果膠/酪蛋白酸鈉復合運載體系的構建及對番茄紅素的控釋機理

王擎宇，王夢遙，黃慧敏，蔣 云，董會彬，陳 蕾

（安徽大學生命科學學院，安徽省生態工程與生物技術重點實驗室，安徽 合肥 230601）

番茄紅素是一種極具開發前景的脂溶性功能成分，具有多種生理活性[1-4]。然而，番茄紅素的加工穩定性差、生物利用度低[5-6]。目前，國內外大多通過單一的大分子載體來構建運載體系[7-9]，從而實現對脂溶性食品功能因子的負載與控制釋放。如利用一些大分子食品原料（大豆分離蛋白、糊化玉米淀粉等）作為載體，制備微膠囊[10]、納米乳狀液[11]和納米脂質體[12]等對功能成分進行包埋和裝載，借助這些特殊的載體系統實現活性物質在體內的運輸。然而，對于不穩定且具光敏性的脂溶性功能因子，環境條件對載體系統的穩定性影響較大。而且單一載體體系容易分散而產生聚沉現象，造成營養組分的快速釋放（突釋）而不利于其吸收和利用。

蛋白質和多糖可以通過組裝來構建納米粒子等納米復合體系[13-14]，該體系擁有蛋白質的疏水自組裝特性和多糖良好的溶解性，可以用來輸送疏水性的功能活性成分，大分子的空間位阻效應可有效抑制顆粒間的聚集、沉降，加之良好的生物相容性、較強的抗壓、抗熱能力及環境適應性，可以滿足不同活性物質的需求。酪蛋白是牛奶、羊奶和人奶中的主要蛋白質，可被視為由親水性氨基酸和疏水性氨基酸所構成的兩親嵌段型共聚物[15-16]。酪蛋白的結構特征賦予其眾多的功能特性，包括與離子和小分子的結合性能以及良好的表面活性、穩定性、成膠性和親水性等。而果膠是一種帶有負電荷的多糖，溶解后具有合適的黏度、良好的成膜性和生物黏附性，而且無毒、生物相容性好，在胃中不被降解，直至腸道才可發生生物降解，是一種良好的靶向載體材料[17-18]。

基于此，本研究通過靜電聚合的方法，將帶正電荷的酪蛋白酸鈉和帶負電荷的果膠通過靜電相互作用制備聚電解質復合納米粒子，復合納米粒子在水相中可形成核殼結構[19]的球狀膠束，可以用于包埋番茄紅素（圖1），酪蛋白酸鈉通過氫鍵和疏水相互作用提供結合生物活性化合物的親和力，從而有助于提高包埋效率，而果膠作為屏障防止胃液條件下蛋白質的酶降解，從而保障腸內包埋化合物的持續釋放[20]。

圖1 果膠/酪蛋白酸鈉復合運載體包埋番茄紅素的原理Fig. 1 Principle for the encapsulation of lycopene in pectin/sodium caseinate composite carrier

本實驗構建負載番茄紅素的果膠/酪蛋白酸鈉復合運載體系，研究番茄紅素的添加量對番茄紅素的封裝效率；通過傅里葉變換紅外光譜（Fourier transforminfrared spectroscopy，FT-IR）、透射電子顯微鏡（transmission electron microscope，TEM）、熱重分析（thermogravimetric analysis，TGA）、差示掃描量熱（differential scanning calorimetry，DSC）儀對三元復合物納米粒子進行表征，分析復合物的粒徑分布、化學結構和表觀形態；構建體外模擬胃、腸道消化模型，以包埋率和裝載量為指標，研究番茄紅素在不同pH值和不同濃度消化道模擬液（模擬胃液、腸液）中的釋放行為，測定番茄紅素的釋放效率，同時對番茄紅素的胃腸道控制釋放機制進行初步探討。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

果膠 阿拉丁試劑（上海）有限公司；番茄紅素、酪蛋白酸鈉 上海麥克林生化科技有限公司；乙酸乙酯、胃蛋白酶、胰蛋白酶、脫氧膽酸鹽 合肥拜爾迪化學科技有限公司；氫氧化鈉、氯化鈉、磷酸二氫鉀、濃鹽酸 國藥集團化學試劑有限公司。

