牛肌紅蛋白熱加工過程中多肽穩定性影響因素分析及其在真實性鑒別中的應用

李瑩瑩，康超娣，張穎穎，趙文濤，李家鵬，李慧晨，王守偉

（北京食品科學研究院，中國肉類食品綜合研究中心，北京 100068）

食品欺詐已成為食品質量和安全領域中較為顯著的問題[1-2]。尤其是以肉類為主的高附加值的高度加工食品，屬于摻假風險較高的一類食品。隨著消費者的廣泛關注以及摻假鑒別技術的涌現，摻假手段不斷翻新且越來越隱蔽，通過特定的加工處理，如高溫高壓，或是添加輔料及添加劑（如鹽、辣椒、防腐劑等）用于增強風味，遮蔽原有味道[3-4]，使得無法從外觀識別物種形態[5-6]，或采用廉價肉類代替高價肉類以達到摻假的目的[7]。食品摻雜摻假現象不僅侵犯了消費者的利益，而且破壞了食品市場的秩序和食品安全質量監管[8-9]，甚至危害了消費者的身體健康，在某種程度上還會引發宗教問題[10-11]。因此，建立快速、高效、準確的摻假鑒別方法對于保障食品安全具有重要意義。

蛋白質組學以蛋白質為研究對象，具有高選擇性、高通量和全面性等特點，可對一個基因組或組織、細胞全部的蛋白質進行鑒定和分析[12-13]，基于蛋白質組學的質譜方法作為一種新興的方法是目前食品鑒偽的熱點[14-15]。該技術將篩選的各物種靶標多肽作為分析目標[16]，不但可以實現對肉類成分的鑒別[17]，而且可以實現植物、動物的多物種同時鑒別，尤其適用于非常復雜和高度加工的食品基質[18-19]，是一種快速、靈敏、特異以及高通量判別方法[20]，能夠滿足當前監管的需要，具有廣泛的應用價值。

靶標多肽的選擇是構建質譜方法的關鍵所在[21]，當前研究多是通過對比生肉和熟肉制品尋找穩定蛋白，進而篩選出肉制品中更穩定的多肽[22-23]，比如Montowska等[23]利用蛋白質二維電泳圖譜對比了豬、牛、雞、驢、鴨、鵝的生肉與加熱處理的熟肉，發現血清白蛋白、載脂蛋白B、熱休克蛋白27（heat shock protein 27，HSP27）、心型脂肪酸結合蛋白（heart-type fatty acid binding protein，H-FABP）等加熱前后有很大差別；Sarah等[24]對豬肉分別進行100 ℃煮沸30 min、121 ℃高溫高壓滅菌20 min以及4 ℃冷藏30 min，對比發現這3 種處理的豬肉蛋白有4 條多肽始終存在，可以作為豬肉穩定性特異標記物。在前期研究中發現經過高度加工的肉制品靶標多肽響應值和生肉相比明顯下降[25]，但對加工環節靶標多肽穩定性的影響因素缺少系統性研究。

Giaretta等[26]研究發現牛肌紅蛋白的穩定性良好，可以用作牛的特異性標記物。該蛋白共有154 個氨基酸殘基，按照胰蛋白酶酶切位點可獲得13 條多肽，覆蓋了短肽鏈、中肽鏈、長肽鏈，同時既有牛的獨有肽段（肽段7#），也有和豬、馬等其他物種共同具有的肽段。

本實驗在前期研究的基礎上，以牛肌紅蛋白酶解的多肽和來自于8 種不同蛋白的多肽為研究對象，探討各條多肽在熱加工環節中穩定性的變化規律，從加工方式、加工環節的化學因素中提取出對多肽穩定性影響較大的因素，包括加工方式（蒸煮、油炸、高壓）、加熱溫度及時間、輔料（氯化鈉添加量、辣椒素含量）、食品添加劑（以亞硝酸鈉、山梨酸為代表的防腐劑）、金屬離子（K+、Ca2+、Mg2+），研究各個因素對目標蛋白及多肽豐度的影響，為進一步選擇熱穩定性強的靶標多肽用于肉類的真實性鑒別提供理論依據，并為其他蛋白及多肽在研究熱加工過程中的影響因素提供新思路。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

