丁香酚對藍莓鏈格孢霉的抑制作用

葛達娥，魏照輝，圖爾蓀阿依·圖爾貢,3，潘 玥，王 帆，陶寧萍，周劍忠，劉小莉,

（1.上海海洋大學食品學院，上海 201306；2.江蘇省農業科學院農產品加工研究所，江蘇 南京 210014；3.新疆師范大學生命科學學院，新疆 烏魯木齊 830054）

藍莓屬杜鵑花科、越橘屬植物，其果實含多種抗氧化物、抗菌成分和豐富的食用纖維等，具有極高的營養和保健功效[1]，經濟價值極高。但藍莓果皮柔嫩，在貯藏或者運輸中，不可避免會造成果實相互之間的碰撞而導致機械損傷發生腐爛，因此對藍莓的保鮮研究很有意義。

鏈格孢霉（Alternaria sp.）是一類普遍存在于新鮮果蔬表面并能導致果蔬在貯藏過程中發生腐敗的絲狀真菌。在前期實驗中，本實驗室從自然霉變的藍莓樣品中分離鑒定到一株鏈格孢霉，該菌株回接到新鮮藍莓樣品上，引發藍莓初期腐敗癥狀為果實表面出現黑色或褐色、塌陷的斑點，后期在腐爛區域表面產生大量的褐色菌絲[2-4]。研究表明鏈格孢霉次級代謝產物真菌毒素還會危害人體健康，造成極為嚴重的食品安全問題[5-6]。由于鏈格孢霉菌具有寄生和腐生性的特點，在-2～0 ℃下也能夠生存，通常使用的低溫貯藏、氣調保鮮等物理手段不能徹底杜絕采前及采后藍莓表面鏈格孢霉菌對果實的侵害。因此殺菌劑成為藍莓采后病害防治的主要有效手段，如采用二氧化硫[7]和二氧化氯[8]對藍莓進行熏蒸處理，可以有效殺死藍莓中的致病菌，降低藍莓的腐爛率，延長藍莓貨架期，但會造成化學殘留，危害人體健康；因此安全無毒的植物源抑菌劑的開發應用成為當今研究的熱點。

丁香酚是丁香精油的主要成分，有一定的抗菌生物活性，并能誘導果蔬內防御酶和抗氧化酶活性提高，在多種果蔬的防腐保鮮方面具有較好的應用前景，如楊梅[9]、蘋果[10]、葡萄[11-12]、西紅柿[13-14]、荔枝[15]、櫻桃番茄[16]。本研究以實驗室分離鑒定的一株鏈格孢霉為靶標菌，探究丁香酚對藍莓鏈格孢霉的抑制效果，進一步明確丁香酚對病原真菌的有效抑菌質量濃度及其抑菌機理，為后續將丁香酚應用于藍莓的保鮮提供依據。

1 材料與方法

1.1 菌株、材料與試劑

供試菌株：鏈格孢霉（Alternaria sp.），從腐敗藍莓中分離得到，鑒定后保藏于江蘇省農業科學院農產品加工研究所食品生物工程研究室。

丁香酚精油、丁香酚（純度85%） 江西金源天然香料公司；微量丙二醛（malondialdehyde，MDA）試劑盒、幾丁質酶測定試劑盒、β-1,3-葡聚糖酶活性檢測試劑盒、蛋白定量測定試劑盒 南京建成生物試劑公司；碘化丙啶（propidium iodide，PI）熒光染料 生工生物（上海）股份有限公司。

1.2 儀器與設備

HT7700透射電子顯微鏡 日本Hitachi公司；MERLIN掃描電子顯微鏡 德國ZEISS公司；TH4-200熒光倒置顯微鏡 日本Olympus公司；Epoch酶標儀美國BioTek公司；DDS-307A電導率儀 上海儀電科學儀器股份有限公司。

1.3 方法

1.3.1 鏈格孢霉孢子懸浮液、菌絲的制備

采用Lachhab等[17]的方法，將鏈格孢霉接種到PDA培養基上28 ℃培養10 d，以無菌生理鹽水洗下孢子，并用6 層紗布過濾除去菌絲。采用血球計數板對孢子進行計數，調整孢子懸浮液的孢子濃度為1×107個/mL，現用現制。