1.2 儀器與設備

TU-1901雙光束紫外-可見分光光度計 北京普析通用儀器有限責任公司；KQ5200E超聲波清洗器 昆山市超聲儀器有限公司；3K15離心機 德國Sigma公司；HH-S4數顯恒溫水浴鍋 金南儀器制造有限公司；Mastersizer 3000激光粒度儀 英國馬爾文儀器有限公司；真空冷凍干燥機 德國Marin Christ公司；JEM-2100高分辨TEM 日本電子株式會社；Q2000 DSC儀美國TA儀器公司；VERTEX 80傅里葉變換紅外顯微聯機系統 德國Bruker公司；STA 449 F3同步熱分析儀 德國NETZSCH公司。

1.3 方法

1.3.1 果膠/酪蛋白酸鈉聚電解質復合納米粒子的構建

取5 份200 mg酪蛋白酸鈉粉末，分別與20、40、60、80 mg果膠混合，加25 mL去離子水，超聲振蕩使其溶解，用稀NaOH溶液調節至pH 7.0，經透析后保存于4 ℃冰箱備用。

1.3.2 番茄紅素標準曲線的繪制

準確稱量2.5 mg番茄紅素溶于乙酸乙酯中，定容至50 mL，制成質量濃度為50 μg/mL的儲備液，準確移取0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL儲備液于試管，加乙酸乙酯至5 mL，使番茄紅素終質量濃度分別為0、2.0、4.0、6.0、8.0、10.0 μg/mL，以零點管作空白，于471 nm波長處[21]測定吸光度A，以番茄紅素質量濃度為橫坐標，吸光度為縱坐標，繪制標準曲線，得回歸方程：y＝0.241 5x，R2＝0.999 3，線性關系良好。

1.3.3 果膠/酪蛋白酸鈉比例的確定

以番茄紅素/二元復合物的質量比為10%進行實驗，按表1取不同果膠/酪蛋白酸鈉質量比二元復合物，并按比例添加番茄紅素，超聲混勻20 min，在6 000 r/min、4 ℃下離心8 min，棄去上清液，加3～4 mL乙酸乙酯，在6 000 r/min、4 ℃下離心8 min，取上清液，重復3 次，將上清液置于容量瓶中定容，測吸光度，按公式（1）計算包埋率。

式中：m為加入到二元復合物中番茄紅素總質量/mg；A471nm為471 nm波長處樣品吸光度平均值；V為上清液定容后總體積/mL。

表1 果膠/酪蛋白酸鈉質量比為10%、20%、30%、40%的果膠/酪蛋白酸鈉-番茄紅素的制備Table 1 Preparation of SC/pectin-lycopene with pectin/SC mass ratios of 10%, 20%, 30% and 40%

1.3.4 番茄紅素/二元復合物比例質量比（負載率）的確定

負載率按公式（2）計算。

以果膠/酪蛋白酸鈉質量比為20%進行實驗，按表2取果膠/酪蛋白酸鈉溶液，并分別按負載率為4%、8%、10%、12%、16%添加番茄紅素，按1.3.3節超聲混勻20 min及后續方法測定吸光度并計算包埋率。

表2 負載率為4%、8%、10%、12%、16%的果膠/酪蛋白酸鈉-番茄紅素的制備Table 2 Preparation of SC/pectin-lycopene with loading rates of 4%,8%, 10%, 12% and 16%

1.3.5 結構表征及指標測定

配制果膠/酪蛋白酸鈉質量比20%的二元復合物和果膠/酪蛋白酸鈉質量比20%、番茄紅素負載率為8%的三元復合物，置于-80 ℃冰箱冷凍2 h，用凍干機凍干備用。

1.3.5.1 粒徑、PDI測定

將番茄紅素分別與不同比例的果膠/酪蛋白酸鈉（10%、20%、30%、40%）按質量比8%混合，并將其中未溶解及未被復合的番茄紅素過濾，用Mastersizer 3000激光粒度儀測定三元復合物的粒徑及多分散性指數（polydispersity index，PDI）。