生鮮牛肉由河北省福成五豐食品股份有限公司燕郊養殖分公司提供。

胰蛋白酶（測序級）、二硫蘇糖醇（生化級） 美國Promega公司；碘乙酰胺（生化級） 美國Sigma公司；甲酸、乙酸、乙腈（均為色譜純） 德國CNW科技公司；HLB固相萃取柱 美國Waters公司；尿素、硫脲、鹽酸均為國產分析純。

1.2 儀器與設備

TSQ ultra EMR 液相色譜-串聯質譜（liquid chromatography tandem mass spectrometry，LC-MS/MS）聯用儀（配有電噴霧離子源、TraceFinder 4.1數據處理系統）美國Thermo Fisher公司；往返式水浴恒溫搖床 上海智誠分析儀器制造有限公司；Ultra-Turrax T25均質器德國IKA公司；20PR-520離心機 日本Hitachi公司；MLS-3020高壓鍋 日本SANYO公司。

1.3 方法

1.3.1 牛肉的處理

將牛肉切成4 cm×4 cm×2 cm規格的小塊，對其進行蒸煮、油炸、高壓和添加添加劑、輔料、金屬離子處理。

蒸煮處理：取18 塊切好的牛肉小塊，隨機分成6 組（第1組：60 ℃、5 min，第2組：100 ℃、5 min，第3～6組：80 ℃分別加熱5、10、15、30 min），加熱后取出，冷卻至室溫，每組3 個平行，進行加熱時間和加熱溫度的單因素試驗。

油炸處理：取3 塊切好的牛肉小塊，放入100 ℃恒溫油炸鍋內，油炸5 min后，取出冷卻至室溫。

高壓處理：取3 塊切好的牛肉小塊，放入高壓滅菌鍋內，121 ℃、15 MPa高壓處理15 min，取出冷卻至室溫。

添加添加劑處理：取18 塊切好的牛肉小塊，隨機分成6 個組，加入山梨酸（添加量分別為20、45、75 mg/kg）和亞硝酸鈉（添加量分別為10、30、50 mg/kg）。添加后靜置30 min，均質待測。

添加輔料處理：取18 塊切好的牛肉小塊，隨機分成6 個組，分別加入氯化鈉（添加量分別為0.015、0.025、0.035 g/kg）和辣椒素（添加量分別為0.005、0.01、0.02 g/kg）。添加后靜置30 min，均質待測。

添加金屬離子處理：取27 塊切好的牛肉小塊，隨機分成9 個組，每組3 個平行。金屬離子為K+（KCl）、Ca2+（CaCl2）和Mg2+（MgCl2），均分別設置3 種不同濃度（10、50、250 mmol/L），添加后靜置30 min，均質待測。

1.3.2 多肽的LC-MS/MS分析

參照前期研究中樣品制備的前處理方法獲得多肽，通過LC-MS/MS方法實現對特征性多肽的分析[27]。將牛肌紅蛋白按照胰蛋白酶的理論酶解方式得到的13 條多肽鏈導入至Skyline軟件中，從而得到每個多肽鏈的離子對信息，將離子對導入至LC-MS/MS中，對13 條多肽進行檢測，通過對比離子保留時間、峰面積、峰形、離子比率等條件，篩選可用于LC-MS/MS分析的多肽離子信息。去掉5 種響應值低的多肽，本研究選擇來自牛肌紅蛋白的肽段1#～8#，以及來自于半乳凝集素-1、肌球蛋白輕鏈3、NAD-3-磷酸甘油脫氫酶、血清白蛋白、肌球蛋白-2、L-乳酸脫氫酶A鏈、肌球蛋白-1和α-1,4-葡聚糖磷酸化酶這8 種蛋白的肽段9#～18#作為研究對象。利用TraceFinder軟件進行數據處理，對各個樣品進行多重反應監測模式（multiple reaction monitoring，MRM）掃描，詳細的離子對信息見表1。

