脫氧雪腐鐮刀菌烯醇的生物轉化及其隱蔽型毒素的形成研究進展

唐語謙，潘藥銀，劉晨迪，楊繼國,

（1.華南理工大學食品科學與工程學院，廣東 廣州 510640；2.華南協同創新研究院，廣東 東莞 523808）

真菌毒素是真菌在特定條件下產生的次級代謝產物，其中脫氧雪腐鐮刀菌烯醇（deoxynivalenol，DON）是目前世界分布最為廣泛、影響較大的真菌毒素之一。其屬B族單端孢霉烯族化合物，俗稱嘔吐毒素，主要由禾谷鐮刀菌（Fusarium graminearum）和黃色鐮刀菌（Fusarium culmorum）侵染小麥、大麥、玉米等糧食作物產生[1]。在潮濕、溫熱等氣候條件下，DON毒素的產生不可避免，它會引發小麥赤霉病等植物病癥，并經由谷物或飼料通過食物鏈富集至人體內，給世界糧食產業造成巨大經濟損失，也給人類健康帶來重大威脅[2]。除此之外，DON能夠在植物和微生物作用下轉化形成隱蔽型毒素，增加了谷類作物及其副產品的風險[3-4]。

DON的生物轉化主要包括植物轉化、微生物降解及動物體內代謝，不同生物對DON的作用模式存在一定差異，這影響到其衍生物類型、毒性效果及分布。大量研究表明，生物脫毒具有作用條件溫和、安全環保、對食品營養影響較小等優點[5]，但也應注意到經植物或微生物代謝轉化后毒素衍生物的形成。這些毒素衍生物在常規提取條件（乙腈-水或甲醇-水）下完全或部分穩定，其親水性比毒素單體更強，而且缺乏商業化的標準品，傳統分析技術難以檢測，故稱為隱蔽型毒素[6]。

隨著對DON的研究逐漸深入，人們發現隱蔽型毒素可與原型毒素同時存在，有些甚至比原型毒素的毒性作用更大。在某些情況下，隱蔽型毒素的濃度可能超過加工食品中原型毒素的水平，而且一些隱蔽型毒素會在體內代謝過程中重新轉化為DON，給人類和動物健康造成潛在風險[5]。目前已發現的隱蔽型DON毒素主要有：DON-3-葡萄糖苷（DON-3-glucoside，DON-3-G）、3-乙酰-DON（3-acetyl-DON，3-Ac-DON）、15-乙酰-DON（15-acetyl-DON，15-Ac-DON）、DON-3-葡糖苷酸（DON-3-glucoside acid，DON-3-GlcA）、DON-15-葡糖苷酸（DON-15-glucoside acid，DON-15-GlcA）、3-酮基-DON（3-ketone-DON，3-keto-DON）、3-異構-DON（3-epimerization-DON，3-epi-DON）和脫環氧DON（deepoxy-DON，DOM-1）?，F階段研究較多的是DON-3-G[7]，聯合國糧食及農業組織和世界衛生組織下的食品添加劑聯合專家委員會已將DON-3-G歸類為人類及動物健康潛在危害物，并將其作為DON類真菌毒素膳食暴露的重要指標[8]。但目前世界各國糧食和飼料安全標準還主要集中于DON的限量，未考慮到隱蔽型毒素的監測與限量。本文簡要介紹DON及其隱蔽型毒素的分布及危害，各類生物對DON的轉化模式及隱蔽型毒素的形成以及生物脫毒取得的進展，以期為DON及其隱蔽型毒素的降解研究提供參考。

1 DON及其隱蔽型毒素類型及分布

1.1 DON的隱蔽型毒素類型

圖1 DON及其隱蔽型毒素[7]Fig. 1 DON and its masked forms[7]