1.3.5.2 TEM觀察

分別用取適量二元和三元復合物液體樣品，將其置于到濾紙上的銅網上，使用紅外燈烤干后進行TEM觀察。

1.3.5.3 FT-IR分析

分別取適量番茄紅素、果膠、酪蛋白酸鈉標準品和質量比20%果膠/酪蛋白酸鈉、番茄紅素負載率為8%的三元復合物凍干粉與KBr粉末混合研磨壓片，在4 000～400 cm-1波數范圍內進行FT-IR掃描[22]。

1.3.5.4 DSC分析

實驗中持續充氮氣，流量為20 mL/min，升溫速率為10 ℃/min，凍干樣品添加到鋁制小皿中，控制質量為1～3 mg，精確到0.01 mg，在0～300 ℃范圍內進行掃描[22]。

1.3.5.5 熱重分析

實驗中持續充氮氣，流量為20 mL/min，升溫速率為10 ℃/min，凍干樣品添加到鋁制小皿中，控制質量為1～3 mg，精確到0.01 mg，在0～800 ℃范圍內進行TGA[22-23]。

1.3.6 胃、腸模擬液的制備

胃模擬液配制[23]：將0.05 g氯化鈉、0.2 mL濃鹽酸、0.08 g胃蛋白酶溶于水，定容至25 mL，pH值約為1.0，在7 000 r/min、4 ℃下離心20 min，取上清液待用，在4 ℃冰箱保存。

腸模擬液配制[23]：將0.17 g磷酸二氫鉀、0.038 g氫氧化鈉溶于水，加0.25 g胰蛋白酶和0.125 g脫氧膽酸鹽，定容至25 mL，用氫氧化鈉溶液調pH值為7.5左右，在7 000 r/min、4 ℃下離心20 min，取上清液為待用液，在4 ℃冰箱保存。

1.3.7 胃腸道釋放率的測定

配制果膠/酪蛋白酸鈉質量比為20%的二元復合物溶液備用。

取6 mL二元復合物，加5 mg番茄紅素，超聲混勻，作為樣品備用。取5 支離心管，每支離心管中加入1 mL上述混勻后的樣品和4 mL胃模擬液混勻，立即置于37 ℃水浴鍋中分別水浴0、0.5、1、2、4 h，水浴完成后，在6 000 r/min、4 ℃下離心8 min，棄去上清液，加3～4 mL乙酸乙酯，在6 000 r/min、4 ℃下離心8 min，取上清液，重復3 次，將上清液置于容量瓶中定容，測吸光度[23]，計算釋放率。

取6 mL二元復合物，加5 mg番茄紅素，超聲混勻，作為樣品備用。取5 支離心管，每支離心管中加入1 mL上述混勻后的樣品和4 mL腸模擬液混勻，立即置于37 ℃水浴鍋中分別水浴0、0.5、1、2、4 h，水浴完成后，在6 000 r/min、4 ℃下離心8 min，棄去上清液，加3～4 mL乙酸乙酯，在6 000 r/min、4 ℃下離心8 min，取上清液，重復3 次，將上清液置于容量瓶中定容，測吸光度[23]，按式（3）計算釋放率。

式中：V為上清液定容總體積/mL；m為1 mL三元復合物中所含番茄紅素質量/mg。

1.4 數據統計分析

數據以平均值±標準差表示，采用Origin Pro 8軟件制圖。

2 結果與分析

2.1 果膠/酪蛋白酸鈉復合運載體系的構建結果

圖2 負載率為10%時果膠/酪蛋白酸鈉對番茄紅素的包埋率Fig. 2 Encapsulation rates of lycopene by pectin/sodium caseinate at loading rate of 10%

如圖2所示，在番茄紅素/二元復合物的質量比例為10%的條件下，根據各樣品在471 nm波長處的吸光度計算果膠/酪蛋白酸鈉質量比為10%、20%、30%、40%時對番茄紅素的包埋率，分別為95.74%、96.37%、93.63%、93.15%，果膠/酪蛋白酸鈉質量比為20%時，二元復合物對番茄紅素的包埋率最高。