表1 牛肌紅蛋白和其他蛋白的MRM采集參數Table 1 MRM MS instrument parameters for bovine myoglobin and other proteins

1.3.3 驗證性實驗

為了進一步驗證所篩選的多肽在實際物種鑒別中的適用性，市購11 種不同的牛肉制品進行檢測。

1.4 數據統計與分析

每批實驗進行3 個平行，通過對比不同處理條件下每個多肽定量離子的峰面積，運用統計學分析手段進行數據分析，采用SPSS 21.0軟件對數據進行單因素方差分析及最小顯著性差異法多重比較，以進行差異顯著性分析（P＜0.05），實驗結果均以平均值±標準差表示，最終篩選出對多肽影響比較顯著的條件。

2 結果與分析

2.1 加熱條件對多肽穩定性的影響

2.1.1 加熱方式對多肽穩定性的影響

表2 蒸煮、油炸和高壓對多肽穩定性的影響Table 2 Effect of boiling, frying, and high pressure processing on the stability of peptides

由表2可知，經不同加熱方式處理后，肽段1#、肽段2#、肽段3#和肽段6#響應值均無顯著變化（P＞0.05），說明在蒸煮、油炸和高壓處理條件下這4 種多肽較穩定，且肽段2#在這3 種加熱方式處理下響應值均較高，而肽段4#、肽段5#、肽段7#和肽段8#響應值在經這3 種加熱方式處理后均具有顯著性變化，說明這4 種多肽穩定性較弱。綜上所述，不同加熱方式對牛肌紅蛋白中的多肽穩定性具有不同程度的影響，說明加熱方式是影響多肽穩定的重要原因之一。

2.1.2 加熱溫度對多肽穩定性的影響

表3 不同溫度加熱5 min對多肽穩定性的影響Table 3 Effect of heating temperature on the stability of peptides

由表3 可知，經6 0、8 0 ℃和1 0 0 ℃處理5 m i n后，牛肌紅蛋白酶解后的多肽響應值均無顯著差異（P＞0.05），結果表明，不同加熱溫度處理對牛肌紅蛋白中多肽穩定性均無影響。

2.1.3 加熱時間對多肽穩定性的影響

表4 80 ℃條件下加熱時間對多肽穩定性的影響Table 4 Effect of heating time on the stability of peptides at 80 ℃

由表4可知，在80 ℃條件下，5～30 min時，隨著加熱時間的延長，肽段1#、肽段2#、肽段3#、肽段4#、肽段5#、肽段7#和肽段8#響應值均無顯著變化（P＞0.05），表明在80 ℃條件下不同加熱時間對這7 種多肽的穩定性無影響，且肽段2#在80 ℃不同加熱時間下響應值均較高。Wang Guiji等[28]對5 種肉類類型（豬肉、雞肉、鴨肉、牛肉和羊肉）分別進行100 ℃煮沸3 min和5 min、150 ℃燒烤7 min和10 min以及180 ℃燒烤5 min和8 min，結果表明，加工溫度和時間對多肽的穩定性無顯著影響，本研究結果與其一致。

2.2 加工因子對多肽穩定性的影響

2.2.1 添加劑對多肽穩定性的影響

由表5和表6可知，添加不同劑量的山梨酸和亞硝酸鈉后，肽段1#、肽段3#、肽段5#、肽段6#和肽段8#的響應值均無顯著變化（P＞0.05），說明添加山梨酸和亞硝酸鈉對這5 種多肽穩定性均無影響。添加不同劑量山梨酸（20、45、75 mg/kg）后，僅肽段7#的響應值發生顯著性變化。添加不同劑量亞硝酸鈉（10、30、50 mg/kg）后，僅肽段2#和肽段4#響應值發生不同程度變化。以上結果表明，山梨酸和亞硝酸鈉并非是影響多肽穩定性的主要因素。