DON最早由日本學者Yoshizawa等[9]于1973年從鐮刀菌感染的大麥粒中分離得到，化學名稱為3,7,15-三羥基-12,13-環氧單端孢霉-9-烯-8-酮（化學式為C15H20O6），分子質量為296.32 Da，無色針狀晶體，可溶于水和極性有機溶劑[10]。DON化學性質穩定，一般的食品加工不能破壞其結構，堿性條件下或高壓處理才可破壞部分毒素，且可在環境和食物鏈中長期存在，已被歐盟致癌物分類標準定為三級致癌物。DON的隱蔽型毒素主要分為三類：第一類是共軛結合物，主要有DON-3-G、3-Ac-DON、15-Ac-DON、DON-3-GlcA、DON-15-GlcA；第二類是氧化還原產物，主要有3-keto-DON、3-epi-DON；第三類是脫環氧化合物，主要是DOM-1。DON及其隱蔽型毒素的結構式如圖1[7]。

1.2 DON及其隱蔽型毒素的分布

DON對糧食作物及以其為基礎的飼料和食品的污染是一個全球性問題。在我國，污染主要發生在長江中下游溫暖潮濕地區。近年來，由于全球變暖和農業系統的變化，逐漸蔓延到中國西北等高緯度地區，如東北、山東等以種植小麥為主的地區也常出現DON暴露量超標的情況[11-15]。在美洲，巴西、美國等地常檢測出DON及其隱蔽型毒素，歐洲、非洲以及沿海等地區均有相關檢測報道[16-21]。近幾年全球部分國家和地區的毒素檢出情況見表1[14-21]。

DON的隱蔽型毒素以DON-3-G為主，它通常與DON原型及衍生型3-Ac-DON、15-Ac-DON共存于小麥、大麥、玉米等糧食作物及其副產品中[12-17]，在釀造啤酒過程中，作為原料的大麥特別容易受到毒素污染。Jeroen等[22]在47 個國家的406 種啤酒中發現DON和DON-3-G的質量濃度總和為10～475 μg/L，在27 種精釀啤酒中，污染物濃度超過了歐洲科學委員會設定的1 μg/（kgmb·d）的每日耐受攝入量。分析谷物及其副產品的DON水平是從源頭監測毒素污染的有效途徑，而其代謝產物也可作為DON暴露的有效生物標志物[23]。Maria等[24]在大部分英國兒童和青少年尿液中檢測到游離DON和DON-GlcA，33%～63%的兒童和5%～46%的青少年的膳食DON暴露水平超過暫定每日最大耐受攝入量，此外，Deng Chunli等[25]也在中國河南省的居民尿液樣本中檢測到低水平的游離DOM-1。以上研究表明，人群中DON及其隱蔽型毒素已經廣泛存在，并對食品安全和人體代謝構成了風險。

2 各類生物對DON的轉化途徑

不同生物對DON的轉化模式存在一定差異，這影響到其形成的隱蔽型毒素類型、分布及毒性作用（圖1）：1）DON及共軛結合物（DON-3-G、3-Ac-DON、15-Ac-DON）常共存于小麥、大麥等植物中，一方面是由于鐮刀菌會天然產生少量的3-Ac-DON、15-Ac-DON[26]；另一方面被鐮刀菌感染的植物通過自身防御機制形成DON功能化共軛形式，改變了DON的水溶性和毒性作用[27]，其中C3位羥基葡糖苷化和乙?；侵参锓烙鶛C制的解毒作用，而C15位羥基乙?；蛊渚哂懈叩亩拘?；2）DON-3-G、Ac-DONs在哺乳動物的消化道中經腸道微生物作用又重新水解釋放DON，同樣存在一定毒性作用的影響[28-29]；3）脫環氧化合物DOM-1及氧化還原產物（3-keto-DON、3-epi-DON）主要是在農田土壤或動物胃腸道的微生物降解DON過程中形成，微生物還通過不同代謝機制改變毒素結構，進而實現對毒素的生物降解；4）DON在人體內代謝后隨尿液排除過程中，大部分以其原型或葡糖苷酸結合物（DON-GlcA）的形式存在，主要是DON-3-GlcA、DON-15-GlcA，葡萄糖醛酸化是哺乳動物中主要的II期結合途徑，在DON解毒和生物轉化中起重要作用[30]。小部分DON可以通過人體腸道微生物群解毒成脫環氧DOM-1，并隨尿液排出體外[25,31]。

