表沒食子兒茶素沒食子酸酯對L-茶氨酸調節小鼠血清及腸道游離氨基酸的影響

彭影琦，袁冬寅，林 玲，龔志華，孫洪波，王 恒，王松柏，肖文軍,

（1.湖南農業大學 茶學教育部重點實驗室，湖南 長沙 410128；2.永州市農業科學研究所，湖南 永州 425100；3.湖南農業大學 國家植物功能成分利用工程技術研究中心，湖南 長沙 410128）

綠茶是我國生產量和消費量最大的茶類，它富含茶多酚、L-茶氨酸、生物堿等多種生物活性物質，具有抗氧化、抗腫瘤、抗輻射、降血脂等多種健康作用[1]。研究表明，綠茶能降低胃腸道木聚糖酶活性，提高蛋白酶、淀粉酶活性并能調節腸道菌落[2]，降低腸道對脂質[3]、糖類[4]物質的吸收；綠茶中的L-茶氨酸可以調節腸道氨基酸的吸收[5]，提示綠茶及其主要成分對機體營養代謝有一定影響。表沒食子兒茶素沒食子酸酯（epigallocatechin gallate，EGCG）是綠茶中的主要生物活性成分之一，與綠茶防癌、抗氧化、抗突變等功能密切相關。研究表明，EGCG不但可以改善腸道黏膜損傷，抑制炎癥因子的產生，預防小鼠腸纖維化[6]，使腸道微生物群的結構穩定、益生菌富集[7]，還可以通過調節興奮性和抑制性氨基酸平衡，提高腦缺血損傷中突觸傳遞的效率[8]，并可以抑制腸道細胞吸收葡萄糖[9]。蛋白質是生活細胞中含量最豐富、功能最復雜的生物大分子，是機體三大營養物質之一，攝入后分解成氨基酸或小肽從而被機體吸收，機體對蛋白質的需求，其實是機體對氨基酸的需求[10]。盡管研究表明茶葉及其成分對機體吸收營養物質有一定的影響，但是對于綠茶中的L-茶氨酸與EGCG對小鼠血清及腸道游離氨基酸是否有協同調節作用目前鮮有研究報道。本實驗以4 周齡雄性昆明小鼠為實驗對象，以L-茶氨酸、EGCG、速溶綠茶以及參照速溶綠茶中EGCG與L-茶氨酸的（質量比4∶1）配制而成的L-茶氨酸+EGCG混合物為原料，連續灌喂28 d，探究EGCG對L-茶氨酸調節小鼠血清及腸道游離氨基酸的影響，為促進食品營養干預多元化發展及茶葉功能成分利用提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 動物、材料與試劑

4 周齡雄性SPF級昆明小鼠，體質量（20±2）g，購自湖南斯萊克景達實驗動物有限公司，生產許可證號：SCXK（湘）2016-0002。

L-茶氨酸、EGCG（純度≥98%）、速溶綠茶（茶多酚47.21%（質量分數，下同）、咖啡堿8.35%、兒茶素22.65%、EGCG 9.76%、氨基酸4.56%、L-茶氨酸2.43%）湖南三福生物科技有限公司；磺基水楊酸 國藥集團化學試劑有限公司；堿性磷酸酶（alkaline phosphatase，AKP）、谷丙轉氨酶（alanine aminotransferase，ALT）、谷草轉氨酶（aspartate aminotransferase，AST）、尿素氮（urea nitrogen，BUN）、血清白蛋白（albumin，Alb）、總蛋白（total protein，TP）試劑盒 南京建成生物工程研究所；動物飼料 湖南斯萊克景達實驗動物有限公司。

1.2 儀器與設備

Varioskan flash多功能酶標儀、F1-Clop Tip移液槍、PowerGen125高速勻漿機 美國Thermo公司；96 孔深孔酶標板 深圳金燦華實業有限公司；L-8900氨基酸分析儀 日本日立公司；Allegra X-22R臺式離心機美國貝克曼公司；M2104電子天平 梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司。