表5 山梨酸添加量對多肽穩定性的影響Table 5 Effect of sorbic acid content on the stability of peptides

表6 亞硝酸鈉添加量對多肽穩定性的影響Table 6 Effect of sodium nitrite content on the stability of peptides

2.2.2 輔料對多肽穩定性的影響

表7 氯化鈉添加量對多肽穩定性的影響Table 7 Effect of sodium chloride content on the stability of peptides

由表7 可知，添加不同劑量的氯化鈉后，肽段2#、肽段3#、肽段4#和肽段6#響應值均無顯著變化（P＞0.05），且肽段2#的響應值最高，說明肽段2#最穩定，而肽段1#、肽段5#、肽段7#和肽段8#響應值均發生變化，說明添加氯化鈉對多肽穩定性影響較大。

由表8可知，添加不同劑量的辣椒素后，僅肽段3#和肽段7#響應值發生不同程度變化，肽段2#響應值最高且添加不同劑量辣椒素后無顯著差異。以上結果表明，添加氯化鈉可能是影響多肽穩定性的主要因素之一。

表8 辣椒素添加量對多肽穩定性的影響Table 8 Effect of capsaicin content on the stability of peptides

2.2.3 金屬離子對多肽穩定性的影響

表9 K濃度對多肽穩定性的影響Table 9 Effect of K+content on the stability of peptides

表9 K濃度對多肽穩定性的影響Table 9 Effect of K+content on the stability of peptides

肽段編號 峰面積（×106）10 mmol/L 50 mmol/L 250 mmol/L肽段1# 1.723±0.230 1.593±0.045 1.607±0.036肽段2# 9.358±1.548 8.867±0.724 8.846±0.658肽段3# 1.583±0.179 1.479±0.003 1.410±0.111肽段4# 2.365±0.127 2.420±0.057 2.412±0.003肽段5# 1.310±0.057 1.222±0.062 1.000±0.313肽段6# 0.212±0.014 0.199±0.003 0.180±0.030肽段7# 0.531±0.040 0.544±0.008 0.476±0.016肽段8# 3.027±0.258 2.837±0.035 2.646±0.109

表10 Ca2濃度對多肽穩定性的影響Table 10 ffect of Ca2+content on the stability of peptides

表10 Ca2濃度對多肽穩定性的影響Table 10 ffect of Ca2+content on the stability of peptides

肽段編號 峰面積（×106）10 mmol/L 50 mmol/L 250 mmol/L肽段1# 1.508±0.072 1.356±0.156 1.494±0.219肽段2# 8.325±0.275 8.047±0.096 8.085± 0.160肽段3# 1.358±0.049 1.343±0.184 1.369± 0.201肽段4# 2.071±0.232 2.084±0.050 1.871± 0.196肽段5# 1.213±0.141a 0.990±0.065ab 0.781±0.028b肽段6# 0.183±0.002 0.173±0.015 0.173± 0.014肽段7# 0.472±0.010 0.504±0.056 0.472± 0.036肽段8# 2.587±0.084 2.508±0.455 2.524± 0.360

表11 Mg2濃度對多肽穩定性的影響Table 11 ffect of Mg2+content on the stability of peptides

表11 Mg2濃度對多肽穩定性的影響Table 11 ffect of Mg2+content on the stability of peptides

肽段編號 峰面積（×106）10 mmol/L 50 mmol/L 250 mmol/L肽段1# 1.507±0.122a 1.486±0.048a 1.770±0.041b肽段2# 7.746±0.822 7.971±0.431 9.441±0.227肽段3# 1.257±0.244 1.271±0.036 1.544±0.016肽段4# 2.107±0.089 1.949±0.236 2.491±0.110肽段5# 1.157±0.044a 1.058±0.028ab 1.002±0.021b肽段6# 0.184±0.016a 0.185±0.005a 0.228±0.002b肽段7# 0.452±0.043a 0.469±0.015a 0.538±0.007b肽段8# 2.478±0.425 2.667±0.114 2.906±0.017