表1 近幾年全球部分國家和地區DON及其隱蔽型毒素檢出情況Table 1 Detection rates of DON and its masked forms in some countries and regions in recent years

2.1 植物對DON的改性

2.1.1 C3位葡萄糖苷化

DON-3-G是植物對DON最常見的修飾形式之一，抗赤霉病的小麥[32]、水稻[33]、擬南芥[34]等植物中存在一種UGTs，它能催化內源性葡萄糖分子與DON C3位的羥基結合形成DON-3-G[35]，DON向DON-3-G轉化程度受多種因素影響。Ovando-Martinez等[32]發現春小麥的種類及地域都極大地影響著其DON與DON-3-G的含量及DON糖基化的效率，這與植物抗性程度有關。目前，研究人員引入UGTs的基因片段以增強植物對鐮刀菌的抗性，Li Xin等[36]將HvUGT13248導入小麥中成功表達，該轉基因小麥不僅可以抑制DON的積累，同時可有效地使DON轉化成DON-3-G。

2.1.2 C3位乙?；?/p>

DON共軛結合物的形成并不局限于糖基轉化，還可通過攜帶Tri基因的植物與乙酰基結合轉化為3-Ac-DON。其中Tri101是一個編碼單端孢霉烯-3-O-乙酰轉移酶關鍵的調控基因，可在大麥和小麥中穩定表達和遺傳[37]。Okubara等[38]實現FsTRI101在玉米UBI啟動子控制下在小麥中成功表達，其胚乳提取物中檢測到Tri101編碼的乙酰轉移酶活性，賦予了小麥一定的DON耐受性并使其具有更高水平的鐮刀菌抗性。為了進一步研究谷類作物對3-Ac-DON是否有足夠的抗性，Ohsato等[39]構建了穩定表達和遺傳Tri101的轉基因水稻植株，對比野生型水稻根部生長狀況，發現3-Ac-DON對表現出乙?；芰Φ霓D基因作物沒有毒性。

不同植物對鐮刀菌侵染易感性存在差異，且受母體毒素DON不同濃度的影響，將DON轉化為DON-3-G、3-Ac-DON的能力有所不同。然而，利用轉基因技術使植物表達恰當的UGTs或3-乙酰基轉移酶，以提高植物對鐮刀菌抗性、降低DON毒素積累是有爭議的。因為乙?；吞腔Y合的DON共軛化合物可以通過內源性微生物菌落或酶在哺乳動物的消化過程中分裂，不能保證其結構的穩定[28-29]。

2.2 微生物對DON的降解

2.2.1 霉菌

目前，國內外關于霉菌生物轉化DON及相應的隱蔽型毒素形成的研究較少且結構尚未明確。He Chenghua等[40]以DON毒素為唯一碳源從土壤中分離到一株可以轉化DON的塔賓曲霉（Aspergillus tubingensis）菌株NJA-1，14 d后可轉化94.4%的DON，其作用機制初步猜測是C8酮基水合作用，或環氧基團開環形成兩個羥基。吳娛等[41]發現DON經米曲霉（Aspergillus oryzae）菌株As-W.6發酵后也能實現較高降解率，降解產物分子質量減少了13.9 Da，產物未明。糖基化修飾在微生物對DON的代謝中很少見。但Tian Ye等[42]發現木霉（Trichoderma）可以將DON轉化為DON-3-G，推測這是木霉在與鐮刀菌競爭過程中產生了和植物類似的自我保護機制。

2.2.2 細菌

2.2.2.1 脫環氧作用

已有研究表明DON毒素脫環氧代謝是其主要解毒代謝機制，大多由動物的瘤胃和腸道微生物完成，研究者陸續從雞腸、鯰魚消化物等中篩選出具有降解DON為DOM-1能力的細菌菌群[43-44]，有梭菌屬（Clostridiumsp.）菌株WJ06和伊格爾茲氏菌屬（Eggerthellasp.）菌株DII-9、真桿菌屬（Eubacteriumsp.）[27]。Fuchs等[45]從牛瘤胃中分離出一株厭氧優桿菌屬細菌BBSH 797，已被開發為動物飼料中DON脫毒的商業產品Mycofix。Awad等[46]測試了這種微生物飼料添加劑在肉雞中的體內功效，證明它能減輕DON對小腸葡萄糖轉運的毒性作用。但已報道的具有脫環氧作用的細菌大多是絕對厭氧的，實際應用中其功效會受到一定的影響。

