金匱腎氣丸對去勢大鼠骨微結構及ALP、OPG、IL-6的影響

張倩 楊旭 王媛 王世軍 王花欣*

1.山東中醫藥大學，山東 濟南 250355 2.山東省中醫經典名方協同創新中心，山東 濟南 250355

骨質疏松(osteoporosis，OP)是一類以骨組織微結構破損、骨密度降低、易骨折為特征的代謝性疾病[1]。絕經后骨質疏松癥(postmenopausal osteoporosis，PMOP)在50歲以上的人群中發病率約為30 %[2]，引發的骨折及并發癥嚴重影響著中老年人的身心健康，為家庭和社會帶來巨大負擔[3]，成為目前面臨的重要公共衛生問題。

PMOP的發病主因是雌激素缺乏，因此臨床常采用雌激素替代療法，但長期使用會增加乳腺癌的發病風險[4]。中醫治病求本，以“整體觀念，辨證論治”為優勢，注重機體的陰陽平衡，關注疾病的發生發展及變化。此外，中藥資源豐富、藥效理想、不良反應小等優勢也為中醫藥治療PMOP提供了廣闊的市場[5]。金匱腎氣丸由干地黃、山藥、山茱萸、茯苓、澤瀉、牡丹皮、附子、桂枝組成，具有溫補腎陽，化氣行水之功效，現臨床主要用于治療腎陽虛相關病癥[6-7]。研究發現給予PMOP女性金匱腎氣丸治療可有效提高骨密度[8]，但具體機制未明。

本實驗采用卵巢切除法(OVX)復制PMOP模型，觀察金匱腎氣丸對OVX大鼠體重、子宮形態、血脂血糖、鈣磷、骨密度及骨微結構的改善情況，并檢測金匱腎氣丸對OVX大鼠血清ALP、IL-6及OPG的影響，以探討其用于PMOP的療效機制，為指導臨床應用提供科學依據。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1實驗動物：9月齡SPF級SD大鼠40只，體重250～300 g，購自北京維通利華實驗動物中心有限公司[許可證號：SCXK(京)2016-0006]。大鼠飼養于SPF級動物房，濕度46%左右，溫度24 ℃左右。

1.1.2藥物及試劑：金匱腎氣丸由干地黃、山藥、山茱萸、茯苓、澤瀉、牡丹皮、附子、桂枝組成(藥材購于山東中醫藥大學新中魯醫院，經山東中醫藥大學李峰教授鑒定為合格產品)；戊酸雌二醇片(補佳樂，1 mg/片，拜耳醫藥保健有限公司)；異氟烷(深圳市瑞沃德生命科技有限公司，批號217180501)；4 %多聚甲醛固定液(Biosharp，批號BL539 A)；ALP試劑盒(南京建成生物工程研究所，貨號A059-2)；IL-6、OPG ELISA試劑盒(武漢伊萊瑞特生物科技股份有限公司，批號E-EL-R0015c；E-EL-R0050c)。

1.1.3主要實驗儀器：小動物氣體麻醉機(美國Matrx公司)；高速冷凍離心機(中國賽默飛世爾科技有限公司)；全自動生化分析儀(桂林優利特電子集團有限公司)；酶標儀(美國伯騰儀器有限公司)；離活體一體化Micro-CT設備(NEMO，平生醫療科技有限公司)。

1.2 方法

1.2.1藥物制備：據《金匱要略》原文記載腎氣丸的藥物用量為干地黃八兩，薯蕷(山藥)、山茱萸各四兩，澤瀉、茯苓、牡丹皮各三兩，桂枝、附子各一兩。方中各藥物用量比例為8∶4∶4∶3∶3∶3∶1∶1，加適量水煎，取藥液冷藏備用。

1.2.2分組與造模：按照隨機數字表的方法將大鼠分為2組：假手術組8只，手術組32只。手術組采用OVX復制OP模型，假手術組只切除卵巢附近等量脂肪。術后3 d肌肉注射青霉素，防止感染。術后7 d，將手術組大鼠隨機分為4組：模型組、金匱腎氣丸高劑量組、低劑量組、雌二醇組，每組8只。

