基于食源性細菌群體淬滅的生物膜控制研究進展

王飛飛，吳豪益，林 晨，張 巖，傅玲琳，王彥波,

（1.浙江工商大學食品與生物工程學院，浙江 杭州 310018；2.河北省食品檢驗研究院，河北 石家莊 050091）

細菌生物膜廣泛存在于各種食品和食品加工表面，研究發現細菌生物膜不僅可以引起食源性疾病爆發，與食品腐敗也有著顯著的相關性，嚴重制約了食品工業的健康發展[1]。鑒于此，食源性細菌生物膜的控制引起了廣泛的關注。研究表明，細菌生物膜是細菌在生長過程中，為了適應生存環境，由細菌自身分泌的多糖、DNA、蛋白質等胞外多聚物（extracellular polymeric substances，EPS）組成的一個具有三維立體空間結構的生態群落[2]。在生物膜的保護下，細菌能耐受高濃度的抗菌劑和食品防腐劑，顯著增加食品安全風險[3]。進一步探究發現，群體感應（quorum sensing，QS）系統在食源性細菌生物膜形成的各階段起著關鍵調控作用，因此，通過特定的方法有效阻斷細菌Q S 系統即群體淬滅（q u o r u m quenching，QQ），成為一種新型的控制細菌生物膜的手段，得到了廣泛研究[4]。

1 基于食源性細菌群體感應系統的生物膜形成

當細菌細胞接觸到食品或食品加工表面時，通過鞭毛、菌毛和一些表面蛋白等進行細胞的初始附著，逐漸形成生物膜微菌落，微菌落通過細胞增殖生長并產生大量EPS，負責細胞間的黏附并形成細胞支架，從而維持生物膜的三維結構。細胞被緊密地包裹在生物膜中，逐漸實現信號分子的積累，并通過QS信號分子進行交流。反過來，響應種群密度閾值觸發的QS參與調節生物膜形成的各個階段，從而形成一個完整的“附著-微菌落形成-成熟-分散”生物膜生命周期[1]（圖1）。

圖1 QS系統調控細菌生物膜生命周期Fig. 1 Regulation of the QS system on the biofilm life cycle

細菌QS系統依賴于細胞外化學信號分子即自誘導因子的產生、釋放和檢測。這些信號分子在環境中進行局部積累，當達到適當的閾值濃度后，與受體蛋白相互作用，導致細菌特定基因的表達發生相應變化。在革蘭氏陰性菌中，?；呓z氨酸內酯（acylhomoserine lactones，AHLs）信號分子由一種LuxI型酶合成。在AHLs達到適當的閾值濃度后激活LuxR受體蛋白，使靶效應基因得以轉錄[5-7]。革蘭氏陽性菌可以產生AIP，并通過ABC轉運蛋白運輸到細胞外，由膜結合的激酶受體傳感器和細胞質應答調節蛋白組成的雙組分以及調節效應器RNAIII來改變靶基因表達。AI-2則被認為是種間通用的信號分子，廣泛存在于革蘭氏陽性菌和革蘭氏陰性菌中，而LuxS是合成AI-2的關鍵酶，LuxS催化S-核糖同型半胱氨酸裂解為同型半胱氨酸和4,5-二羥基-2,3-戊二酮（4,5-dihydroxy-2,3-pentanedione，DPD），DPD隨后進行自發重排和修飾，形成一種分子混合物，統稱為AI-2[8]。

研究表明，QS系統信號分子的合成在食源性細菌生物膜形成中起著重要作用。首先是負責編碼AHLs信號分子合成酶的luxI型基因，洋蔥伯克霍爾德菌（Burkholderia cenocepacia）具有兩套QS系統cepIR和cciIR，其中，基因cepI和cciI分別編碼合成C6-HSL和C8-HSL信號分子的LuxI型信號分子合成酶。研究發現Burkholderia cenocepaciaK56-2的cepI和B. cenocepaciaJ2315的cepI和cciI突變株在生物膜形成方面存在缺陷[9-10]。同樣地，編碼合成AHLs信號分子的luxI型基因ahyI和swrI突變分別導致嗜水氣單胞菌（Aeromonas hydrophila）和液化沙雷氏菌（Serratia liquefaciens）形成缺乏微菌落的未成熟生物膜[11]。此外，luxS基因缺失會影響AI-2的合成從而影響弧菌屬（Vibriospp.）、鏈球菌屬（Streptococcusspp.）、葡萄球菌屬（Staphylococcusspp.）生物膜的形成[12-13]。AIP和調節效應器RNAIII生成能力缺失影響金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）的生物膜形成[14]。由此可見，不管是革蘭氏陰性菌還是陽性菌，信號分子合成酶基因的缺失或突變都可以通過阻礙信號分子合成，從而影響信號傳導進而影響生物膜形成。