由表9可知，添加不同濃度的KCl后，牛肌紅蛋白中的多肽穩定性均無顯著變化（P＞0.05）。添加不同濃度的CaCl2后，僅肽段5#響應值發生變化（表10）。添加不同濃度的MgCl2后，肽段1#、肽段5#、肽段6#和肽段7#響應值均發生顯著性變化（表11），說明Mg2+影響這4 種多肽的穩定性；此外，肽段2#在不同金屬離子（K+、Ca2+和Mg2+）濃度下的響應值均最高且無顯著性變化，說明穩定性較好。綜上，Mg2+可能是影響多肽穩定性的主要因素之一。

2.3 不同因素對來源于其他蛋白的多肽穩定性的影響

上述研究結果表明，加熱方式、氯化鈉和Mg2+顯著影響牛肌紅蛋白中多肽的穩定性，因此為了驗證加熱方式、輔料、添加劑和Mg2+對多肽熱穩定性的影響規律，本實驗選用來源于其他蛋白（表1）的多肽再次研究加工過程中重要因素（加熱方式、氯化鈉和Mg2+）對多肽的影響。

2.3.1 加熱方式對其他來源多肽穩定性的影響

表12 蒸煮、油炸和高壓對其他來源多肽穩定性的影響Table 12 Effect of boiling, frying, and high pressure processing on the stability of peptides from other proteins

由表12可知，經蒸煮（100 ℃）、油炸和高壓3 種加熱方式處理后，肽段9#、肽段11#、肽段12#、肽段15#、肽段16#和肽段17#響應值發生顯著性變化，說明這6 種多肽在蒸煮、油炸和高壓3 種處理條件下的穩定性較弱，而肽段10#、肽段13#、肽段14#和肽段18#響應值未發生顯著變化（P＞0.05），說明這4 種多肽較穩定，且肌球蛋白-2的肽段13#在這3 種加熱方式處理下響應值均較高，說明肽段13#穩定性最強。綜上所述，對來源于不同蛋白的多肽而言，加熱方式也是影響其穩定性的重要因素。

2.3.2 氯化鈉對其他來源多肽穩定性的影響

由表13可知，添加不同劑量的氯化鈉后，肽段10#、肽段11#、肽段13#、肽段16#和肽段18#響應值均無顯著變化（P＞0.05），且肌球蛋白-2的肽段13#響應值較高，說明肌球蛋白-2的肽段13#最穩定，而肽段9#、肽段12#、肽段14#、肽段15#和肽段17#響應值均發生顯著變化，說明添加氯化鈉影響多肽穩定性。結果表明，添加氯化鈉也是影響多肽穩定性的主要因素之一。

表13 氯化鈉添加量對其他來源多肽穩定性的影響Table 13 Effect of sodium chloride content on the stability of peptides from other proteins

2.3.3 Mg2+濃度對其他來源多肽穩定性的影響

表14 Mg2＋濃度對其他來源多肽穩定性的影響Table 14 Effect of Mg2+content on the stability of peptides from other proteins

由表14可知，添加不同劑量的MgCl2后，肽段11#、肽段14#、肽段15#、肽段16#和肽段18#響應值均發生顯著性變化，說明Mg2+影響多肽穩定性。由上述結果可知，對來源于不同蛋白的多肽而言，加熱方式、氯化鈉和Mg2+顯著影響多肽的穩定性，肌球蛋白-2的肽段13#在3 種加熱方式、添加氯化鈉及Mg2+條件下的響應值均最高，且在相同處理方式不同組別之間無顯著差異，說明肽段13#易被質譜檢測，響應值最高，穩定性高，且是獨有多肽（表1），Orduna等[29]建立了一種高分辨率軌道離子阱質譜方法來確定肉類真偽，同樣發現肌球蛋白-2可用于肉類的真實性鑒定，但研究對象僅限于生肉樣品。本研究通過熱加工過程處理后的結果發現來源于肌球蛋白-2的肽段13#用于肉制品真實性鑒別的優勢也更為顯著。