1.3 方法

1.3.1 動物分組及處理

將5 0 只小鼠于溫度（2 5±2）℃、相對濕度40%～60%以及12 h明、12 h暗的條件下適應性飼養3 d后，隨機分為：正常組（CK）、L-茶氨酸組（300 mg/（kg·d），LT）、L-茶氨酸+EGCG組（60 mg/（kg·d）L-茶氨酸、240 mg/（kg·d）EGCG，LET）、EGCG組（300 mg/（kg·d），ET）、速溶綠茶組（300 mg/（kg·d），GT）。將各組相應劑量的L-茶氨酸、EGCG、速溶綠茶等分別溶解于10 mL蒸餾水中，每只小鼠灌喂0.3 mL，正常組灌喂等體積蒸餾水（0.3 mL）；每日定時灌喂，連續灌喂28 d。第29天禁食不禁水，12 h后進行麻醉取樣。摘眼球取血，血液室溫靜置30 min，3 000 r/min離心10 min，取上層血清，-80 ℃冰箱凍存。取出小腸，用生理鹽水沖洗，分別用錫箔紙包裹十二指腸、空腸、回腸，液氮速凍，-80 ℃冰箱凍存。

1.3.2 小鼠采食量和體質量測定

各組小鼠每日添加（200±2）g日糧，定時稱量當日剩余日糧，每只小鼠隔日稱體質量，并在灌喂的第28天和禁食12 h后稱體質量。

1.3.3 小鼠血清生化指標檢測

按照試劑盒操作說明對血清AKP、ALT、AST活力、BUN濃度、Alb、TP質量濃度進行測定。

1.3.4 血清及腸道游離氨基酸水平檢測

血清及腸道游離氨基酸水平的測定參考文獻[5]的方法進行操作。

采用氨基酸分析儀檢測必需氨基酸和非必需氨基酸，其中必需氨基酸包括：蘇氨酸（Thr）、賴氨酸（Lys）、異亮氨酸（Ile）、亮氨酸（Leu）、纈氨酸（Val）、甲硫氨酸（Met）、苯丙氨酸（Phe）、色氨酸（Trp）、組氨酸（His）；非必需氨基酸包括：天冬氨酸（Asp）、絲氨酸（Ser）、谷氨酸（Glu）、肌氨酸（Sar）、甘氨酸（Gly）、丙氨酸（Ala）、瓜氨酸（Cit）、酪氨酸（Tyr）、鳥氨酸（Orn）、精氨酸（Arg）、脯氨酸（Pro）、半胱氨酸（Cys）、磷酸絲氨酸（P-Ser）、牛磺酸（Tau）、γ-氨基丁酸（GABA）。

1.4 數據統計與分析

結果以平均值±標準差表示，采用SPSS 22.0軟件對數據進行方差分析，顯著性差異采用最小顯著性差異法檢驗，設定差異顯著性水平為P＜0.05。

2 結果與分析

2.1 EGCG對L-茶氨酸調節小鼠采食量和體質量的影響

由表1可知，與CK組和LT組相比，ET組和GT組小鼠第28天的體質量、平均增體質量、平均日采食量顯著降低（P＜0.05），LET組平均日采食量顯著降低（P＜0.05）。研究表明綠茶可以通過減少食量、減少脂質吸收、促進代謝、抑制脂肪合成和增加能耗來減輕體質量[3]，EGCG通過影響脂質代謝達到減脂減肥的效果[11]。LET組小鼠體質量沒有顯著性差異（P＞0.05），可能是L-茶氨酸影響了EGCG的作用效果。

表1 EGCG對L-茶氨酸調節小鼠采食量和體質量的影響Table 1 Influence of EGCG on the regulation effect of L-theanine on food intake and body mass gain

2.2 EGCG對L-茶氨酸調節小鼠血清生化指標的影響

由表2可知，與CK組相比，ET組BUN濃度顯著降低（P＜0.05），其主要原因是EGCG具有降低血清尿酸、BUN的作用[12]。GT組、LET組BUN濃度顯著高于LT組（P＜0.05），提示LT組氨基酸、蛋白質平衡狀態優于GT組、LET組，可能與LT組改變了機體氨基酸、蛋白質代謝有關。AKP、ALT、AST活力及血清TP、Alb質量濃度則無顯著性差異（P＞0.05）。