2.2.2.2 C3位氧化

DON分子C3位的羥基能夠被多種微生物氧化成為酮基，形成產物3-keto-DON，其分子質量相比DON減少了2 Da（圖2[47]）。Shima等[48]分離自日本農田土壤中的根癌農桿菌屬（Agrobacterium rhizobium）菌株E3-39，其分泌的胞外酶將DON氧化形成3-keto-DON。隨后，從中國、加拿大等國家的土壤中也陸續分離到具有DON氧化活性的細菌，這些菌株均屬于德沃斯氏菌屬（Devosiasp.）[48-49]。最近，He Weijie等[50]從小麥赤霉病流行的農田土壤中分離到一株同樣具有C3位氧化活性的鞘氨醇單胞菌屬（Sphingomonassp.）菌株S3-4，他們利用BAC文庫篩選克隆得到了SphingomonasS3-4中參與催化C3位氧化的關鍵酶AKR18A1，該酶屬于醛酮還原酶超家族。

圖2 DON的氧化[47]Fig. 2 Oxidation of DON[47]

2.2.2.3 C3位差向異構化

大量研究推測，C3位差向異構化過程由兩步反應組成：第一步是DON先經關鍵酶氧化C3位的—OH（R構象）生成3-keto-DON；第二步是3-keto-DON由酮還原C3位的＝O成S構象的—OH，從而完成由DON向3-epi-DON的差向異構化（圖3[51]）。

圖3 DON差向異構化[51]Fig. 3 Epimerization of DON[51]

目前具有差向異構化能力的細菌已有不少報道，主要有類諾卡氏菌（Nocardioidessp.）、德沃斯式菌屬（Devosiasp.）和嗜熱菌科的一個新屬Paradevosia shaoguanensis，但是對關鍵酶的分離純化及特性研究較少[27]。

分離自農田土壤的類諾卡氏菌屬（Nocardioidessp.）菌株WSN05-2，是第一個被報道具有DON異構化活性的菌株[52]。之后，Sato等[53]從土壤樣品中分離出的13 株有氧DON降解細菌能將DON轉化為3-epi-DON，其中9 種屬于革蘭氏陽性的諾卡氏菌屬，4 種屬于革蘭氏陰性的德沃斯式菌屬，表明實現差向異構的降解菌至少分布在兩個系統發育限制屬中。

目前針對德沃斯式菌屬的酶促差向異構化的研究更為深入，德沃斯式菌同屬的不同菌株表現出來差向異構化的能力存在差異，這與菌株是否表達參與DON氧化及3-keto-DON還原的關鍵酶有關。Hassan等[54]將DON與7 種Devosia屬菌株一起孵育，發現只有D. mutans17-2-E-8能將DON差向異構化為3-epi-DON，其他菌株沒有顯示出差向異構化DON的能力，但這幾種Devosia菌株均能不同程度地將3-keto-DON轉化為3-epi-DON。隨后，同課題組的Carere等[55]從D. mutans17-2-E-8中克隆了參與催化DON氧化形成3-keto-DON的基因，轉化大腸桿菌進行表達，進一步測試了表達的降解酶DepA活性及其轉化DON的能力，發現該酶屬于吡咯喹啉醌依賴的乙醇脫氫酶，接著用同樣方法分離出參與異構化第二步反應的關鍵酶DepB，該酶屬于醛酮還原酶超家族[54]。最近，Wang Gang等[56]報道D.insulaeA16對DON及其隱蔽型毒素3-Ac-DON和15-Ac-DON的最終產物降解為3-keto-DON，無法催化3-keto-DON轉化為3-epi-DON，表明D. insulaeA16缺乏特異性還原3-keto-DON的酶。這也進一步證實了DON差向異構化以3-keto-DON作為中間體，通過兩步催化完成DON差向異構化（表2）。