近年來，研究進一步闡明了QS系統調控細菌生物膜形成的分子機制。在生物膜形成的初始階段，QS系統通過調節黏附素和鞭毛等相關基因的表達來調控細菌與表面的附著能力。研究發現，luxR基因缺失導致波羅的海希瓦氏菌（Shewanella baltica）鞭毛馬達基因pomA表達下調，從而導致生物膜形成能力受損[15]；S. aureus的luxS突變體通過改變rfb基因的表達來調節依賴于多糖黏附素的生物膜形成[16]。此外，QS系統可以通過調節EPS的分泌來調控生物膜的成熟。泰蘭伯克霍爾德氏菌（Burkholderia thailandensis）luxR的同源基因btaR1突變體通過降低EPS中的巖藻糖含量，從而形成喪失穹頂結構的生物膜[17]；Pseudomonas aeruginosa的3 個QS系統（las、rhl和pqs）均可通過調節EPS中eDNA的釋放，從而影響生物膜結構[18]；pqsQS系統還能通過調控前噬菌體進而誘導細胞裂解，引起eDNA釋放，影響生物膜形成[18]；此外，生物膜約30%的EPS蛋白來自膜泡（membrane vesicle，MV），而MV的產生受las和pqsQS系統調控[19]；同樣地，枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）QS系統oppA、oppF、comX、comP和comA的基因突變，也能導致EPS中eDNA的釋放缺陷，從而影響生物膜形成[20]。QS系統在生物膜的分散階段也起著重要的調控作用。在生物膜成熟后期，創傷弧菌（Vibrio vulnificus）的LuxR同源蛋白SmcR通過誘導莢膜多糖基因簇的轉錄產生莢膜多糖，其親水性促進了生物膜結構的分散[21]；S. aureus的agrQS系統通過控制psm基因的表達產生表面活性劑從而促進生物膜分散以及生物膜的傳播定植[22]。

2 基于食源性細菌群體淬滅的生物膜控制

目前，食品工業仍在使用常規的細菌生物膜控制手段，包括良好的生產衛生、合理生產線的運行以及有效使用清潔消毒劑等[1]。隨著生物膜對常規消毒劑的抵抗力日益增強，為了滿足食品加工系統對食品安全的要求，需要一種更有效、更環保的控制手段。QS淬滅劑是一類在不影響細菌生長的情況下，以QS系統為作用靶點，通過干擾、阻斷細菌QS系統從而達到有效控制生物膜的新型化合物；因此，基于QQ的生物膜控制還可以最大限度地減少細菌耐藥性的產生。根據QS調控細菌生物膜形成的分子機制，目前QQ機制主要有以下幾種：抑制信號分子的合成、信號分子酶解失活、與信號分子受體結合（比如阻斷信號分子-受體復合物的形成）[23-24]。

2.1 抑制信號分子的合成

在信號分子合成階段，抑制信號分子合成過程酶的活性、抑制信號分子前體物質的合成、添加前體物質類似物等都可以起到抑制信號分子合成的作用。AHL是由LuxI家族蛋白將一個?；d體蛋白的脂肪?；苌镛D移到S-腺苷甲硫氨酸（S-adenosylmethionine，SAM）的氨基上而形成的。因此，SAM或脂肪酸生物合成抑制劑可用作AHL信號產生的抑制劑；另外，腺苷同型半胱氨酸和5-甲基硫代腺苷等各種SAM類似物通過競爭SAM催化位點也可以抑制AHL信號的產生[8]。Christensen等[25]利用高通量酶聯體外篩選技術得到一系列AHL合成酶的潛在抑制劑，其中化合物1～3（化合物篩選結果見Pubchem數據庫，http://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/assay/assay.cgi?aid=720554，accession no. AID 720554）可以顯著抑制鼻疽伯克霍爾德氏菌（Burkholderia mallei）BmaI1和鼠疫耶爾森氏菌（Yersinia pestis）YspI的AHL信號分子合成活性。肉桂醛可以與信號分子合成酶LasI和RhlI的底物結合位點相互作用，抑制P. aeruginosaQS系統關鍵下游基因lasB、rhlA和pqsA的表達，從而影響生物膜形成[26]。同樣地，真菌次生代謝物氨丁酸可以通過抑制信號分子合成酶AgrB的活性來抑制不同革蘭氏陽性菌AIP的生物合成[27]。此外，有研究表明與LuxS催化位點同源的小分子肽5411（MHTLEHLFAGFM）和5906（MLFAGFM）通過與LuxS特異性結合從而抑制遲緩愛德華氏菌（Edwardsiella tarda）AI-2的產生，進而使生物膜得到控制[28]。

