多糖對腫瘤細胞自噬調控作用的研究進展

徐涵禹，李雨婷，金周雨,，宋 慧,2,

（1.吉林農業大學生命科學學院，吉林 長春 130118；2.吉林農業大學 教育部食藥用菌工程研究中心，吉林 長春 130118）

多糖作為生物大分子物質與蛋白質、核苷酸等共同在生物體的生長發育中有極其重要的作用，多糖具有調節免疫系統、抑制腫瘤細胞的生長、使腫瘤細胞周期阻滯并誘導其發生細胞凋亡[1]、抗心血管的生成和轉移[2-3]等方面的作用。目前，多糖因其高效率和低毒性的特點，已成為醫藥科學領域研究的重點。

自噬是一種細胞程序性死亡機制，類似于細胞凋亡和壞死，調節細胞發生自噬性死亡[4]，其在進化上是一種高度保守的自我降解過程，在細胞應激反應及存活中起到關鍵作用[5]。細胞自噬是在細胞內基因表達調控下進行的一種主動過程[6-7]。自噬在人體健康和疾病中的重要性得到了更廣泛的關注，其中尤為重要的是自噬在癌癥中的作用[8]。本文將圍繞多糖對腫瘤細胞自噬的影響展開綜述。

1 細胞自噬

1.1 自噬的過程

細胞自噬是指細胞在外界因素的影響下，對其內部受損的細胞器、錯誤折疊的蛋白質和侵入機體的病原體進行降解的生物學過程[9]。根據胞內物質運送至溶酶體內的途徑不同，將自噬分為巨自噬、微自噬[10]及分子伴侶介導的自噬[11]。巨自噬是在即將發生自噬的細胞質中出現大量游離的膜性結構，這些膜性結構逐漸包裹受損的蛋白質和細胞器，形成獨立有核的囊狀結構并逐漸延伸成為自噬囊泡，然后自噬囊泡邊緣融合形成自噬小體，隨后自噬小體與溶酶體融合形成自噬溶酶體，最后降解所包裹的內容物的過程[12]；微自噬包含兩種自噬方式，分別為選擇性微自噬和非選擇性微自噬，選擇性微自噬是指特定細胞器直接靶向作用于溶酶體來介導自噬，非選擇性微自噬是通過管狀膜內陷到溶酶體中直接吞噬細胞器及其組分介導自噬；分子伴侶介導的自噬是一種選擇性自噬形式，涉及熱休克蛋白70復合物和溶酶體膜相關蛋白2A的多聚化[13-14]。目前有關自噬的研究中，巨自噬相較于微自噬和分子伴侶介導的自噬報道較多。

1.2 腫瘤細胞自噬

自噬是一種存在于正常細胞中的生理過程，自噬失調會產生各種疾病，如神經退行性疾病[15]、感染性疾病[16]、血管疾病、免疫系統疾病[17]和癌癥[18]。機體饑餓，缺氧及缺乏能量的情況下，自噬又是一種重要的細胞存活機制[19]。Aita等[20]在自噬與腫瘤發生的研究中發現，自噬相關基因Beclin-1缺失的小鼠發生了原發性腫瘤，隨后在乳腺癌、卵巢癌、前列腺癌中也發現了有等位基因Beclin-1缺失的現象，使用熒光探針鑒定出22 個乳腺癌細胞系存在9 個等位基因Beclin-1的缺失。自噬過程是動態變化的，并可以在不同組織細胞中以不同的速率發生，自噬體的形成、自噬性底物向溶酶體的運送以及在溶酶體內降解的整個過程稱為自噬流。研究表明，隨著在腫瘤細胞生長時間的延長，自噬流可能會隨著腫瘤生長量的上調或下調[21]，產生兩種完全不同的自噬狀態。

一方面，有研究發現自噬上調會促進癌細胞死亡，Arcella等[22]在使用雷帕霉素誘導自噬從而使小鼠膠質母細胞瘤細胞減小的實驗中證明，雷帕霉素誘導的自噬上調可以延長小鼠的存活時間并使腫瘤的體積變小；Zhou Chunxian等[23]在自噬影響結直腸癌細胞生長的實驗中也證明了自噬相關蛋白（autophagy-related protein，Atg）基因5（Atg5）的上調，誘導結直腸癌細胞死亡。Liu Guoke等[24]發現自噬可以促進癌細胞存活并增加對化療藥物的耐藥性。另一方面，有研究發現抑制腫瘤細胞自噬，可以減少腫瘤細胞的生長，使細胞凋亡數增加，Jin Fangfang等[25]研究結果表明，抑制自噬的表達可以促進細胞凋亡并增強肝癌細胞對化療的敏感性；使用氯喹或通過下調Atg7抑制自噬可以促進細胞凋亡，進而誘導細胞死亡[26]。因此，癌癥治療中是否應該增強自噬[27-28]是值得深入探討的問題。后文將圍繞信號通路闡述自噬的形成過程及多糖對自噬的調控作用。