圖3 果膠/酪蛋白酸鈉質量比為20%時不同負載率番茄紅素的包埋率Fig. 3 Encapsulation rates of lycopene with different loading rates and pectin/sodium caseinate ratio of 20%

如圖3所示，在果膠/酪蛋白酸鈉質量比為20%的條件下，根據各樣品在471 nm波長處的吸光度計算獲得當負載率為4%、8%、10%、12%、16%時二元復合物對番茄紅素的包埋率分別為85.30%、96.93%、93.09%、79.70%、84.68%，結果表明，當負載率即番茄紅素/二元復合物為8%時，二元復合物對番茄紅素的包埋率最高。

2.2 粒徑、PDI分析結果

圖4 三元復合物的粒徑及PDIFig. 4 Particle size and PDI of ternary nanocomposites

將番茄紅素與不同質量比的果膠/酪蛋白酸鈉按8%比例混合，測定三元復合物的粒徑及PDI。如圖4所示，當果膠/酪蛋白酸鈉質量比為20%時，復合物粒徑和PDI最小，果膠/酪蛋白酸鈉/番茄紅素負載包埋效果較好。

2.3 TEM觀察結果

圖5 果膠/酪蛋白酸鈉二元復合物（A）和番茄紅素-果膠/酪蛋白酸鈉三元復合物的TM圖（B）Fig. 5 TEM images of pectin/sodium caseinate (A) and lycopene-pectin/sodium caseinate (B) complexes

如圖5所示，在TEM下可清晰地看到球狀納米級果膠/酪蛋白酸鈉二元復合物和番茄紅素-果膠/酪蛋白酸鈉三元復合物已經形成，對比圖5A、B，包埋番茄紅素對復合物粒徑大小幾乎沒有影響，這種現象表明果膠和酪蛋白酸鈉之間并不是簡單的物理混合，而是形成一種球形核殼結構，這種核殼結構可以有效包埋番茄紅素，使疏水的番茄紅素通過這種運載方式變為可溶于水的狀態。

2.4 FT-IR分析結果

圖6 番茄紅素、果膠、酪蛋白酸鈉、二元復合物和三元復合物FT-IR圖Fig. 6 FT-IR spectra of lycopene, pectin, sodium caseinate, and their binary and ternary complexes

由圖6可知，在番茄紅素FT-IR曲線中，3 420 cm-1是水蒸氣的特征吸收峰，3 039 cm-1處是＝C-H伸縮振動吸收峰，2 970 cm-1處是不對稱甲基振動吸收峰，2 856 cm-1為甲基和亞甲基的伸縮振動峰[24]，這說明有甲基、亞甲基的存在，1 627 cm-1處的峰是由C＝C的伸縮振動產生，13 82 cm-1處的峰是由甲基的彎曲振動產生，960 cm-1處是反式單烯雙取代的R1HC＝CR2H（反式）搖擺振動吸收峰。

在酪蛋白酸鈉FT-IR曲線中，3 316 cm-1處的吸收峰主要是N-H的伸縮振動和部分O-H的伸縮振動疊加后的寬峰，2 962 cm-1處的吸收峰為C-H的伸縮振動引起，1 656 cm-1處的吸收峰為酰胺I帶-C＝O的伸縮振動引起，1 537 cm-1處的吸收峰為酰胺II帶C-N的伸縮振動和N-H的彎曲振動引起，1 450 cm-1為C-H的彎曲變形振動吸收峰，1 242、1 083 cm-1處為C-O的伸縮振動[25]。

在果膠FT-IR曲線中，3 500 cm-1處強而寬的吸收峰是由于O-H伸縮振動引起的，另一處弱吸收峰（2 937 cm-1）是C-H伸縮振動引起的。在1 645 cm-1處的吸收峰是由于O-H的彎曲振動引起的。在1 151、1 024 cm-1處的吸收峰為呋喃糖的特征吸收峰。在1 741 cm-1處有典型的糖醛酸的特征吸收峰[18]。