表2 EGCG對L-茶氨酸調節小鼠血清生化指標的影響Table 2 Influence of EGCG on the regulation effect of L-theanine on serum biochemical parameters in mice

2.3 EGCG對L-茶氨酸調節小鼠血清游離氨基酸質量濃度的影響

表3 EGCG對L-茶氨酸調節小鼠血清游離氨基酸質量濃度的影響Table 3 Influence of EGCG on the regulation effect of L-theanine on free amino acids concentration in the serum of mice

由表3可知，與CK組相比，GT組必需氨基酸質量濃度無顯著性差異（P＞0.05），Sar、Ala、Cit、Tyr、Arg、P-Ser質量濃度顯著升高（P＜0.05）；ET組的必需氨基酸質量濃度無顯著性差異（P＞0.05），Glu、Ala、Cit、Arg質量濃度顯著升高（P＜0.05）；LT組的Thr、Lys、Ile、Leu、Val、Phe、Asp、Glu、Arg、P-Ser、Tau質量濃度顯著降低，而非必需氨基酸Sar質量濃度顯著升高（P＜0.05）；LET組必需氨基酸Ile、Leu、Val質量濃度顯著降低，非必需氨基酸Sar、Cit質量濃度顯著升高、Tau質量濃度顯著降低（P＜0.05）。與GT組相比，ET組Glu質量濃度顯著升高（P＜0.05），Sar、Tyr、P-Ser質量濃度顯著降低（P＜0.05）；LT組Thr、Lys、Ile、Leu、Val、Phe、His質量濃度及Asp、Ser、Glu、Gly、Ala、Cit、Tyr、Arg、P-Ser、Tau質量濃度顯著降低（P＜0.05）；LET組Val及Ala、Tyr、Arg、P-Ser、Tau質量濃度顯著降低（P＜0.05），Sar質量濃度顯著升高（P＜0.05）。Arg是功能性氨基酸[13]，與機體免疫密切相關，GT組、ET組顯著增加了血清Arg質量濃度（P＜0.05），可能與綠茶、EGCG提升機體免疫的功能有關。說明速溶綠茶、EGCG可以增加血清部分非必需氨基酸質量濃度，L-茶氨酸與EGCG協同則降低了血清部分氨基酸質量濃度，與L-茶氨酸干預表現出相似的結果。

2.4 EGCG對L-茶氨酸調節小鼠不同腸道組織游離氨基酸含量的影響

2.4.1 EGCG對L-茶氨酸調節小鼠十二指腸游離氨基酸含量的影響

由表4可知，與CK組相比，GT組Thr、Lys、Ile、Leu、Val、Met、Phe、Trp、His含量及Asp、Ser、Glu、Sar、Gly、Ala、Cit、Tyr、Orn、Arg、Pro、GABA含量顯著升高，Tau含量顯著降低（P＜0.05）；ET組的Thr、Lys、Ile、Leu、Val、Met、Phe、Trp、His含量及Asp、Ser、Glu、Sar、Cys、Gly、Ala、Cit、Tyr、Orn、Arg、Pro、P-Ser、GABA含量顯著升高（P＜0.05）；LT組的Thr、Lys、Ile、Leu、Val、Met、Phe、Trp、His含量及Asp、Ser、Glu、Gly、Ala、Tyr、Orn、Arg、Pro、Cys、P-Ser、Tau、GABA含量顯著升高（P＜0.05）；LET組必需氨基酸Thr、Lys、Ile、Leu、Val、Met、Phe、Trp、His含量和非必需氨基酸Asp、Ser、Glu、Sar、Cys、Gly、Ala、Tyr、Orn、Arg、Pro、P-Ser、GABA含量顯著升高（P＜0.05）。與GT組相比，ET組Thr、Lys、Ile、Leu、Met、Phe、Trp含量及Sar、Ala、Tyr、Orn、Arg、GABA含量顯著降低（P＜0.05），Cys、P-Ser、Tau含量顯著升高（P＜0.05）；LT組Thr、Lys、Ile、Leu、Val、Met、Phe、Trp、His含量及Ser、Sar、Ala、Cit、Tyr、Orn、Arg、GABA含量顯著降低（P＜0.05），Cys、Pro、P-Ser、Tau含量顯著升高（P＜0.05）；LET組Thr、Lys、Ile、Leu、Met、Phe、Trp、His含量及Ala、Cit、Tyr、Orn、Arg、GABA含量顯著降低（P＜0.05），Sar、Cys、P-Ser、Tau含量顯著升高（P＜0.05）。說明速溶綠茶、EGCG、L-茶氨酸都能顯著增加小鼠十二指腸游離氨基酸含量（P＜0.05），且以速溶綠茶作用效果最好，LET組大部分氨基酸含量與ET組相近，作用效果高于LT組，低于GT組。