2.4 多肽的物理化學性質

牛肌紅蛋白中的多肽（肽段1#～8#）和來源于不同蛋白的多肽（肽段9#～18#）的物化性質見表15。借助多肽計算器（http://www.chinapeptides.com/tool.aspx）對多肽分析，序列分析顯示出這些多肽的分子質量、等電點、凈電荷和親水殘基比例存在差異，但這些差異并不是影響多肽響應值較高的主要因素。肽段2#是疏水性氨基酸的疏水性多肽，但本研究表明肽段2#易被質譜系統檢測，具有較強的響應值且非常穩定，這可能與氨基酸組成、多肽結構及質譜系統檢測參數有關。來源于肌球蛋白-2的肽段13#是親水性氨基酸組成的親水性多肽，其溶解性較好，經熱加工過程等多種因素處理后易被質譜系統檢測，其響應值均較高，穩定性強，這可能取決于多肽結構。據報道肉經腌制、蒸煮、燒烤、干燥、煙熏、殺菌等工藝處理后，會導致蛋白質變性，其構象、分子作用力、三維結構等發生一系列的變化，但肽段的氨基酸序列（蛋白質的一級結構）受影響較小[30-31]，考慮到開展真實性鑒別，需要選擇物種的特異性多肽，結合表2可知，來源于肌球蛋白-2的肽段13#作為肉制品樣品摻假檢測所選的特征多肽優勢更為顯著。

表15 多肽的物理化學性質Table 15 Physicochemical properties of peptides

2.5 真實性鑒別中的應用

采用本研究方法對11 種類型的市售牛肉制品樣品進行鑒別（表16），其中5號樣品五香牛肉干的主成分雖然標稱是牛肉，但所有多肽都未檢出，可見此樣品為摻假樣品，其余的10 件產品均含有牛肉成分。對來源于牛肌紅蛋白的肽段1#～8#而言，其余10 件牛肉制品樣品的肽段1#、2#、3#和8#響應值較高，且肽段2#的響應值相對最高；對來源于不同蛋白的肽段9#～8#而言，其余10 件牛肉制品樣品的肽段13#響應值總體考慮相對較高；因此，本研究結果選擇穩定性較強的靶標多肽（牛肌紅蛋白中肽段2#和來源于肌球蛋白-2的肽段13#）用于牛肉制品真實性鑒別中具有廣闊的應用價值。

表16 選擇的肽段在市售牛肉制品樣品的鑒別應用Table 16 Application of selected peptides in the identification of commercially available beef products in markets

3 結 論

本研究針對牛肌紅蛋白熱加工過程中多肽穩定性影響因素進行初步研究，探討加熱條件和加工因子對多肽穩定性的影響規律，同時對市售牛肉制品進行真實性鑒別。通過研究加熱方式（蒸煮、油炸、高壓）、加熱溫度及時間、輔料（氯化鈉添加量、辣椒素含量）、食品添加劑（防腐劑代表亞硝酸鈉、山梨酸）、金屬離子（K+、Ca2+、Mg2+）對各條多肽穩定性的影響，結果表明：加熱方式、氯化鈉和Mg2+是影響多肽穩定性較顯著的重要因素，加熱溫度、加熱時間、添加劑、辣椒素和K+、Ca2+對多肽穩定性的影響較小；在相同處理條件下，通過對來源于不同蛋白的多肽的驗證實驗結果可知，加熱方式、氯化鈉和Mg2+添加量也均顯著影響多肽的穩定性。經熱加工等不同條件處理后，結果發現牛肌紅蛋白中肽段2#和來源于肌球蛋白-2的肽段13#易被質譜系統檢測，且均具有響應較強的峰值，非常穩定。綜合考慮，肽段13#作為肉制品樣品摻假檢測所選的特征多肽優勢更為顯著。本研究探討了多肽在熱加工環節中穩定性的影響因素，為肉制品加工過程中熱穩定多肽的選擇提供了理論依據，進而為深加工肉制品真實性鑒別提供了技術支持。