2.2 信號分子的酶解

合成的QS信號分子可以通過酶進行降解，以防止其積累和隨后的QS系統激活。這些酶通過降解產生的信號分子，進而控制生物膜形成。目前，關于酶解QS信號分子的研究主要集中在AHL信號分子。AHL內酯酶和?；阜謩e水解AHL分子的高絲氨酸內酯（homoserine lactone，HSL）環和酰基側鏈的酰胺鍵從而直接降解AHL信號分子[29]，AHL分子氧化還原酶可以將信號分子中的羰基還原成羥基從而使其失活[8]。從鼠尾菌Muricauda oleariaTh120中分離出來的內酯酶MomL具有同等降解長鏈和短鏈AHL的能力[30]，但是其對生物膜形成的影響有待驗證。蠟狀芽孢桿菌VT96（Bacillus cereusVT96）產生的AHL內酯酶AiiA可直接控制P. aeruginosaPAO1中胞外多糖的產生及生物膜的形成[31]。芽孢桿菌產生的AHL內酯酶AiiAAI96通過酶解威隆氣單胞菌LP-11（Aeromonas veroniiLP-11）產生的AHL，從而降低其蛋白酶活性和細胞泳動性[32]。丁香假單胞菌（Pseudomonas syringae）能產生AHL酰化酶HacA和HacB，P. syringaeHacA和HacB缺失株的生物膜形成能力明顯增強[33]，說明HacA和HacB能夠破壞AHL分子的酰胺鍵從而控制生物膜形成。目前，還鮮有涉及AHL信號分子氧化還原酶在控制生物膜形成中的研究，此外，AIP和AI-2信號分子的降解酶有待挖掘。雖然這些酶的酶解作用是降解信號分子的主要途徑，但這些酶普遍活性偏低、專一性不夠高、活性受環境影響大，因此，在信號分子降解酶的篩選優化以及分子改造方面需要進一步研究。

2.3 與信號分子受體結合

根據QS系統響應機制，達到閾值濃度的信號分子與相應受體蛋白特異結合后，通過信號轉導從而激活細菌生物膜形成相關基因的轉錄，最終影響生物膜形成?；诖耍恍┤斯ず铣苫蛱烊换衔锟赏ㄟ^與信號分子競爭受體結合位點，也可以通過非競爭性的方式與受體結合，阻斷信號向細胞內傳遞，從而達到控制生物膜的目的。

目前，關于AHL信號分子的競爭性受體，研究主要集中于其?；鶄孺溁騼弱ゲ糠值男揎?，以及其中心酰胺結構的改變，用以開發分子類似物，以達到控制生物膜形成的目的[34]。研究表明，采用環戊基或環己酮環取代內酯環得到的AHL類似物（C9-CPA和C10-CPA）可以顯著影響粘質沙雷氏菌（Serratia marcescens）和P. aeruginosa的生物膜形成[35-36]。在?；鶄孺溞揎椃枷慊鶊F而得到的AHL類似物（苯丙酰高絲氨酸內酯和苯氧乙酰高絲氨酸內酯）則可以抑制P. aeruginosa生物膜的形成[37]。此外，鄰氨基苯甲酸甲酯能與C4-HSL競爭結合LuxR受體，進一步抑制luxI和luxR基因表達，從而影響溫和氣單胞菌（Aeromonas sobria）生物膜形成[38]。薄荷醇可以通過與LasR和PqsR受體相互作用分別抑制las和pqsQS系統-調控的下游轉錄，從而干擾P. aeruginosa的生物膜形成[39]。

對于AI-2型QS系統，AI-2和DPD類似物都可以競爭性地抑制信號分子與受體結合，從而阻斷QS通路。DPD衍生物包括Ac2-DPD、烷基-DPD和DPD碳酸鹽，以及DPD結構類似物如5-羥基-2,3-戊烷二酮和4-羥基-5-甲基-3-(2H)-呋喃酮都可以干擾AI-2型QS系統；一些含二醇化合物（包括鄰苯三酚）、硼酸和砜已被證明可以有效拮抗AI-2與周質受體LuxP的結合[8,40]；惡唑硼酸鹽（含負電荷硼原子的雜環水合物）和吩噻嗪也能干擾AI-2型QS系統[41-42]，但是這些化合物在生物膜控制方面的應用鮮有報道。在生物膜控制方面，熊果酸、異丁基-DPD、異丁基-DPD與慶大霉素聯用、苯基-DPD以及苯基-DPD與慶大霉素聯用能抑制大腸桿菌（Escherichia coli）和P. aeruginosa生物膜的形成，并能清除預先形成的生物膜[43-44]。此外，信號類似物4-甲氧羰基苯基硼酸和SAM腺苷衍生物LMC-21在不影響細菌生長的同時，可降低鰻弧菌（Vibrio anguillarum）和創傷弧菌（Vibrio vulnificus）的生物膜總量[45]。