表4 EGCG對L-茶氨酸調節小鼠十二指腸游離氨基酸含量的影響Table 4 Influence of EGCG on the regulation effect of L-theanine on free amino acids contents in the duodenum of mice

2.4.2 EGCG對L-茶氨酸調節小鼠空腸游離氨基酸含量的影響

由表5可知，與CK組相比，GT組Thr、Lys、Ile、Leu、Val、Met、Phe、Trp、His含量及Asp、Ser、Glu、Gly、Ala、Tyr、Orn、Arg、Pro、P-Ser含量顯著升高，Sar、Cys、Cit含量顯著降低（P＜0.05）；ET組的Leu、Met含量及Asp、Ser、Cys、Ala、Cit、Tyr、Orn、Pro、Tau、GABA含量顯著降低，Sar含量顯著升高（P＜0.05）；LT組的Thr、Lys、Ile、Leu、Val、Met、Phe、Trp、His及Asp、Ser、Glu、Sar、Gly、Ala、Tyr、Orn、Arg、Pro、Cys、Tau、GABA含量顯著升高，Cit含量顯著降低（P＜0.05）；LET組Thr、Lys、Ile、Leu、Val、Met、Phe、Trp、His含量及Asp、Ser、Glu、Sar、Gly、Ala、Tyr、Orn、Arg、Pro含量顯著升高（P＜0.05）。與GT組相比，ET組Thr、Lys、Ile、Leu、Val、Met、Phe、Trp、His含量及Asp、Ser、Glu、Cys、Gly、Ala、Cit、Tyr、Orn、Arg、Pro、P-Ser、Tau含量顯著降低，Sar含量顯著升高（P＜0.05）；LT組Thr、Lys、Ile、Leu、Val、Met、Phe、Trp、His含量及Ser、Gly、Ala、Cit、Tyr、Orn、Arg、Pro、P-Ser含量顯著降低，Sar、Cys、Tau、GABA含量顯著升高（P＜0.05）；LET組Lys、His含量及Orn、Pro含量顯著降低，Sar、Cys、Cit、P-Ser含量顯著升高（P＜0.05）。說明速溶綠茶、L-茶氨酸、L-茶氨酸+EGCG都能顯著增加小鼠空腸游離氨基酸含量（P＜0.05），LET組大部分游離氨基酸的含量高于LT組、ET組。

表5 EGCG對L-茶氨酸調節小鼠空腸游離氨基酸含量的影響Table 5 Influence of EGCG on the regulation effect of L-theanine on free amino acids contents in the jejunum of mice

