18F-硝基咪唑的放化穩定性

時 光，鐘新文，程 亮，陳尚東

1.吉林警察學院 刑事科學技術系，吉林 長春 130123；2.沈陽化工大學 應用化學學院，遼寧 沈陽 110142

18F-硝基咪唑，化學名1-H-1-(3-18F-2-羥基丙基)-2-硝基咪唑(18F-fluoromisonidazole，18F-FMISO)是一種常見的乏氧硝基咪唑類PET顯像劑，與乏氧細胞有較高的親和力[1]，已廣泛應用于臨床研究。惡性腫瘤的迅速生長依賴于腫瘤血管的生成，腫瘤血管的供養能力差、血流緩慢、不規則和異常彎曲等現象，會引起腫瘤組織氧和營養物質不充分，從而產生腫瘤乏氧現象。文獻[2]報道過18F-FMISO的合成方法，氟化后水解再用堿中和反應體系(見圖1)，與本研究的方法基本相同，差別在于純化方法及用半制備型HPLC純化產品流動相的選擇。范文博等[3]報道了18F-FMISO的純化均采用乙醇水溶液作為流動相，所得到產品中一定會含有乙醇成分；早期也有采用固相萃取柱作為純化手段[4]。本研究擬采用乙腈水溶液做為流動相，分離產品后進入旋轉蒸發儀除掉有害溶劑，再用生理鹽水溶解產品，以得到不含有乙醇的18F-FMISO溶液。并分別選擇抗壞血酸、抗壞血酸鈉做為穩定劑，測量產品放化純度變化，選擇出合適的穩定劑。

圖1 18F-FMISO合成原理

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

HM-10HC回旋加速器和CFN MPS-200型合成裝置,日本住友重工業株式會社；高效液相色譜儀(ZORBAX SB-C18純化柱)，美國Agilent公司；放射性薄層色譜儀，美國BIOSCAN公司。

H218O，豐度97%，上?；ぱ芯吭?；無水乙腈、碳酸鉀、抗壞血酸鈉、抗壞血酸，美國SIGMA-ALDRICH公司；Kryptofix2.2.2(K2.2.2)、1-(2’-硝基-1’-咪唑基)-2-氧-四氫呋喃基-3-氧-甲苯磺酰基-丙二醇(NITTP)、1-H-1-(3-19F-2-羥基丙基)-2-硝基咪唑(19F-FMISO)，德國ABX公司；4-(4-甲基哌啶)吡啶陰離子交換樹脂(簡稱QMA柱)，美國Waters公司；可裁硅膠板，德國Macherey-Nagel公司；乙醇、甲醇，色譜純，北京化學試劑廠。

1.2 實驗方法

1.2.118F-的生產 用住友HM-10HC回旋加速器，以60 μA的質子束流連續轟擊H218O。H-經高頻電場反復加速，最后由碳膜剝離轟擊到靶上，發生18O(p, n)18F核反應生產18F-，50 min后用氦氣將18F-從靶傳到住友CFN MPS-200合成模塊的靶水回收瓶中。

1.2.218F-的捕獲 從靶水回收瓶壓出18F-通過 QMA柱，18F-被捕獲在QMA柱上，這時內置在合成模塊中的放化活度探頭RI1可以測量出捕獲到的18F-放射性活度，記錄此數值為回旋加速器的產量值。

1.2.318F-的洗脫和干燥 用 0.9 mL K2.2.2/K2CO3溶液(22 mg K2.2.2溶于0.7 mL乙腈/7 mg K2CO3溶于0.2 mL水)將吸附在QMA柱上的18F-淋洗至反應管，記錄此時設備中參數RI2的值，記為參加反應的18F-活度。然后開始加熱反應管除去體系里面的水和乙腈。蒸干后繼續向反應瓶中加入0.5 mL無水乙腈，再次加熱蒸干，因為水的存在會使氟化取代反應的合成效率大幅度降低，通過兩次除水，確保反應體系里沒有水的存在。

1.2.4加入前體NITTP進行氟化反應 在反應管中加入1.5 mL無水乙腈溶解的10 mg前體1-(2’-硝基-1’-咪唑基)-2-氧-四氫吡喃基-3-氧-甲苯磺?；?丙二醇(NITTP)，溶液添加完畢后通入氮氣鼓泡30 s，確保體系混合均勻，在密閉的反應管內120 ℃加熱反應，壓力傳感器監測到反應管內的壓力在100～110 kPa。7 min冷卻至室溫，視頻監控中觀察反應液的顏色變為淡黃色。

1.2.5水解和中和 向反應液中加入0.75 mL 1.0 mol/L的鹽酸溶液，120 ℃下密閉加熱反應4 min后冷卻至室溫，加入1.5 mL Na2HPO4和NaH2PO4組成的緩沖溶液(pH=7～8)進行中和。