2 多糖調控自噬相關信號通路

多糖對自噬相關機制的研究主要集中在磷脂酰肌醇3激酶（phosphatidylinositol 3 kinase，PI3K）/蛋白激酶B（protein kinase B，AKT）/哺乳動物雷帕霉素靶蛋白（mammalian target of rapamycin，mTOR）、絲裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK）和腺苷一磷酸激活蛋白激酶（adenosine-monophosphateactivated protein kinase，AMPK）等信號通路，在自噬起始步驟中，Atg1/Unc-51樣激酶1（Unc-51-like kinase 1，ULK1）、Atg13基因及分子質量為200 kDa的黏著斑激酶家族相互作用蛋白（focal adhesion kinase family interacting protein of 200 kDa，FIP200）激酶復合物被mTOR蛋白復合體1（mTORC1）抑制及腺苷一磷酸（adenosine monophosphate，AMP）依賴的AMPK、PI3K/AKT、p38 MAPK激活。在自噬的成核步驟中，ULK1復合物磷酸化并激活Beclin-1/囊泡蛋白分揀（vesicle protein sorting，VPS）4復合物。該復合物包括Beclin-1、VPS34、PI3K、VPS15、Atg14和自噬Beclin-1調節因子1（activating molecule in Beclin-1 regulated autophagy，AMBRA-1），起始蛋白和成核蛋白均促進自噬囊泡膜的形成。這種膜可以來自線粒體、質膜或內質網[29]。在成熟步驟中，自噬體形成需要兩個獨特的蛋白質偶聯事件：1）Atg7和Atg10結合至Atg5和Atg12；2）Atg7、Atg3和Atg1與輕鏈3（light chain 3，LC3）共軛結合[30-31]。Atg5-Atg12結合物與自噬相關16樣蛋白1（Atg 16-like 1，Atg16L1）形成復合物，Atg5-Atg12-Atg16L1復合物錨定在VPS34上，通過含有多個保守的WD基元的蛋白質重復結構域，與磷酸肌醇（phosphatidylinosito-2b，WIPI-2b）相互作用產生新的自噬體膜。自噬相關信號通路指示圖如圖1所示。

圖1 自噬相關信號通路指示圖Fig. 1 Autophagy-related signaling pathways

2.1 多糖調控PI3K/AKT/mTOR信號通路

PI3K/AKT/mTOR信號通路的機制靶標參與細胞生長、增殖與分化、凋亡與自噬，并在腫瘤的發生、發展及治療中起著至關重要的作用。PI3K刺激信號級聯產生磷脂酰肌醇三磷酸并促進AKT的激活；AKT是抑制細胞凋亡促進細胞存活的相關蛋白；mTOR激酶是吞噬誘導過程中的關鍵分子，磷酸化AKT作用于mTOR，激活mTOR通路，這些作用能增強細胞增長的蛋白質表達。PI3K/AKT/mTOR信號通路的調節可以增強或抑制自噬。這條通路是癌癥治療的關鍵靶點，因為它可以作為許多生長刺激的匯聚點，通過其下游底物控制改善癌癥發生和維持的細胞穩態的過程[32]。