2.4.3 EGCG對L-茶氨酸調節小鼠回腸游離氨基酸含量的影響

由表6可知，與CK組相比，GT組Thr、Lys、Ile、Leu、Val、Met、Phe、Trp、His及Asp、Ser、Glu、Sar、Ala、Tyr、Arg、Pro、GABA含量顯著降低，Tau含量顯著升高（P＜0.05）；ET組的Thr、Lys、Ile、Leu、Val、Met、Phe、Trp、His及Asp、Ser、Glu、Sar、Cys、Gly、Ala、Tyr、Orn、Arg、Pro含量顯著降低（P＜0.05），Cit含量顯著升高（P＜0.05）；LT組的Thr、Lys、Ile、Leu、Val、Met、Phe、Trp、His及Asp、Ser、Glu、Sar、Gly、Ala、Tyr、Orn、Arg、Pro、Cys含量顯著降低（P＜0.05），Cit、P-Ser顯著升高（P＜0.05）；LET組Thr、Lys、Ile、Leu、Val、Met、Phe、Trp、His及Asp、Ser、Glu、Sar、Gly、Ala、Cit、Tyr、Arg、Pro含量顯著降低（P＜0.05），Orn、P-Ser、Tau含量顯著升高（P＜0.05）。與GT組相比，ET組Thr、Lys、Ile、Leu、Val、Met、Phe、Trp、His含量及Asp、Ser、Glu、Cys、Gly、Ala、Tyr、Orn、Arg、Pro含量顯著降低（P＜0.05），Sar、Cit、GABA含量顯著升高（P＜0.05）；LT組Leu、Met、Phe、Trp及Sar、Cit、Tyr、Arg、P-Ser、GABA含量顯著升高，Gly、Cys、Pro含量顯著降低（P＜0.05）；LET組Leu、Met、Phe、Trp、His及Sar、Ala、Tyr、Orn、Arg、Pro、P-Ser、Tau、GABA含量顯著升高（P＜0.05），Cit含量顯著降低（P＜0.05）。各處理降低了回腸游離氨基酸含量，可能是各組促進了小腸前端對氨基酸的吸收，導致后端吸收減少。LET組大部分游離氨基酸含量高于GT組、ET組、LT組。

表6 EGCG對L-茶氨酸調節小鼠回腸游離氨基酸含量的影響Table 6 Influence of EGCG on the regulation effect of L-theanine on free amino acids contents in the ileum of mice

3 討 論

腸道菌群的組成及變化能影響機體對蛋白質的利用[14]，同時膳食營養成分可以影響腸道菌群的組成和代謝[15]。研究表明，綠茶可以促進雙歧桿菌與乳酸桿菌等有益菌的生長，抑制金黃色葡萄球菌等腸道有害菌的生長[16-17]；EGCG可以促進雙歧桿菌、乳酸菌的增殖，并抑制擬桿菌、梭狀菌的生長[7]；茶氨酸可以促進乳酸菌和真細菌梭菌屬的生長，促進短鏈脂肪酸和乳酸的產生[18]。本實驗中，各組間不同腸道組織與正常組游離氨基酸含量的差異，可能是各處理組的不同茶葉成分不同程度地改變了小腸各部位中微生物的組成及代謝；各組內不同腸道組織游離氨基酸含量變化趨勢不盡相同，可能是在不同部位中微生物對氨基酸的代謝影響存在差異[19]。腸道氨基酸不僅為腸道提供能量，也是腸道合成蛋白質的物質基礎[20]，機體9%～12%的蛋白質在小腸內合成[21]，同時小腸也是機體抵御外來抗原的重要免疫器官。據報道，綠茶水提物可以緩解大腸桿菌攻毒小鼠的腸道損傷，使十二指腸、空腸絨毛高度顯著高于攻毒組絨毛高度[22]；EGCG可以改善腸道黏膜損傷，抑制炎癥因子產生，抑制內質網應激預防小鼠腸纖維化[6]；茶氨酸具有提高腸道非特異性免疫功能、抑制小腸炎癥[23]等作用。研究結果表明，GT組、LT組、LET組增加了十二指腸、空腸游離氨基酸含量，ET組增加了十二指腸游離氨基酸含量，三者干預后都豐富了腸道物質基礎，可能與三者對腸道的有益作用有一定關聯。L-茶氨酸與EGCG具有協同提升細胞抗氧化的能力[24]，L-茶氨酸與兒茶素、咖啡堿具有協同減肥減脂的功能[25]。本實驗中L-茶氨酸+EGCG組對腸道大部分游離氨基酸含量的影響優于L-茶氨酸、EGCG組，且對腸道維持健康、發揮重要功能的氨基酸Arg、Gly、Glu、Orn的影響在回腸中具有更好的效果，以及作為嘌呤、嘧啶合成原料的一碳氨基酸Trp、Gly、Met、His、Ser的影響，在空腸、回腸中均具有更好的效果，說明L-茶氨酸與EGCG具有協同提高腸道游離氨基酸含量的作用。此外，速溶綠茶在腸道游離氨基酸的影響上，在十二指腸部位優于LET組，在回腸部位則相反，在十二指腸、空腸部分優于L-茶氨酸處理，在十二指腸、空腸、回腸部位比EGCG單獨處理效果更好，其主要原因是速溶綠茶中含有多種內含成分。

