groups

3 討論

近年來，隨著中國進入老齡化時期，骨質疏松癥的發病率逐年上升，其骨折等并發癥嚴重影響人們的生活。對骨質疏松癥的研究引起了中國和其他學者的廣泛關注。鈣是人體礦物質中重要的微量元素之一，骨質疏松癥的主要病理變化是骨礦物質流失。其中，缺鈣是骨質疏松癥的重要原因，因此，補鈣是預防和治療骨質疏松癥的最有效和最安全的方法[7]。適當補充鈣可以增強骨鈣水平并增加骨密度，從而顯著改善骨形成[8]。紅景天甙是從玫瑰紅景天根中提取的主要生物活性化合物，研究表明，紅景天甙可改善雌激素缺乏引起的骨質疏松[9]和鏈脲佐菌素引起的糖尿病[10]的癥狀。但是，尚無證據表明紅景天甙聯合碳酸鈣治療對老年大鼠骨量的影響。

本研究在老年大鼠模型中觀察到BMD和骨量降低，骨代謝水平增加和氧化應激增加。紅景天甙治療12周后，BMD和血清骨轉換指標均顯著改善，表明紅景天甙聯合碳酸鈣能夠緩解年齡引起的骨量流失。骨轉換生物標志物反映了骨的形成和吸收，因此可以反映骨重塑的狀態，這是骨質疏松癥的潛在機制[11]。BTM包括骨形成和再吸收標志物。骨形成生物標志物是由成骨細胞合成的，因此反映了特定的成骨細胞功能，其中包括ALP、骨鈣蛋白和PINP[12]。已經提出增加骨形成標記物作為絕經后婦女骨質疏松癥的可能預測指標[13-14]。在本研究中，老年大鼠血清中骨形成增加可能是由于活躍的成骨細胞試圖補償由于雌激素缺少引起的骨質流失。骨吸收標記包括CTX-1和TRACP-5b。據報道，女性中CTX-1和TRACP -5b水平升高與BMD呈負相關[15]。在這項研究中，老年大鼠的骨形成(ALP、骨鈣蛋白、PIPN)和骨吸收(CTX-1和TRACP-5b)標志物均增加，表明骨轉換率增加；而紅景天甙的補充可顯著提高老年大鼠骨密度、降低骨代謝水平、減少骨礦物質流失，與碳酸鈣有協同作用，聯合用藥效果顯著。

由活性氧引起的有害作用在骨質疏松癥發生發展中起重要作用[16]。生物體中過多的骨吸收會增加活性氧的產生，導致破骨細胞和成骨細胞的破壞，導致骨量減少。隨著年齡的增長，體內自由基的含量逐漸增加，而吸煙、飲酒等不健康的生活方式可以誘導氧化應激，提高自由基水平，從而增加骨吸收[17]。本研究表明，紅景天甙和碳酸鈣可以增加老年大鼠的SOD和GSH-Px活性，減少MDA的產生，從而發揮抗氧化應激的作用；它們具有協同效應，并且顯示出更顯著的效果。

總之，該研究顯示老年大鼠的骨密度、骨礦物質損失、骨代謝水平明顯升高和氧化應激顯著下降，但紅景天甙和碳酸鈣的補充可顯著提高抗氧化應激能力，增加骨密度，降低血清骨代謝水平；并減少骨礦物質流失，從而預防和治療骨質疏松癥。這兩種物質具有協同作用，并且該聯合使用顯示出更顯著的效果，這為臨床預防和治療骨質疏松癥提供了實驗基礎。當然也需要進一步研究相關的分子生物學機制。