1.2.6產品的HPLC純化 將粗產品進樣到半制備型HPLC中進行分離純化，流動相為V(乙腈)∶V(水)=15%∶85%，用放射性檢測器和紫外檢測器進行監測，流速3 mL/min,紫外檢測波長325 nm，18F-FMISO產品在11 min左右出放射性峰(圖2中尖銳峰A)，收集此時的產品進入加有穩定劑的旋轉蒸發儀中，用1 mL無水乙醇清洗管壁上殘留的產品進入旋轉蒸發儀的梨形燒瓶，加熱并在真空狀態下脫除溶劑，80 ℃下加熱80 s，再升溫至130 ℃下加熱直至溶劑完全蒸發，注入10 mL生理鹽水稀釋溶解，過0.22 μm無菌濾膜，得到產品。合成的關鍵步驟在于半制備型HPLC對產品的分離，合成前先以流動相沖洗半制備色譜柱，觀察紫外檢測器和放射性檢測器的基線是否平穩、柱壓是否穩定、管路連接處是否有漏液現象。合成進行到“HPLC INJECT”步驟，HPLC的泵自動啟動，通過攝像頭或者鉛玻璃觀察反應液是否完全被注射進入HPLC的“LOOP”環內，合成軟件自動記錄此刻為起始時間，當11 min左右出現尖銳放射性峰時開始收集產品，當放射性峰形回落至基線狀態，停止收集。

圖2 15%乙腈為流動相時18F-FMISO的HPLC分離曲線

1.3 質控

1.3.1薄層色譜法 用毛細玻璃管蘸取微量的產品溶液，在2×10 cm硅膠板上點樣，然后放置到展開缸中展開，展開劑為甲醇，用放射性薄層色譜儀檢測放化純度。

1.3.2高效液相色譜法 用5 mL注射用水溶解1 mg19F-FMISO標準品，用微量注射器抽取20 μL，注入到質控型HPLC進樣器內，以V(乙腈)∶V(水)=8.5∶1.5做為流動相，流速1 mL/min，紫外檢測波長325 nm，柱溫35 ℃。用紫外檢測器和放射性檢測器分別檢測產品的化學純度和放化純度。

1.3.3氨基聚醚(K2.2.2)的含量檢測 參考《中華人民共和國藥典》2015年版第二部[5]氟[18F]脫氧葡糖注射液中氨基聚醚(K2.2.2)的檢測方法，對產品進行K2.2.2含量的測定。

1.3.4細菌內毒素的檢測 參考《中華人民共和國藥典》2015年版第四部通則1143[6]105-109進行細菌內毒素檢測。

1.3.5溶劑殘留檢測 參考《中華人民共和國藥典》2015年版第四部通則0861[6]154-157殘留溶劑測定法，以硝基對苯二酸改性的聚乙二醇為固定液的毛細管柱為色譜柱，柱溫70 ℃，進樣溫度200 ℃，檢測器溫度為250 ℃，頂空瓶溫度為85 ℃，平衡時間10 min，取0.5 mL樣品進樣進行檢測。

1.3.6放化穩定性研究 用HPLC法，采用紫外和放射性雙檢測器，檢測抗壞血酸和抗壞血酸鈉做為穩定劑的情況下，產品的放化純度和時間的關系。記錄合成結束后時間為起始時間，每間隔一定時間取樣，檢測產品的放化純度。

2 結果與討論

采用住友CFN MPS-200合成裝置，NITTP為前體化合物，與回旋加速器生產出的18F-經氟化取代后水解，加緩沖溶液調節pH值后用半制備型HPLC分離，再進入旋轉蒸發儀脫掉溶劑，加生理鹽水溶解產品，轉出后過無菌濾膜得到產品。整個合成時間50 min，不校正合成效率EOS=(45±5)%(n=20)。透過鉛玻璃觀察產品為無色或淡黃色透明溶液，放置10個半衰期后取出觀察，產品為無色透明溶液。用精密pH試紙測定產品pH值在6～8之間。HPLC法檢測，產品和標準瓶溶液的保留時間一致，K2.2.2的質量濃度小于25 mg/L，1 mL的細菌內毒素含量小于15EU，產品中乙醇的質量分數小于1.5×10-3；乙腈質量分數小于15×10-6，未檢出丙酮成分，符合臨床使用要求。

2.1 制備型HPLC流動相選擇

分別選用15%(體積分數，下同)的乙腈(見圖2)和10%、5%的乙醇做為流動相進行產品純化，結果示于圖3—5。圖3結果表明，以10%的乙醇做為流動相分離產品時，產品的保留時間為9.67 min(如圖3中尖銳峰A)，但分離度較差，放射性峰與雜質紫外峰重合，用質控型HPLC對產品進行化學純度檢測發現，在保留時間為6.322 min和6.598 min(見圖4)時出現兩個雜質吸收峰，產品的化學純度無法滿足要求。圖5結果表明，以5%的乙醇做為流動相分離產品時，產品的保留時間為20.33 min(如圖5中尖銳峰A)，雖然分離效果較好，但保留時間過長，影響合成效率。