黃芪多糖抑制白細胞介素（interleukin，IL）-1β刺激的RSC-364細胞中PI3K/AKT/mTOR信號傳導途徑的激活，并通過調節PI3K/AKT/mTOR自噬途徑在IL-1β刺激的成纖維細胞樣滑膜細胞中發揮促凋亡和抗炎作用來降低類風濕性關節炎的病理進展[33]。白靈菇多糖（Pleurotus ferulae Lanzi polysaccharide，PN50G）抑制PI3K/AKT磷酸化進而抑制mTOR的活化。體內對攜帶腫瘤的小鼠進行成像，結果表明PN50G能夠顯著增加細胞內活性氧（reactive oxygen species，ROS）水平。此外，它表明PN50G以劑量依賴性方式提高Beclin-1和LC3的蛋白表達量。即PN50G介導的A549腫瘤細胞自噬主要通過PI3K/AKT/mTOR通路發揮作用[34]。枸杞多糖預處理大大減弱了原代培養的海馬神經元中的氧葡萄糖剝奪/再灌注（oxygen-glucose deprivation/reperfusion，OGD/R）損傷，增加了OGD/R后的p-AKT和p-mTOR水平，即枸杞多糖通過激活PI3K/AKT/mTOR信號傳導途徑來保護原代海馬神經元中的OGD/R誘導的神經元損傷[35]。枸杞多糖處理也可誘導人類血管瘤內皮細胞凋亡，抑制增殖細胞核抗原、腫瘤增殖抗原、血管內皮生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）、血管內皮細胞生長因子受體2（VEGF receptor 2，VEGFR2）和PI3K/AKT信號通路蛋白的表達[36]。

2.2 多糖調控p38 MAPK信號通路

MAPK參與控制細胞因子和應激細胞反應的信號級聯反應。p38 MAPK途徑是轉錄和翻譯水平的促炎細胞因子生物合成的關鍵調節劑，其使得該途徑的不同組分成為治療自身免疫和炎性疾病的潛在靶標。MAPK通路是細胞增殖、分化、炎癥、凋亡和自噬等信號轉導通路的共同交匯通路之一。

有研究發現脂多糖在小膠質細胞中觸發p 3 8 α MAPK依賴的ULK1磷酸化。該磷酸化抑制ULK1活性，阻止其與下游效應因子Atg13結合，并減少小膠質細胞中的自噬[37]。黃芪多糖聯合10-羥基喜樹堿（10-hydroxycamptothecin，HCPT）對各種腫瘤細胞具有顯著的抗腫瘤活性[38]，包括肺癌細胞、人神經細胞瘤細胞、DU145-TxR前列腺癌細胞、肝癌細胞、口腔鱗狀細胞癌和乳腺癌細胞等。已經發現HCPT在體外抑制H1299細胞中的促分裂原活化蛋白激酶3（mitogenactivated protein kinase 3，MAP4K3）活性和Thr389位點處的核糖體S6K蛋白磷酸化。但是，HCPT是否能夠在H1299細胞中誘導自噬尚待闡明。因此，評估了自噬相關蛋白（LC31/2和P62）的表達，并證明了并通過破壞MAP4K3/mTOR信號轉導S6K誘導了H1299細胞的自噬[39]。從金針菇中分離的多糖（Flammulina velutipes polysaccharide，WFVP-N-b1）被Toll樣受體4（Toll-like receptor 4，TLR4）識別，促進了MAPK和AKT的磷酸化，促進核因子κB（nuclear factor kappa-B，NF-κB）p65亞基的核轉位和NF-κB的抑制蛋白（inhibitor of NF-κB，IκB）的降解。使用自噬抑制劑（bafilomycin A1，Baf-A1）阻斷WFVP-N-b1誘導的自噬進而降低了巨噬細胞的活化。表明WFVP-N-b1激活巨噬細胞是通過自噬途徑介導的，這是第一份報道自噬介導異半乳聚糖誘導巨噬細胞活化的研究。總地來說，WFVP-N-b1通過MAPKs、AKT/NF-κB信號通路使TLR4受體激活RAW264.7細胞[40]。Erk和p38 MAPK在保護枸杞多糖免受電刺激誘導的細胞損傷方面發揮了多種作用。枸杞多糖通過調節自噬和MAPK途徑改善雙極脈沖電流誘導的小膠質細胞（BV-2）損傷[41]。通過自噬雙標腺病毒共定位分析發現靈芝多糖在CRC細胞中阻斷了自噬體和溶酶體融合，證明了GLP誘導的自噬體積聚和凋亡是通過MAPK/Erk活化介導的。靈芝多糖抑制腫瘤生長并且還抑制體內自噬通量。這些結果揭示了靈芝多糖抗腫瘤作用的新分子機制，表明靈芝多糖是一種有效的自噬抑制劑，可能在腫瘤治療中起重要作用[42]。