對于AIP型QS系統，包括截短類似物（Tr-AIP-I、Tr-AIP-II和Tr-AIP-IV）和N-乙酰化的類似物Tr-(Ala)-AIP-I在內的AIP信號的類似物對Staphylococcus spp.的QS系統均有抑制作用[46]。另外，發光桿菌屬（Photobacterium）產生的環縮肽磺酰胺A和B，以及羅伊氏乳桿菌RC-14產生的環二肽L-Tyr-L-Pro和L-Phe-L-Pro能干擾agr QS系統[47-48]。然而，目前關于這些化合物在生物膜控制中的研究很少。在生物膜控制方面，研究最廣泛的AIP型QS系統抑制肽是RNAIII抑制肽，該抑制肽及其類似物和非肽類似物金縷梅單寧能干擾RAP/TRAP QS系統[49-51]。進一步的研究表明，金縷梅單寧可以通過與QS受體TraP結合，改變S. aureus細胞壁合成和eDNA的釋放，從而影響生物膜的形成及其抗生素敏感性[52]。

3 結 語

雖然目前已逐漸將QS淬滅劑作為新型的生物膜清除劑，并提出將兩種或兩種以上不同的控制技術相結合的方法來控制生物膜形成，比如QS淬滅劑和傳統抗生素聯用，利用納米技術對QS淬滅劑進行改造等產生的協同效應可以顯著增加生物膜消除效率，并在一定程度上避免細菌耐藥性的產生。隨著對新鮮食品、即食食品、加工食品的需求增加和對食品安全性要求的提高，仍有必要開展以下幾方面研究。

目前，大量研究發現天然植物和微生物提取物可以作為QS淬滅劑，但其淬滅機制還有待研究確認。例如，Choi等[53]發現山茱萸提取物具有抗QS活性，并顯著抑制P. aeruginosa、小腸結腸炎耶爾森菌（Yersinia enterocolitica）和A. tumefaciens生物膜的形成。百里香精油、香芹酚和百里酚能顯著抑制P. fluorescens KM121 AHLs的產生，降低細胞泳動性和鞭毛基因的mRNA水平[54]。黑衣草提取物合成的氧化鋅納米顆粒展現出了廣譜AHL型QS抑制能力，并通過降低細胞群集運動和EPS產生從而廣譜抑制4 種食物致病菌的生物膜形成，還可以清除預先形成的生物膜[55]。極端嗜鹽古生菌提取物反式4-(2-羧基-乙烯基)苯甲酸在lasB-gfp、rhlA-gfp和pqsA-gfp生物傳感菌株上顯示出了QS淬滅性能，并且顯著抑制了P. aeruginosa生物膜形成[56]。Prateeksha等[57]發現地衣內生菌提取物可以淬滅QS信號分子，從而減少P. aeruginosa PAO1胞外多糖和微菌落的形成。解析這些天然提取物的化學結構，進一步挖掘其作用靶點，有助于豐富群體淬滅機制，為QS淬滅劑的產業化合成提供理論基礎。

目前僅已知一小部分細菌的QS系統調控生物膜形成的分子機制，且細菌間的QS調控網絡仍然不清晰。闡明各食源性致病菌和特定腐敗菌的QS機制，以及QS對其生物被膜形成的調控機制，有利于為特異性篩選QS淬滅劑提供靶點。

由于不同階段的生物膜形成調控機制不同，相應生物膜控制策略的選擇也不同；因此，研究需致力于確定生物膜階段特異性轉錄組，以鑒定參與生物膜發育不同階段的基因以及各種調控型RNA，并提供生物膜階段特異性防控靶點，從而達到更高效的生物膜控制效果。

生物膜中的細菌基因表達是異質的，并且會隨著外界環境的改變分化出不同表型的亞群，而目前大多數實驗室都是在靜態條件下進行生物膜研究的，對這種異質基因表達如何在變化的環境中促進生物膜的靈活性和可塑性的貢獻知之甚少，新興單細胞分析等技術的發展為探索單細胞生物的多細胞性提供了可能，對其進行闡明有助于擴展生物膜形成調控理論知識和開發生物膜消除的新方法。