表2 參與DON氧化和差向異構化的細菌及關鍵酶Table 2 Bacteria and key enzymes involved in oxidation and emipmerization of DON

2.3 動物體內對DON的代謝

毒物動力學研究結果顯示，DON被攝入后首先穿過腸道屏障，在消化道中被微生物或在機體的腸黏膜、肝臟、腎臟等器官中降解成多種代謝產物，主要包括葡糖苷酸結合物（DON-glucoside acid，DON-GlcA）、DOM-1，進而隨尿液及糞便排出體外。不同動物對DON的腸道吸收和代謝過程存在較大差異，這與細菌在腸道內的定位及關鍵酶有關[24,59-60]。

2.3.1 葡萄糖醛酸化

DON與葡萄糖醛酸在UGTs的催化下發生共軛作用形成DON-GlcA，主要包括DON-3-GlcA和DON-15-GlcA，且UGTs在肝臟、小腸和腎臟中分布廣泛[61]。Maul等[62]在體外模擬DON葡萄糖醛酸化時，發現肝臟微粒體也可促進DON-GlcA的形成，因為DON-GlcA的脂水分配系數（lgP值）較低，降低了其穿過細胞膜或結合核糖體的效率，進而更利于排出體外[63]。有研究顯示，人攝入的DON約91%以DON-GlcA的形式排出體外，并且以DON-15-GlcA為主[24-25,64]。

2.3.2 脫環氧作用

在2.2.2.1節細菌脫環氧作用中已經介紹DOM-1主要是在家禽和反芻動物的腸道微生物催化下脫環氧形成的，而人和單胃動物（豬和嚙齒動物）只在小腸結腸區具有高分布脫環氧菌群，很大比例的DON穿過小腸上皮細胞進入血液循環而被迅速吸收，而只有小部分的DON到達結腸后被細菌代謝成DOM-1[65]。例如豬攝入DON后，僅有約20%代謝為DOM-1通過糞便排出[66]。

3 不同轉化途徑對DON隱蔽型毒素毒性的影響

DON污染農作物及糧食制品后，會對人類和動物產生廣泛的毒性效應，主要癥狀為頭昏、腹瀉、惡心、厭食、嘔吐以及白細胞缺乏癥[67]。這是由于DON與核糖體的結合抑制了蛋白質合成的延伸，同時伴隨著核內毒素應激的發生，導致參與信號傳導的關鍵細胞激酶的活化，從而產生毒性作用[2]。DON經不同轉化途徑后形成不同隱蔽型毒素，其毒性也發生了不同的改變（圖4和表3）[47,68-72]。

對于DON-3-G，葡萄糖苷造成一定空間位阻，導致其難以進入核糖體肽基轉移酶中心的A位口袋，無法引起核糖體毒素應激，故而降低DON毒性作用[68]。研究發現3-Ac-DON、15-Ac-DON對腸屏障完整性會產生不同程度的影響，增殖細胞的細胞毒性從小到大可排列為3-Ac-DON≤DON＜15-Ac-DON[70]，故C3位羥基乙?；徽J為是植物防御機制的解毒作用，而C15位羥基被乙?；芗せ罱z裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK）途徑使其具有更高的毒性[73]。共軛結合型的隱蔽型毒素由于引入結合物，形成了空間位阻，一定程度降低了DON毒性作用（15-Ac-DON除外）。但DON-3-G、Ac-DONs在哺乳動物的消化道中經腸道微生物作用又重新水解釋放DON，同樣存在一定毒性作用的影響[74]。