2.3 多糖調控AMPK信號通路

AMPK已被廣泛證明是一種在各種代謝應激下起作用的重要代謝調節因子，其中AMPK抑制合成代謝途徑并同時激活分解代謝途徑以實現能量穩態。研究揭示了許多營養信號分子，包括AMPK、AMPK-mTORC1-ULK1三聯體參與自噬的調節[43]。AMPK通過在絲氨酸（Ser）317和Ser777直接磷酸化和激活ULK1促進自噬。PI3K激活AKT使mTOR阻遏物結節性硬化癥2磷酸化，導致mTOR活化并隨后抑制自噬活性。

靈芝多糖逆轉了由棕櫚酸促進的細胞凋亡和自噬，通過刺激MAPKs和AMPK磷酸化，抑制AKT和mTOR的磷酸化，揭示了靈芝多糖通過抗細胞凋亡和抗自噬特性對棕櫚酸誘發的IPEC-J2細胞死亡的保護作用[44]。在高脂飲食喂養的小鼠組織中，從果膠蜂花粉中分離出多糖以AMPK/mTOR依賴性方式增強自噬[45]。脂多糖促進AMPK磷酸化并使mTOR失活，用脂多糖處理鼻上皮細胞（HNEpC）增加了TLR4的數量，而多黏菌素B抑制TLR4則降低了由脂多糖引起的自噬。此研究首次證明脂多糖在HNEpC中引起自噬，該過程是由AMPK-mTOR途徑介導的[46]。脂多糖處理導致LX-2細胞和肝星狀細胞（HSC）中自噬體形成和自噬通量的顯著增加，其通過AKT-mTOR和AMPK-ULK1途徑介導[47]。海藻糖抑制了H2O2誘導的人神經母細胞瘤細胞（SH-SY5Y）內ROS的增加以及超氧化物歧化酶活性的降低，使用抗氧化劑N-乙酰-L-半胱氨酸減輕細胞內ROS水平并顯著減弱了H2O2誘導的AMPK激活和內質網應激。該研究表明海藻糖通過減輕ROS依賴性內質網應激和AMPK活化來預防H2O2誘導的SH-SY5Y細胞自噬性死亡[48]。

3 多糖與腫瘤細胞自噬關系

自然界中，多糖存在于幾乎所有的生物體中，包括種子組織、草本植物的莖和葉、動物的體液、細菌細胞壁、酵母和真菌的細胞外液等[49]，是機體重要組成物質。在中國等亞洲國家，中草藥具有悠久的發展歷史[50]，多糖作為中草藥中的活性成分受到了廣泛的關注。目前大多數抗腫瘤藥物及放療、化療手段對機體損傷較大，多糖能減輕放療和化療藥物的毒副作用并延長腫瘤患者生存時間。多糖可能是開發抗腫瘤藥物的理想候選者[51-53]，其中最具代表性的香菇多糖已被用作治療腫瘤的藥劑。自噬性細胞死亡是目前抗腫瘤研究的熱點，天然產物多糖能否調節細胞自噬受到了越來越多學者的關注。

近4 年來有關多糖影響腫瘤細胞自噬的相關文獻總結見表1。

表1 多糖影響腫瘤細胞自噬的調控效果Table 1 Polysaccharides affect the regulation of tumor cell autophagy

3.1 多糖激活自噬、誘導腫瘤細胞死亡

自噬可以在多糖的不同調控作用下產生抗腫瘤作用。多糖可以激活腫瘤細胞自噬、抑制腫瘤細胞增殖。中藥黃芪多糖具有較強的抗腫瘤活性和抗炎作用，常被認為是抗癌藥物佐劑。Wu Jun等[54]研究表明，中藥黃芪多糖通過抑制AKT信號通路增強了抗腫瘤藥物阿帕替尼誘導胃癌AGS細胞自噬的能力，減輕其毒副作用從而起到抗腫瘤效果，該實驗還發現阿帕替尼和中藥黃芪多糖的組合可能是癌癥治療的潛在物質；海藻中含有營養豐富的海藻糖，Park等[58]研究發現海藻多糖激活乳腺癌MCF-7細胞中的mTOR信號傳導途徑，增強自噬。中藥黃芪多糖可通過調節細胞自噬來增加宮頸癌HeLa細胞對抗癌藥物順鉑的敏感性，實時熒光定量聚合酶鏈式反應和蛋白質印記分析結果顯示，與對照組相比，Beclin-1、LC3的基因和蛋白表達水平均上調，而p62的基因和蛋白表達水平下調，說明中藥黃芪多糖激活了HeLa細胞發生自噬[55]。