1.2.3給藥方式及取材：將中藥飲片水煎兩次后，混合濾液并濃縮至0.85 g(生藥)/mL(相當于臨床等效劑量)為低劑量，濃縮至1.7 g(生藥)/mL(相當于臨床兩倍用量)為高劑量。雌二醇片制成濃度為0.01 mg/mL(相當于臨床等效劑量)的混懸液。灌胃量均為1 mL/100 g大鼠體重，連續給藥3個月。10 %水合氯醛麻醉，腹主動脈取血，取子宮及右側股骨。

1.3 檢測指標

大鼠去卵巢后每周稱重，取材后稱取子宮重量，計算子宮系數。取大鼠子宮置于4 %多聚甲醛中固定，石蠟包埋，組織切片，行HE染色，鏡下觀察子宮組織形態學改變。

將大鼠麻醉，取腹主動脈血，分離血清，全自動生化分析儀檢測血清中血脂、血糖、鈣、磷的含量，按照試劑盒操作步驟檢測血清中ALP、IL-6、OPG的含量。

取大鼠股骨，利用Micro-CT進行掃描，測定股骨近端骨密度。利用BI-2000醫學圖像分析系統進行骨組織形態學計量分析，包括骨體積密度(BV/TV)、骨表面積和骨體積的比例(BS/BV)、骨小梁厚度(Tb.Th)、骨小梁分離度(Tb.Sp)、骨小梁數量(Tb.N)、結構模型參數(SMI)、CT均值。

1.4 統計學處理

2 結果

2.1 金匱腎氣丸對OVX大鼠子宮重量的影響

與假手術組相比，模型組體重增長量最高(P<0.01)，子宮系數最低，而各用藥組有效的降低了由OVX導致的體重上升，子宮系數有所上升，見表1。

表1 金匱腎氣丸對OVX大鼠體重及子宮重量的影響

2.2 金匱腎氣丸對OVX大鼠子宮形態的影響

假手術組大鼠宮腔充盈，子宮完整，子宮內膜厚度適中，層次分明，子宮內膜上皮柱狀細胞排列整齊，形態完整，腺體數量多。與假手術組相比，模型組大鼠子宮宮腔干癟變形且內膜厚度明顯變薄，上皮柱狀細胞胞質減少，腺體萎縮減少，體積明顯萎縮，血管稀少。與模型組相比，金匱腎氣丸組與雌二醇組子宮較為完整，血管較為豐富，宮腔萎縮情況略有改善，腺體數量較模型組多，見圖1、圖2。

圖1 金匱腎氣丸對OVX大鼠子宮腔形態的影響(HE，50×)Fig.1 Effect of Jinkui Shenqi Pill on uterine cavity morphology of ovariectomized rats(HE，50×)

圖2 金匱腎氣丸對OVX大鼠子宮內膜及腺體的影響(HE，200×)Fig.2 Effect of Jinkui Shenqi Pill on uterus and gland in the ovariectomy rats(HE，200×)

2.3 金匱腎氣丸對OVX大鼠骨密度及骨微結構的影響

用藥3個月后，與假手術組相比，模型組骨密度明顯下降(P<0.01)；與模型組相比，金匱腎氣丸低劑量組骨密度明顯上升(P<0.05)，見表2。股骨三維成像圖可見，假手術組大鼠骨小梁大小、粗細適中、排列整齊、骨連接度好；模型組大鼠股骨骨小梁變短變薄、稀疏、斷裂，明顯呈骨質疏松狀；給予金匱腎氣丸治療后，骨微結構明顯改善，骨小梁結構完整，見圖3、表3。

圖3 金匱腎氣丸對去卵巢大鼠骨密度的影響(三維成像圖)Fig.3 Effect of Jinkui Shenqi pill on bone mineral density in the ovariectomy rats

表2 金匱腎氣丸對OVX大鼠骨密度的影響

2.4 金匱腎氣丸對OVX大鼠血脂和血糖的影響

大鼠去卵巢后，由于雌激素減少，導致體重上升，肥胖又進一步影響了血糖和血脂的正常值。與假手術組相比，模型組的血糖、TG、CHOL顯著上升，相比于模型組，金匱腎氣丸高、低劑量組大鼠血糖血脂明顯下降，見表4。

表3 金匱腎氣丸對OVX大鼠骨微結構的影響Table 3 Effect of Jinkui Shenqi Pill on bone microstructure in the ovariectomy