表4 DON的化學結構式Fig. 4 The structure of DON

表3 DON及其隱蔽型毒素的毒性分析Table 3 Toxicity of DON and its masked forms

DON分子結構中C3位的羥基和C12和C13位的環氧基團是主要的致毒性基團，從農田土壤或動物胃腸道篩選得到具有DON降解作用的細菌，作用機制就集中在這兩個致毒基團上[2]。脫環氧形成的DOM-1、C3位的-OH氧化、差向異構化得到的3-keto-DON和3-epi-DON是目前研究過程發現毒性作用較小的毒素衍生物。由于環氧基團的損失，DOM-1僅形成兩個氫鍵，導致與核糖體的結合較不穩定，且不會激活MAPK途徑，不同類型的細胞毒性實驗結果表明DOM-1對多種細胞毒性極低，幾乎無毒[72]。大量研究證明3-keto-DON免疫抑制毒性是DON的1/10，而3-epi-DON是一種接無毒的代謝物[47,71]。分子模擬顯示C3位羥基的氫原子與環氧基團的氧原子之間的距離減小，有助于增加3-epi-DON的穩定性，并影響其與核糖體的結合能力，對于降低DON毒性有著至關重要的作用[69]。

4 DON隱蔽型毒素的檢測方法

在以往檢測農作物及其制品中DON含量時，通常忽略了隱蔽型真菌毒素的存在及其危害性。檢測主要依靠色譜分析，包括薄層色譜、GC、HPLC，輔以免疫親和柱凈化（immunoaffinity chromatography，IAC）、固相萃取等樣品制備方法[4,14-15]。其中HPLC是常用的真菌毒素檢測方法，但隱蔽型毒素在常規HPLC檢測條件下，由于缺乏商業化的標準品，假陽性干擾較大[15]。在DON隱蔽型毒素檢測方法研究進程中，研究人員主要從兩個方面突破：一方面，利用合成、純化等方法得到隱蔽型毒素標品以供檢測，目前已有的標準品有3-Ac-DON、15-Ac-DON、DON-3-G；另一方面，進一步采用LC-MS/MS、GC-MS/MS、UPLC-MS/MS等串聯質譜法實現DON隱蔽型毒素的定性和定量檢測[20-21,24]。

LC-MS/MS是目前最常用的隱蔽型毒素定量分析方法，借助有效的色譜分離以及特征的碎片離子，可同時檢測混合樣品中的不同組分，故而可以對隱蔽型毒素及其原型、代謝物甚至不同類型的毒素同時進行定量分析[6]。Palacios等[18]運用LC-MS/MS第一次在阿根廷不同地區收獲的小麥中檢測到DON-3-G和少量的乙?；苌?。UPLC是在HPLC基礎上，以1.7 μm的超細色譜柱填料為核心的新型色譜分離分析技術，可以極大地提高分離效率和分析速率[75]。Deng Chunli等[25]建立了IAC-UPLC-MS/MS檢測方法，運用于河南省居民尿液樣品中DON及其隱蔽型毒素的風險評估，樣品前處理回收率為78.5%～112%，定量限為0.2～2 μg/L，極大地提高了檢測效率和準確性。

5 結 語

DON在生物作用下會轉化形成各種隱蔽型毒素，其中植物對DON的修飾是共軛結合，微生物主要是脫環氧作用和氧化還原作用，在動物體內大部分代謝為葡萄糖醛酸結合物。這些生物轉化往往并不徹底，使中毒癥狀更加復雜，增加了糧食及其副產品的安全風險。

為了實現對DON的高效生物脫毒，以下方面還需進一步研究：1）通過富集高選擇性培養基，利用聚合酶鏈式反應變性凝膠電泳細菌譜和有效的分子技術增加從復雜的微生物群篩選微生物的機會，以脫環氧和C3位差向異構化為方向篩選安全、降解能力強的降解菌；2）使用活性酶也是真菌毒素降解的另一種研究方向，進一步加強對DON降解微生物中發揮作用的關鍵酶的提取純化，并通過酶活性研究和分子模擬技術增強其對隱蔽型毒素的降解效果；3）進一步提高檢測技術，量化隱蔽型毒素的含量并制定限量標準，最大限度地降低污染物對公眾健康的風險；4）生物脫毒的微生物制劑可作為添加劑應用于食品和飼料工業，但需嚴格確保其功效及安全性。