除此之外，多糖還可以同時激活腫瘤細胞的凋亡和自噬，兩者共同作用抑制腫瘤細胞增殖。Zhang Xiaoyu等[57]研究表明人參多糖可以明顯誘導骨肉瘤細胞MG-63發生早期細胞自噬和凋亡，Western blot分析表明，人參多糖降低了p38和AKT的磷酸化以及Bax和Caspase3的蛋白表達。總之，GPS抑制MG-63細胞的增殖，增加凋亡和自噬性細胞死亡[57]。通過檢測自噬標記物LC3的表達也可以判斷多糖誘導腫瘤細胞發生自噬，自噬發生時，胞漿型LC3被Atg4水解并切割掉一小段多肽形成LC3-1，LC3-1和磷脂酰乙醇胺（即腦磷脂）結合轉變為自噬體模型LC3-2，這兩種形式存在于正常細胞中，但發生自噬的細胞中LC3-2明顯增加，檢測LC3-2/LC3-1的值即可判斷自噬水平高低。如VC與灰樹花多糖聯合誘導人肝癌細胞（SMMC-7721）凋亡及自噬，檢測到LC3表達水平上調，自噬被激活[56]。

3.2 多糖抑制自噬、誘導腫瘤細胞死亡

腫瘤細胞的自噬是一把“雙刃劍”，在饑餓條件下，腫瘤細胞為了存活，一部分腫瘤細胞發生自噬并為其他腫瘤細胞快速分化生長提供所需的營養物質，自噬能使腫瘤細胞繼續存活及生長，是腫瘤細胞的一種自我保護機制。而抑制自噬，是使其不能為快速分化的腫瘤細胞提供營養物質，降低腫瘤細胞的生長速率。有研究表明，多糖既可以直接抑制自噬，進而抑制腫瘤細胞增殖；又可以抑制腫瘤細胞自噬進而引發細胞凋亡，兩者共同作用抑制腫瘤細胞增殖。

Chao等[59]研究表明，黃山樺的水溶性多糖（Inonotus taiwanensispolysaccharid，WSPIS）以劑量和時間依賴性的方式降低LC3的表達，說明WSPIS能夠抑制自噬。為研究自噬在WSPIS誘導的細胞凋亡和細胞死亡中的作用，使用自噬誘導劑mTOR激活自噬，自噬的上調降低了WSPIS誘導的細胞凋亡和細胞死亡，發現WSPIS抑制THP-1細胞中的自噬從而起到了抗腫瘤的作用[59]。Shi Xiaolan等[60]研究了銀耳多糖在人上皮肺癌細胞（A549）中由銅綠假單胞菌脂多糖誘導的細胞凋亡和自噬的作用，加入銀耳多糖后，抑制了脂多糖誘導的自噬，加快腫瘤細胞死亡，該研究對肺損傷相關銅綠假單胞菌感染的治療具有重要意義。昆布多糖修飾的硒納米粒子誘導早期自噬的激活，但阻止了自噬晚期的激活，自噬晚期的抑制作用導致受損的細胞器無法清除并加重HepG2細胞凋亡[61]。

4 結 語

自噬使細胞在饑餓和受到打擊情況下維持細胞穩態。適度自噬是一種保護機制，過度自噬則會造成細胞死亡。以調節自噬活性為目的的治療已經成為腫瘤治療的熱門[62]。在研究腫瘤細胞自噬過程中發現，通過自噬抑制腫瘤可以分為兩種途徑：1）直接上調自噬相關基因表達，增加腫瘤細胞自噬量，達到抑制腫瘤細胞增長的目的；2）抑制自噬，阻斷細胞獲取能量，進而誘導細胞凋亡來抑制腫瘤細胞生長。天然產物多糖抑制腫瘤細胞自噬的途徑也分為兩種，與以上研究結果相似。低毒高產的多糖是否可以成為抗腫瘤藥物的輔助品、降低化學藥品帶來的副作用，成為了目前眾多學者研究的重點。從相關報道中發現，多糖相關的自噬研究靶點主要集中在PI3K/AKT/mTOR、MAPK、AMPK等信號通路。而自噬性質判定，即保護機體引發的自噬和致死性自噬的鑒別則較為鮮見。多糖能否與腫瘤細胞表面某一特定受體結合，影響PI3K/AKT/mTOR、MAPK、AMPK上游的某一蛋白，從而激活自噬相關通路表達有待進一步探討。因此，多糖對腫瘤細胞自噬的調控作用有待更深入的研究。