表4 金匱腎氣丸對OVX大鼠血脂和血糖的影響

2.5 金匱腎氣丸對OVX大鼠血清中鈣、磷的影響

與假手術組相比，模型組大鼠血清中的鈣、磷水平明顯下降；而金匱腎氣丸高劑量組較模型組的表達顯著升高，見表5。

表5 金匱腎氣丸對OVX大鼠血清中鈣、磷的影響

2.6 金匱腎氣丸對OVX大鼠血清中ALP、IL-6及OPG的影響

與假手術組相比，模型組大鼠血清中ALP、IL-6含量明顯升高，OPG含量明顯降低；與模型組相比，金匱腎氣丸高、低劑量組與雌二醇組都有效的降低了血清中ALP、IL-6含量，提高了OPG含量，見表6。

表6 金匱腎氣丸對OVX大鼠血清中ALP、IL-6及OPG的影響

3 討論

中老年人多為陽虛體質，常出現腰膝酸軟、怕冷、耳鳴、五更泄瀉等癥狀。腎陽為全身陽氣之根本，腎陽虛衰，骨骼得不到正常的氣血充養，關節無法發揮其正常的屈伸、支持等功能，出現骨質疏松。金匱腎氣丸出自《金匱要略》，被譽為“千古補腎陽第一方”。方中諸藥合用，使腎陽振奮，氣化復常，使腎陽得補，血脈暢通，筋脈、骨骼得養[9]。研究發現金匱腎氣丸可緩解跟骨骨質增生帶來的疼痛，有效治療“骨痿”[10]。臨床對100例OP患者在治療基礎上加服金匱腎氣丸后發現觀察組骨密度明顯高于對照組[11]。現代藥理學表明，山茱萸新苷Ⅰ具有促進成骨細胞增殖分化的作用，能顯著升高成骨細胞Wnt2、BMP2、β-catenin、OPG和NOX4的mRNA表達水平[12]。另實驗表明，干地黃能顯著抑制OVX對大鼠股骨和腰椎的影響[13]。

絕經后卵巢功能衰退，雌激素驟降引起體內脂肪代謝的紊亂，出現食欲亢進及活動減少，使基礎代謝率降低，體內脂肪含量增加而導致肥胖[14]。脂肪細胞過度分化降低成骨細胞分化和骨形成，使骨形成小于骨吸收，從而引起骨礦物質含量減少，最終導致骨質疏松[15]。而鈣、磷的變化是反映全身骨質代謝情況的重要指標[16]。實驗表明，OVX大鼠體重明顯上升，并且出現血糖及血脂的升高，鈣磷水平下降，金匱腎氣丸與雌二醇都有效地降低了由雌激素缺乏導致的肥胖及血糖血脂的異常，提高了血清鈣磷水平。

ALP是一種存在于成骨細胞中的胞內酶，其活性與骨形成密切相關，因此ALP是反映骨形成的重要標志[17]。骨代謝旺盛時成骨細胞活躍，血清中ALP活性增強，OVX大鼠雌激素分泌減少，使骨呈現高代謝狀態，即高骨形成和高骨吸收，同時骨形成小于骨吸收，造成大量骨質的丟失，這和絕經婦女的骨代謝情況相符合[18]。OPG由成骨細胞和血管內皮細胞分泌，能抑制破骨細胞前體細的分化和成熟，因此，血清OPG水平在骨質疏松早期診斷中有重要意義[19]，IL-6作為免疫系統的重要細胞因子，可直接激活破骨細胞活性，導致骨吸收活動增強，促進了骨質疏松的發生與發展[20]。雌激素作為主要抑制破骨細胞活性的激素之一，OVX大鼠體內雌激素含量下降，則破骨細胞活性增強，血清中IL-6水平提高[21]。

綜上，本實驗結果顯示，金匱腎氣丸通過影響ALP、IL-6及OPG的表達抑制破骨細胞活性，促進骨形成，改善骨組織微結構，提高骨密度，以改善骨質疏松，具有良好的臨床推廣價值。金匱腎氣丸作為中藥復方制劑兼具溫補腎陽的作用，但后續還需進一步深入研究探討其調控機制，為金匱腎氣丸的臨床應用提供實驗基礎。