吸取孢子懸浮液1 mL加入到100 mL PDB液體培養基中，靜置培養24 h，獲得鏈格孢霉新鮮菌絲，備用。

1.3.2 丁香酚對鏈格孢霉菌絲生長抑制率的測定

采用生長速率法[18]測定丁香酚對鏈格孢霉菌絲生長的影響。分別吸取0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 mL和3.0 mL的10 mg/mL丁香酚母液（溶劑為無水乙醇，下同）加入到100 mL PDA培養基中，使丁香酚終質量濃度分別為0.05、0.10、0.15、0.20、0.25、0.30 mg/mL，混勻后倒入無菌培養皿，備用。用直徑6 mm的無菌打孔器從培養5 d的鏈格孢霉菌落邊緣位置切取菌餅，將菌絲面貼在含丁香酚培養皿和對照培養皿中，對照培養皿不含丁香酚，預實驗證明體積分數3%乙醇對菌絲生長無抑制作用。將培養皿置于28 ℃恒溫培養箱內培養7 d，采用十字交叉法測定菌落直徑，按下式計算丁香酚精油對菌絲徑向生長的抑制率。

式中：6 mm為菌落初始直徑。

1.3.3 丁香酚對鏈格孢霉孢子萌發抑制能力的測定

分別吸取一定量的丁香酚母液于1 mL的無菌PDB培養基中，將丁香酚配制成質量濃度分別為0、0.04、0.08、0.12、0.16、0.20、0.24、0.28、0.32、0.36、0.40 mg/mL的溶液，對照組為不含丁香酚的體積分數3%乙醇。取190 μL不同質量濃度的丁香酚和10 μL的孢子液（107個/mL）于96 孔板，置于28 ℃恒溫培養箱中培養2 d。用酶標儀檢測OD600nm值，以其衡量丁香酚精油對鏈格孢霉孢子萌發的抑制作用。

1.3.4 鏈格孢霉形態的觀察

1.3.4.1 鏈格孢霉菌絲和孢子形態的觀察

取1 mL孢子懸浮液和1 g濕菌絲，用0.3 mg/mL丁香酚溶液（處理組）或無菌水（對照組）處理12 h后用無菌水清洗菌絲和孢子3 次，除去丁香酚。用0.01 mol/L pH 7.0的磷酸鹽緩沖液反復沖洗菌絲和孢子3 次，置于體積分數2.5% MDA溶液中4 ℃下過夜固定。將固定好的菌絲和孢子用磷酸鹽緩沖液漂洗3 次，每次靜置10 min，除去MDA；將樣品依次置于系列體積分數為30%、50%、70%、80%、90%和100%的乙醇溶液中脫水置換，每次15 min。脫水后臨界點干燥，將干燥的菌體固定到金屬臺上，用離子濺射儀對金屬臺噴金、鍍膜，進行掃描電子顯微鏡觀察。

1.3.4.2 鏈格孢霉菌絲和孢子的超微結構觀察

將1.3.4.1節中乙醇脫水后的樣品，繼續用丙酮脫水3 次，用Epon812固定劑進行包埋，超薄切片，經醋酸鈾和檸檬酸鉛雙染色后，采用透射電子顯微鏡進行觀察和圖像采集[19]。

1.3.5 鏈格孢霉菌絲細胞膜通透性的測定

取濕質量為1 g的菌絲，置于無菌離心管中，加入20 mL無菌水懸浮菌絲。加入0.6 mL丁香酚母液，使其終質量濃度為0.3 mg/mL。置于28 ℃、100 r/min搖床中處理12 h，12 000×g、4 ℃離心10 min，收集上清液，沉淀所得的菌絲用無菌水清洗3 次，備用。對照組用無菌水替代丁香母液。

1.3.5.1 鏈格孢霉菌絲PI染色及觀察

將備用菌絲重浮于無菌水中得到菌絲懸浮液，在1 mL菌絲懸浮液中加入1 mL 2 μmol/L PI熒光探針，37 ℃避光孵育20 min后，用無菌水漂洗多余探針后置熒光顯微鏡下觀察并拍照。

1.3.5.2 鏈格孢霉菌絲可溶性蛋白質量濃度、電導率的測定

分別吸取0.05 mL 1.3.5節中處理組和對照組的上清液，按照考馬斯亮藍法測定上清液中可溶性蛋白質量濃度；并將電導率儀預熱15 min后，測定上清液的電導率。