圖3 10%乙醇為流動相時18F-FMISO的分離曲線

圖4 10%乙醇為流動相進行18F-FMISO分離時得到產品的HPLC檢測UV曲線

圖5 5%乙醇為流動相時18F-FMISO的分離曲線

對比乙醇和15%乙腈水溶液(圖2)做流動相進行產物分離的結果表明，15%乙腈作為流動相的分離效果優于乙醇，且重復性好，可以在3 mL/min的低流速下分離產物，柱壓低。經旋蒸后除去乙腈溶劑，測得乙腈質量分數小于15×10-6，遠低于國家藥典對氟代脫氧葡萄糖(FDG)中乙腈質量分數小于4×10-4的要求。因此，在有旋轉蒸發儀的條件下，可以選擇15%乙腈水溶液作為流動相，為18F-FMISO的純化增加一種工藝路線選擇。以下實驗均采用15%乙腈水溶液作為流動相。

2.2 18F-FMISO的放化穩定性

制備型HPLC分離出的產品溶液進入旋轉蒸發儀的梨形燒瓶，加熱并在負壓狀態下脫除溶劑，80 ℃加熱80 s，再升溫至130 ℃加熱直至溶劑完全蒸發，注入10 mL生理鹽水稀釋溶解產品。在不添加任何穩定劑的情況下，測得18F-FMISO的放化純度與時間的關系，結果列于表1。從表1可以看出，產品無法達到放化純度大于95%的標準，但輻射自分解的速率較慢，6 h后的放化純度只降低了2～3個百分點。輻射自分解的原因是高能射線產生的自由基將水分解成自由的質子、羥基和過氧化氫，其中過氧化氫的質量濃度可達2 mg/L，這些質子、羥基和過氧化氫破壞目標產物的分子結構，從而導致產品分解[7]。

迄今為止，輻射自分解的機理并不明確，但可通過18F-FMISO分子結構進行解釋。在18F-FMISO分子中，18F-的電負性比碳原子大，18F-吸引電子的結構C—18F鍵之間的電子云密度偏向于18F-，碳原子帶有部分正電荷。因此與18F-相連的碳原子更容易被親核試劑進攻，由于連接18F的碳原子為伯碳原子，故易于發生SN2親核取代。

SN2親核取代反應的特點之一是反應速率與兩種反應物的濃度都相關，高活度的產品輻射分解產生更多的自由的質子、羥基和過氧化氫，從而加快18F-FMISO的輻射自分解。從表1可見，隨著產品活度的增大，產品經旋蒸處理后放化純度逐漸變低，活度的大小是影響18F-FMISO放化穩定性的第一因素，活度越大，單位時間內形成的質子、羥基、過氧化氫越多，對C—18F鍵破壞越嚴重。

SN2親核取代為吸收能量反應，當旋蒸加熱溫度超過C—18F鍵斷裂所需要能量時，加快了18F-FMISO的分解。實驗表明，將放化純度大于99%的18F-FMISO含乙腈的水溶液在80 ℃下加熱至溶劑蒸發完全(約用時6 min)后取樣進行HPLC分析，放化純度降低為91.3%。所以，在不加穩定劑的條件下，直接采用旋轉蒸發儀脫除分離產品溶液中的乙腈溶劑，會導致產品脫氟而放化純度無法達到使用要求。研究了較低溫度(50 ℃)下，不添加任何穩定劑，利用旋轉蒸發儀在高真空的作用下蒸發溶劑，300 s后轉出產品，立刻檢測放化純度，發現產品的放化純度依然小于95%，由此可以判斷，溫度是影響產品放化純度降低的重要因素。

2.3 18F-FMISO放化穩定劑的選擇

選擇抗壞血酸做穩定劑，在旋轉蒸發儀的梨形燒瓶中預先加入0.1 mL 100 g/L的抗壞血酸水溶液和1 mL無水乙醇。在HPLC分離出產品溶液進入旋轉蒸發儀的梨形燒瓶內，與抗壞血酸溶液和乙醇均勻混合后開始加熱，負壓下蒸發溶劑，80 ℃加熱80 s，再升溫至130 ℃加熱直至溶劑完全蒸發，加入10 mL生理鹽水溶解，得到產品后定時取樣進行放化純度分析，結果列于表2。