血清游離氨基酸可以反映機體氨基酸代謝狀況和氨基酸之間的平衡狀態。機體從食物中攝取的氨基酸，經小腸黏膜、腸道微生物代謝后，到達門靜脈循環的量及氨基酸組成比例將會發生改變[26]。研究表明，綠茶可以通過減少食物、脂質、糖類[9]的攝入、抑制脂質和脂肪在體內生成、增加能耗等作用達到減肥效果[3]，也可以提高胰島素活力達到降血糖的效果[27]，同時氨基酸通過糖異生作用提供碳水化合物的替代底物，使得攝入的蛋白質有更強的飽腹作用[28]。GT組增加了血清部分非必需氨基酸的質量濃度，推測是在攝食量減少、耗能增加、脂質、糖類攝入降低的情況下，小鼠可能通過調節氨基酸、蛋白質代謝來滿足機體正常代謝需求，且速溶綠茶中含有質量分數4.56%的游離氨基酸，推測對腸道蛋白酶、菌群[2]產生了影響，促進了蛋白質的消化吸收，影響機體攝入氨基酸的比例和含量，使得血清部分游離氨基酸質量濃度升高。ET組血清部分非必需氨基酸質量濃度升高、血清BUN濃度降低，提示蛋白質代謝的增強。本研究中，EGCG可顯著提高血清中興奮性氨基酸Glu的質量濃度（P＜0.05），與Ding Jie等[8]的研究結果一致。LT組血清BUN濃度降低，說明機體氮代謝增強、氨基酸利用效率提高、蛋白質合成增加。據報道，腸道黏膜質量影響腸道氨基酸代謝[22]，L-茶氨酸可以維護腸道形態及功能[29]，增加腸道絨毛高度及絨毛高度與隱窩深度的比值，L-茶氨酸可能通過改善腸道黏膜質量增強腸道氨基酸的分解代謝、吸收代謝及提升機體氨基酸利用效率，從而使血清游離氨基酸減少[5]。LET組對血清游離氨基酸的影響表現出降低部分必需、非必需氨基酸質量濃度，與LT組效果相似，與GT組、ET組表現不同。L-茶氨酸單獨使用時對氧化損傷的細胞保護或修復效果不明顯，與EGCG協同卻能顯著促進EGCG對細胞的保護或修復作用[24]；L-茶氨酸與蒽環類抗癌藥物共同作用時，能提高藥物在細胞中的濃度從而提高藥物抗癌效果[30]。綠茶具有多種活性成分，一些活性成分也有一定的協同增效作用。據報道，綠茶多糖和EGCG協同可以通過清除自由基、保護DNA和線粒體功能、上調ATP水平來保護胰島細胞[31]；提取的茶多糖和茶多酚按照綠茶中的配比可以降低糖尿病大鼠的血糖，降低腎臟氧化損傷而保護腎臟[32]；L-茶氨酸與咖啡堿共同作用可以消除咖啡堿引起的血管收縮作用和行為效應[33]，并可以提高受試者的認知表現[34]。本實驗中GT、LET組和LT組對血清氨基酸有不同的影響，提示速溶綠茶對機體氨基酸代謝產生的影響是其內含成分的綜合結果。

綜上研究發現，速溶綠茶具有提高小腸游離氨基酸含量的作用，同時參照速溶綠茶中EGCG與L-茶氨酸的質量比（4∶1）配制而成的混合物比L-茶氨酸、EGCG單獨干預更有利于提高腸道組織中游離氨基酸含量、促進腸道對氨基酸的吸收利用，說明EGCG對L-茶氨酸調節小鼠血清及腸道游離氨基酸含量具有協同作用，但其最優配比、最優劑量以及協同調節機制有待進一步探究。