1.3.6 鏈格孢霉菌絲相關酶活力的測定

將1.3.5節中的備用菌絲冷凍干燥后用液氮研磨至粉末狀，4 ℃保存備用。

1.3.6.1 β-1,3-葡聚糖酶活力的測定

采用β-1,3-葡聚糖酶活力檢測試劑盒，通過測定還原糖生成速率計算處理前后鏈格孢霉絲的β-1,3-葡聚糖酶活力。稱取0.1 g菌絲粉末，按質量體積比為1∶10加入β-1,3-葡聚糖酶提取液，進行冰浴勻漿。12 000 ×g、4 ℃離心10 min，取上清液，置冰上待測。按β-1,3-葡聚糖酶活力檢測試劑盒說明書對樣本進行測定，計算β-1,3-葡聚糖酶活力。每克組織每小時產生1 mg還原糖定義為一個酶活力單位。

1.3.6.2 幾丁質酶活力的測定

稱取0.1 g菌絲粉末，按1∶10（m/V）的比例加入幾丁質酶提取液，進行冰浴勻漿。12 000×g、4 ℃離心20 min，取上清液，置冰上待測。按幾丁質酶測定試劑盒說明書對樣品進行測定，計算丁香酚處理后幾丁質酶活力的變化。37 ℃條件下，每克組織每小時分解幾丁質產1 mg N-乙酰氨基葡萄糖的酶量為1 個酶活力單位。

1.4 數據統計與分析

實驗數據采用DPS軟件整理并采用Tukey多重比較方法進行方差分析（P＜0.05），用Origin Pro 8.5軟件繪制圖形。

2 結果與分析

2.1 不同質量濃度丁香酚對鏈格孢霉菌絲生長的抑制作用

圖1 不同質量濃度丁香酚對鏈格孢霉菌絲生長的抑制效果Fig. 1 Inhibitory effect of eugenol at different concentrations on the growth of Alternaria sp.

由圖1可以看出，丁香酚對鏈格孢霉菌絲徑向生長抑制作用效果隨丁香酚質量濃度升高而增強，即呈現一定的劑量效應。當丁香酚質量濃度為0.05 mg/mL時，丁香酚對鏈格孢霉絲生長就表現出抑制作用，其抑制率為（18.38±0.89）%；丁香酚質量濃度由0.05 mg/mL增至0.15 mg/mL時，其對鏈格孢霉菌絲生長的抑制率提高了2.89 倍；丁香酚質量濃度增加至0.25 mg/mL時，菌絲生長抑制率高達（95.89±0.32）%。當丁香酚質量濃度為0.30 mg/mL，鏈格孢霉菌絲完全停止生長。

2.2 丁香酚對鏈格孢霉孢子萌發的最小抑菌濃度

如圖2所示，隨著丁香酚質量濃度的提高，OD600nm值逐漸降低，表明丁香酚對鏈格孢霉孢子萌發抑制作用增強。對照組的OD600nm值為2.89±0.38，當丁香酚質量濃度上升為0.04 mg/mL時，其OD600nm值為2.69±0.23，與對照組無顯著性差異（P＞0.05），即研究條件下質量濃度低于0.04 mg/mL的丁香酚對孢子的萌發無顯著作用；當質量濃度達到0.12 mg/mL時，OD600nm值為1.59±012，較丁香酚質量濃度為0.04 mg/mL時顯著減小（P＜0.05），說明0.12 mg/mL丁香酚對孢子的萌發抑制作用增強；丁香酚質量濃度提高到0.24 mg/mL時，OD600nm值為0.13±0.01，相比于質量濃度為0.12 mg/mL時顯著減小（P＜0.05），鏈格孢霉的孢子萌發受到強烈抑制。當丁香酚質量濃度在0.28～0.40 mg/mL時，OD600nm值無顯著性差異（P＞0.05），即丁香酚對鏈格孢霉孢子萌發的最小抑制質量濃度為0.24 mg/mL。

2.3 丁香酚對鏈格孢霉菌絲細胞膜的影響

圖3 丁香酚對鏈格孢霉菌絲細胞死亡的影響Fig. 3 Effect of eugenol on cell death of hyphae of Alternaria sp.

圖4 丁香酚對鏈格孢霉菌絲細胞內容物泄漏的影響Fig. 4 Effect of eugenol on the leakage of intracellular contents from mycelia of Alternaria sp.