表2 添加抗壞血酸穩定劑條件下18F-FMISO放化純度與時間的關系

從表2可以看出，在抗壞血酸和乙醇共同存在下，加熱18F-FMISO的乙腈水溶液，穩定劑不僅沒有起到作用，相反產品的穩定性更加惡化，輻射自分解情況非常嚴重?？箟难岵贿m宜作為此合成工藝下的穩定劑，這與文獻[8]中抗壞血酸做為穩定劑的情形不符。表2中三批次產品的放化純度相差很大，這可能是由于旋蒸時加熱溫度不均，或操作者對干燥程度判斷差異引起的加熱時間長短不同所致。

Scott等[9]認為，正電子湮滅產生的高能射線引起水性介質產生了羥基自由基和活性氧，正電子示蹤劑的分解源于兩種物質的作用。并提出稀釋產品降低比活度的方法可以減緩正電子示蹤劑的分解速率而無法阻止其分解。他研究了抗壞血酸鈉做為穩定劑的優勢為對產品溶液的pH影響較小，缺點為用碘鉑酸鉀TLC點樣法，對產品進行K2.2.2含量檢測時，可能出現假陰性。

本工作選擇抗壞血酸鈉做為穩定劑，加入量與加入方法與抗壞血酸做穩定劑的實驗條件相同，結果列于表3。從表3可以看出，抗壞血酸鈉的加入，可以保護產品的放化穩定性，130 ℃加熱至溶劑揮發完全后放化純度大于98%，在6 h后放化純度仍然大于95%。

表3 添加抗壞血酸鈉穩定劑條件下18F-FMISO放化純度與時間的關系

聯合使用抗壞血酸和抗壞血酸鈉做為穩定劑，在旋轉蒸發儀的梨形燒瓶中預先加入0.05 mL 100 g/L的抗壞血酸水溶液、0.05 mL 100 g/L的抗壞血酸鈉水溶液和1 mL無水乙醇。負壓下蒸發溶劑，80 ℃加熱80 s，再升溫至130 ℃加熱直至溶劑完全蒸發，得到產品后定時取樣進行HPLC分析，測得放化純度為80.5%。

表4為pH值對18F-FMISO放化穩定性的影響。由表4可見，pH值是影響18F-FMISO放化穩定性的另一因素，18F-FMISO在中性及弱堿性體系內穩定，而在酸性體系內穩定性差。

表4 pH值對18F-FMISO放化穩定性的影響

2.4 18F-FMISO的純度檢測

用5 mL注射用水溶解1 mg標準品19F-FMISO，以微量進樣器吸取20 μL進行HPLC檢測，結果示于圖6。由圖6可知，標準品19F-FMISO的保留時間為6.097 min。在相同的條件下進行18F-FMISO的HPLC放射性檢測，結果示于圖7。如圖7所示，18F-FMISO的保留時間為6.109 min，F-的保留時間為2.848 min，產品18F-FMISO的保留時間和標準品19F-FMISO的保留時間基本一致。圖8為HPLC法檢測18F-FMISO的化學純度曲線。由圖8可知，保留時間為2.743 min的紫外吸收峰為抗壞血酸鈉；6.115 min為產品18F-FMISO的吸收峰，但成品溶液中18F-FMISO的化學含量非常低。

圖6 HPLC法檢測19F-FMISO標準品的UV曲線

圖7 18F-FMISO的放化純度檢測曲線

圖8 HPLC法檢測18F-FMISO的化學純度曲線

用薄層色譜法檢測產品的放化純度，結果示于圖9。F-的放射性峰在原點，產品18F-FMISO的Rf=0.575 min，放化純度大于95%。

圖9 薄層色譜法檢測18F-FMISO的放化純度

3 結 論

(1)回旋加速器生產出的18F-經QMA柱捕獲后由K2CO3和K2.2.2的混合溶液淋洗，經兩次干燥除水后加入乙腈溶解的前體NITTP，在完全密閉加熱下進行氟化取代反應，冷卻后加鹽酸水解去除保護基團，再以緩沖溶液中和反應體系，用半制備HPLC以V(乙腈)∶V(水)=15%∶85%為流動相進行產品分離，將產品溶液轉入預先加入抗壞血酸鈉的梨形燒瓶內，加熱脫除溶劑，最后加入生理鹽水溶解，過0.22 μm無菌濾膜得到18F-FMISO產品。引起18F-FMISO分解有三個主要因素：活度、溫度和pH。18F-FMISO穩定性與活度、溫度成反相關；在中性及弱堿性溶液中穩定，在弱酸性溶液中容易分解。

(2)采用抗壞血酸鈉做為穩定劑，80 ℃加熱80 s后升溫至130 ℃下加熱至溶劑完全蒸發，產品能保持良好的放化穩定性，6 h后放化純度依然大于95%。通過旋蒸處理，產品中只含有微量的乙醇、乙腈溶劑，毒副作用小。合成時間50 min，不校正合成效率EOS=(45±5)%(n=20)，整個過程由合成模塊全自動合成，無需人為干預，滿足18F-FMISO的實驗和臨床應用需求。