在果膠/酪蛋白酸鈉二元復合物FT-IR曲線中，保留了酪蛋白酸鈉的C-H伸縮振動引起的2 962 cm-1處的吸收峰，而酪蛋白酸鈉1 083 cm-1處的C-O的伸縮振動和果膠1 024 cm-1處的呋喃糖的特征吸收峰消失。酪蛋白酸鈉1 656 cm-1處酰胺I帶-C＝O的伸縮振動、1 537 cm-1處的酰胺II帶C-N的伸縮振動和果膠1 645 cm-1處O-H的彎曲振動引起的吸收峰，在果膠/酪蛋白酸鈉二元復合物中形成了一個較寬的峰（1 500～1 700 cm-1），且峰強度更高，表明酪蛋白酸鈉和果膠相互作用形成了相對穩定的果膠/酪蛋白酸鈉二元復合物，而不是簡單的物理混合。果膠/酪蛋白酸鈉二元復合物和負載番茄紅素的果膠/酪蛋白酸鈉三元復合物的FT-IR曲線走向很相似，負載番茄紅素的果膠/酪蛋白酸鈉三元復合物的FT-IR圖中番茄紅素的特征吸收峰大幅減弱或者消失，說明番茄紅素已經被包含在果膠/酪蛋白酸鈉運載體中。

2.5 DSC分析結果

圖7 番茄紅素、二元復合物和三元復合物的DSC圖譜Fig. 7 DSC patterns of lycopene, binary complex and ternary complex

如圖7所示，可以看到番茄紅素在174 ℃有一個短暫尖銳的晶體熔融峰，表明番茄紅素以晶體形式存在[26]。果膠/酪蛋白酸鈉二元復合物在200 ℃之前沒有熔融峰，制備的負載番茄紅素的果膠/酪蛋白酸鈉三元復合物的DSC圖譜中沒有出現番茄紅素晶體熔融峰，再次說明番茄紅素以無定形形式存在于粉末顆粒中，表明果膠/酪蛋白酸鈉-番茄紅素復合物的形成。

2.6 TGA結果

圖8 番茄紅素、二元復合物和三元復合物TGA圖Fig. 8 Thermogravimetric curves of lycopene, binary complex and ternary complex

如圖8所示，參考文獻[27]進行分析，番茄紅素在70 ℃附近有一個很小的質量損失區域，主要是由于水分受熱揮發形成；在175 ℃附近的質量損失區域，是由于番茄紅素的分解形成。同樣地，果膠/酪蛋白酸鈉二元復合物在180 ℃前的質量損失區域，主要是由于水分受熱揮發；第二質量損失區域是由于果膠/酪蛋白酸鈉二元復合物的分解，從220 ℃開始。負載番茄紅素的果膠/酪蛋白酸鈉三元復合物與果膠/酪蛋白酸鈉二元復合物相比，其在第一質量損失區域呈現一種緩慢的質量損失狀態，這主要是因為果膠/酪蛋白酸鈉二元復合物空腔中包合的番茄紅素使負載番茄紅素的果膠/酪蛋白酸鈉三元復合物在180 ℃之前的質量損失過程減弱，同時這種現象一直持續到果膠/酪蛋白酸鈉二元復合物的熱降解階段。第二質量損失區域對應負載番茄紅素的果膠/酪蛋白酸鈉三元復合物的熱分解，其溫度由番茄紅素的174 ℃和果膠/酪蛋白酸鈉二元復合物的220 ℃上升到250 ℃。從上述TGA結果可知，負載番茄紅素的果膠/酪蛋白酸鈉三元復合物已經形成，且果膠/酪蛋白酸鈉二元復合物的包合作用可明顯提高番茄紅素的熱穩定性。

2.7 胃腸道釋放模擬分析結果

圖9 復合運載體在模擬胃液中對番茄紅素的釋放過程Fig. 9 Release of lycopene in simulated gastric fluid

如圖9所示，在胃液模擬中，計算獲得在0、0.5、1.0、2.0、4.0 h時復合運載體對番茄紅素的釋放率分別為8.94%、16.67%、30.60%、26.90%、20.21%。人體消化過程中胃排空時間一般為2～4 h[28]，其中液體為5～10 min[29]，若復合運載體包埋番茄紅素以溶液的形式進入胃，那么其停留的時間將是很短的。實驗表明，在0～4 h的整個過程中，復合運載體釋放番茄紅素的量很少，釋放速率較為緩慢；在0.5～1.0 h時，復合運載體釋放番茄紅素的量在逐漸變大，釋放速率也在逐漸加快，在1 h時達到峰值，然后釋放率逐漸下降；在4 h時，復合運載體仍保留部分番茄紅素未釋放，說明所構建的果膠/酪蛋白酸鈉復合運載體能夠在胃消化過程中控制釋放番茄紅素，讓更多的番茄紅素進入小腸被人體吸收。