PI是一種常用的細胞核熒光染色劑，與細胞核中的DNA結合后，可在綠色光（540 nm波長）的激發下，在600 nm波長（紅色光）處發出明亮的熒光[20]。PI不能透過完整細胞膜，當真菌菌絲細胞膜受到損傷后方可進入菌絲內部與核酸結合發出熒光。由圖3可知，對照組菌絲在綠色光激發下無紅色熒光出現，而經0.3 mg/mL的丁香酚處理后的菌絲出現了紅色熒光，說明鏈格孢霉的菌絲細胞膜受到損傷。

細胞膜受到損傷將表現為膜透性增加和電解質外滲速率加快，通過測定菌絲胞外可溶性蛋白質量濃度和電導率可以了解真菌細胞膜通透性的變化。由圖4可知，處理組的可溶性蛋白質量濃度和電導率較對照組均有所提高，且差異顯著（P＜0.05），處理組的可溶性蛋白質量濃度和電導率分別是對照組的1.18 倍和8.02 倍。由此推測丁香酚破壞了鏈格孢霉菌絲的細胞膜，使得膜通透性增加，內容物泄漏，進而導致菌絲死亡。

2.4 丁香酚對鏈格孢霉孢子和菌絲形態的影響

圖5 鏈格孢霉孢子（A）和菌絲（B）掃描電子顯微鏡圖Fig. 5 SEM images of Alternaria sp. spores (A) and hyphae (B)

如圖5所示，0.3 mg/mL的丁香酚對鏈格孢霉菌絲生長及孢子萌發有明顯抑制作用，與對照組相比，0.3 mg/mL丁香酚處理后的鏈格孢霉孢子和菌絲表面形態不再完整、光滑，出現了較深的凹陷；孢子無芽管抽出，菌絲周邊呈現明顯的內容物泄漏。因此，0.3 mg/mL的丁香酚可以導致鏈格孢霉發生裂解，胞內部分物質流出，使孢子失去萌發的能力，菌絲停止生長。

2.5 丁香酚對鏈格孢霉孢子和菌絲超微結構的影響

圖6 鏈格孢霉孢子（A）和菌絲（B）透射電子顯微鏡圖Fig. 6 TEM images of Alternaria sp. spores (A) and hyphae (B)

掃描電子顯微鏡結果顯示丁香酚對鏈格孢霉形態完整性有一定的破壞作用，進一步于透射電子顯微鏡下觀察丁香酚對鏈格孢霉孢子及菌絲的內部變化影響。如圖6所示，未經丁香酚處理的鏈格孢霉的孢子和菌絲具有完整的細胞壁以及完整光滑的細胞膜結構，細胞結構緊密，胞質比較均勻；而經丁香酚處理作用后，孢子細胞壁出現了溶解，孢子和菌絲的細胞質發生固縮，引起細胞的質壁分離，已看不到完整的細胞器。可見，丁香酚對鏈格孢霉的細胞壁有明顯的破壞作用，對細胞器形成也有一定影響，這可能是丁香酚抑制孢子萌發及菌絲生長的重要原因。

2.6 丁香酚對鏈格孢霉菌體相關酶活力的影響

真菌細胞壁的主要成分為多糖，其中多糖主要包括幾丁質、纖維素、葡聚糖等。因幾丁質酶可以催化幾丁質水解，β-1,3-葡聚糖酶能催化β-1,3-葡聚糖苷鍵水解；因此，當細胞中的幾丁質酶和β-1,3-葡聚糖酶活力升高時，細胞壁的重要組成成分減少，使細胞壁結構遭到破壞。

圖7 丁香酚處理對鏈格孢霉菌絲幾丁質酶和β-1, 3-葡聚糖酶活力的影響Fig. 7 Effect of eugenol treatment on chitinase and β-1,3-glucanase activity of Alternaria sp.

由圖7可知，與對照組相比，丁香酚處理鏈格孢霉絲體12 h后，幾丁質酶活力由（0.24±0.03）U/g上升到（0.81±0.04）U/g，β-1,3-葡聚糖酶活力由（0.60±0.05）U/g上升到了（0.90±0.04）U/g。經丁香酚處理后，鏈格孢霉菌絲幾丁質酶和β-1,3-葡聚糖酶的活力顯著升高，分別升高了2.37 倍和50%。幾丁質酶和β-1,3-葡聚糖酶的活力顯著升高，導致這兩種酶控制的細胞壁上幾丁質和葡聚糖含量降低，這一結果與透射電子顯微鏡下觀察到的細胞壁完整性被破壞一致。