由圖9可見，在0～1 h時，復合運載體釋放番茄紅素的量在逐漸變大，釋放速率也在逐漸加快，在1～2 h存在一個峰值，然后釋放率逐漸下降。對于此現象，提出一種假設：果膠/酪蛋白酸鈉復合運載體對番茄紅素的包埋是一個動態過程，即運載體在吸收番茄紅素的同時伴隨著番茄紅素的釋放，當向果膠/酪蛋白酸鈉溶液中投入番茄紅素時吸收量遠大于釋放量，隨著時間延長，吸收率與釋放率達到動態平衡，果膠/酪蛋白酸鈉復合運載體對番茄紅素實現包埋；當負載著番茄紅素的果膠/酪蛋白酸鈉進入模擬胃液時，酪蛋白酸鈉部分分解，由于果膠作為屏障抑制胃液條件下蛋白質的酶降解，使釋放量率略高于吸收量（0～1 h），保持番茄紅素的低釋放狀態；達到峰值（釋放速率等于吸收速率，釋放速率有下降趨勢，吸收速率有上升趨勢）后，隨著時間延長，釋放量又低于吸收量，最后趨于平衡，推測原因可能是胃蛋白酶對酪蛋白酸鈉的消化作用與果膠對酪蛋白酸鈉的保護作用趨于平衡后，果膠/酪蛋白酸鈉復合物又保持一個相對穩定的狀態，使得核殼結構內部空間相對穩定，而且呈現一種不飽和的狀態，于是對核殼結構外不溶于水相的番茄紅素吸收量增大，從而出現釋放曲線后半段釋放率下降的現象。

圖10 復合運載體在模擬腸液中對番茄紅素的釋放過程Fig. 10 Release of lycopene in simulated intestinal fluid

如圖10所示，在腸道模擬中，計算獲得在0、0.5、1.0、2.0、4.0 h時復合運載體對番茄紅素的釋放率分別為14.3%、38.4%、50.2%、61.2%、62.3%。復合運載體進入腸模擬液后，隨時間延長，釋放率逐漸增大。

理想狀態下，果膠/酪蛋白酸鈉復合運載體在腸模擬液中應該完全釋放番茄紅素，但實際上并不是，果膠在胃和小腸中不易被消化，在結腸才被完全消化[30]，果膠在腸中仍具有保護酪蛋白酸鈉的作用，使得酪蛋白酸鈉被大量水解而不是全部水解，所以仍有少部分運載體保持較為穩定的核殼結構，從而使番茄紅素釋放率曲線后段趨于穩定，釋放量與吸收量趨于動態平衡。

3 結 論

本研究通過靜電聚合的方法構建果膠/酪蛋白酸鈉聚電解質復合納米粒子，實現了對番茄紅素的負載和包埋，當果膠和酪蛋白酸鈉的質量比為20%、番茄紅素負載率為8%時包埋效果最佳，包埋率達到96.93%，此時復合物粒徑和PDI最小，表觀形態良好。FT-IR、DSC、TGA結果表明負載番茄紅素的果膠/酪蛋白酸鈉復合物已經形成，而且顯著提高了番茄紅素的穩定性。體外胃腸道模擬實驗結果說明果膠/酪蛋白酸鈉復合運載體系能夠控制釋放番茄紅素，使番茄紅素在胃消化過程中較少地釋放出來，而更多地進入腸道釋放，同時推測果膠/酪蛋白酸鈉復合運載體對番茄紅素的包埋和控釋是一個動態過程。本研究為番茄紅素的高效利用提供依據，拓寬了其在食品工業上的應用范圍。