3 討 論

丁香酚易從可食用的香料中進行提取，毒性較低，不易殘留，對食品中常見的腐敗菌和產毒素菌的生長有明顯抑制作用[21-23]。本實驗研究發現，不同質量濃度的丁香酚對鏈格孢霉的菌絲生長和孢子萌發都有抑制作用，且呈現一定的劑量效應，與已有研究的結論[24]相符。當丁香酚質量濃度為0.3 mg/mL時，能夠完全抑制鏈格孢霉菌絲生長和孢子的萌發，余興等[25]以500 μL/L的薰衣草精油、薄荷精油和葡萄籽精油直接作用鏈格孢霉，其抑制率分別為90.18%、87.09%和2.0%；許倩等[26]研究發現大蒜精油對鏈格孢霉的最小抑菌劑量為1.25 μL/L，說明丁香酚在抑制鏈格孢霉生長上更有優勢。生物細胞膜是一種具有選擇性的半透膜，有些抗菌物質能夠破壞細胞膜的通透性，從而干擾細胞正常的物質運輸[27]。目前的研究普遍認為植物源化合物作用于微生物時，主要是通過破壞細胞膜、增大膜的選擇通透性、降低微生物膜的穩定性來達到抑菌效果[28-30]。房舒等[31]在研究蛇床子素結構修飾物JS-B對辣椒疫霉作用機制時發現，JS-B處理的菌絲經PI染色后未見熒光現象，而陽性對照組Cu2+處理相同時間則出現紅色熒光；與本研究的PI染色結果一致，推測丁香酚主要通過引起鏈格孢霉細胞膜通透性增大，造成細胞死亡從而達到抑菌效果。Stein[32]研究認為細胞壁對細胞起著定型和保護的作用，細胞壁受到損傷會使細胞壁上的纖維原變形。李姝毅等[33]研究發現，經丁香酚作用后，阿薩希毛孢子菌菌體出現腫脹膨大、干癟變形，部分菌絲胞壁破壞，隨著丁香酚藥液質量濃度的增加，整個菌絲完全被破壞，胞質外溢。在掃描電子顯微鏡和透射電子顯微鏡的觀察下，經0.3 mg/mL丁香酚處理后的鏈格孢霉孢子和菌絲出現凹陷、細胞壁裂解等現象；因此，推測丁香酚破壞了鏈格孢霉的細胞壁，以致孢子失去萌發能力，菌絲停止生長。幾丁質酶和β-1,3-葡聚糖酶能夠催化水解真菌細胞壁重要組成成分幾丁質和葡聚糖。胡平[34]研究發現草果精油處理葡萄灰霉病菌，能在一定程度上引起灰霉病菌產生葡萄糖饑餓現象，刺激幾丁質酶活性的升高，不斷降解真菌細胞壁，破壞真菌細胞壁的完整性，引起細胞內滲透壓不穩定，導致真菌細胞溶解死亡。本實驗中經0.3 mg/mL丁香酚處理后的鏈格孢霉幾丁質酶和β-1,3-葡聚糖酶活力顯著提高，說明丁香酚可以作用于鏈格孢霉的細胞壁及細胞膜，破壞菌體的完整性，使得胞內物質向外泄漏，同時使丁香酚更易擴散進入胞內，破壞細胞器，而起到殺菌作用。

雖然有關丁香酚殺菌機理的研究報道較多[35-36]，但針對鏈格孢霉的機理研究卻很少。魏月琴等[37]研究發現，鹿蹄草素可以增加鏈格孢病菌細胞膜透性，影響病原真菌體內蛋白質的合成，進而抑制鏈格孢霉的生長抑制作用。張素等[38]對黑曲霉超臨界萃取物抑制鏈格孢作用機制進行研究，發現其抑菌機制是通過影響細胞膜的正常功能、損傷細胞結構和抑制真菌的呼吸代謝等方面實現的。本實驗從丁香酚處理后鏈格孢霉形態和生理生化變化研究了丁香酚對鏈格孢霉的抑制機理，后續可以對受抑制鏈格孢霉菌體蛋白含量、呼吸代謝方面作進一步研究，以更深入了解丁香酚對鏈格孢霉的作用機制，為丁香酚直接用于藍莓保鮮提供理論依據。

綜上，丁香酚對鏈格孢霉菌絲的生長和孢子萌發有一定的抑制效果，且抑制效果隨丁香酚質量濃度的提高而增強。0.3 mg/mL的丁香酚可以增大鏈格孢霉菌絲細胞膜的通透性，引起鏈格孢霉菌絲幾丁質酶和β-1,3-葡聚糖酶活力的升高，導致細胞壁出現裂解，細胞器出現損傷，胞內物質流出，從而抑制鏈格孢霉的生長。