任務導向性康復訓練對小鼠脊髓損傷后神經回路可塑性及前肢運動功能的影響

潘璐 ，譚波濤，羅美玲，劉媛，伍亞民，虞樂華，殷櫻

1.重慶醫科大學附屬第二醫院康復醫學科，重慶市 400010；2.陸軍軍醫大學特色醫學中心（大坪醫院）特殊環境戰傷防治研究室，創傷、燒傷與復合傷國家重點實驗室，重慶市400042

脊髓損傷是一種嚴重致殘的中樞神經系統損傷性疾病，在全球范圍內發病率不斷上升[1]。急性期后，患者會遺留損傷節段以下永久性運動和感覺功能障礙，給患者及家屬帶來嚴重的心理和經濟負擔。雖然目前臨床上不能通過有效的治療手段使脊髓損傷患者功能完全恢復，但康復訓練似乎是改善其功能障礙的不錯選擇，且需終身參與。一方面，運動訓練可以在早期減輕炎癥、控制水腫、抑制部分細胞凋亡，從而保護神經組織[2-4]；另一方面運動訓練可以促進分泌神經營養因子，提高再生相關基因表達，并促進軸突再生，提高神經可塑性[5-8]。

目前國內對康復訓練的基礎研究多集中在下肢，如跑臺訓練[4]、游泳訓練[9-10]、減重步行訓練[11-12]等，對上肢訓練的研究相對較少。任務導向性康復訓練是一種針對上肢的訓練方式，與臨床上強制性訓練療法類似[13]。它是一種利用動物的求食本能和訓練盒特殊的空間結構，強制其使用患側肢體獲取食物的訓練方式[14-15]。本研究探討任務導向性康復訓練對脊髓損傷后小鼠病灶局部神經回路可塑性的影響及前肢運動功能的變化。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

SPF 級雌性C75/BL 小鼠，6～8 周齡，體質量25～30 g，由陸軍軍醫大學特色醫學中心實驗動物中心提供，許可證號SCXK(渝)2012-0005。動物房12 h/12 h晝夜節律光照，室溫20 ℃，濕度40%～60%，自由飲水，標準飲食。對小鼠進行篩選，納入成功進食70%以上的左利爪小鼠21只，采用隨機數字表法分為假手術組、模型組和訓練組，每組7只。

所有操作均依據《醫學實驗動物管理實施細則》要求，符合動物福利與倫理原則。

1.2 實驗儀器和試劑

腦立體定位儀：日本NARISHIGE 公司。Powelab/16SP 誘發電位儀：澳大利亞ADI 公司。CM1900冰凍切片機：德國LEICA 公司。A1+R 激光共聚焦顯微鏡：日本Nikon公司。

豚鼠抗神經元核特異蛋白(Neuron-specific nuclei protein,NeuN)抗體(1∶400；Cat#ABN78)、兔抗Synapsin I抗體(1∶500，Cat#AB1543)：美國MILLIPORE公司。兔抗蛋白激酶C-γ抗體(protein kinase C-γ,PKCγ；1∶200，Cat#59090s)：美國CELL SIGNALING TECHNOLOGY 公司。DAPI(0.5 μg/ml，Cat#D9542)：美國SIGMA 公司。生物素化葡聚糖胺(biotinylated dextran amine,BDA)-10000 (Cat#D1956)、Alexa-594 Streptavidin (1∶200，Cat#s32356)：美國THERMO 公司。驢血清以及Alex Fluor-488、Alex Fluor-594 偶聯驢抗兔、驢抗豚鼠IgG：美國JACKSON實驗室。

1.3 實驗方法

1.3.1 造模

腹腔注射1%戊巴比妥鈉50 mg/kg 麻醉，備皮消毒后俯臥位固定于手術臺上。切開頸部皮膚，鈍性剝離肌肉和筋膜，暴露椎板。定位C5棘突，用咬骨鉗切除椎板，避免傷及軟脊膜。使用26號針分別在模型組和訓練組脊髓后角灰質部分刺破軟脊膜，再采用改良FSTDUMONT 5 號手術鉗分別刺入兩側背角灰質(約1 mm)。對C5背側皮質脊髓束進行鉗夾損傷，維持鉗夾動作約15 s，重復1 次。再次將改良FSTDUMONT5鉗的一側尖端刺入左側脊髓背側(約0.8 mm)，另一側尖端留于脊髓外面，鉗夾紅核脊髓束和皮質脊髓側束，維持15 s，重復1 次[16-18]。假手術組僅剔除椎板，不予鉗夾。術后縫合頸部肌肉及皮膚。

對胸段脊髓進行PKC-γ染色，鑒定C5鉗夾模型。

1.3.2 任務導向康復訓練

術后4 周，訓練組接受任務導向康復訓練。有機玻璃訓練盒(35×25×30 cm)的頭部最右側縱向開一狹窄的縫隙(寬約0.8 cm)，小鼠僅能正向通過此縫隙伸出左前肢抓取食物小丸，側身時由于頭部與右側玻璃板的距離則無法從縫隙伸出右前肢(圖1)。盒子外面粘有一塊寬約5 cm 的玻璃板，離地2 cm，食物小丸將放置在距離盒子縫隙1 cm 的位置。訓練前動物空腹約12 h，小鼠成功使用左前肢抓取食物并送入口中為成功。每次訓練最多給予20 粒小丸，最長訓練時間30 min，每周5次，共4周。假手術組不給予訓練，模型組同樣接受空腹處理并放入訓練盒中，但食物小丸全放置于盒內，隨意食用。

圖1 任務導向康復訓練示意圖

1.3.3 行為學檢測

分別于術前，術后3 d、2 周、4 周、6 周和8 周進行檢測。在實驗正式開始前，將動物放入水平樓梯和圓筒里適應并訓練5 d，每天3次，再進行術前檢測。

1.3.3.1 水平樓梯實驗

水平橫梯跑道(80×50 cm)由兩塊有機玻璃板構成，橫梯間距1.3 cm。動物飼養籠放置于跑道末端促使動物通過橫梯跑道回籠，攝像機記錄小鼠跑過31個橫梯的情況。每次實驗前隨機抽掉5 根橫梯制成無規律間隔跑道(最大間隔2 個橫梯)。實驗結束后，召集大學生志愿者逐幀分析左前肢踩空和滑落橫梯的情況，計算錯誤步數占總步數的比率[18,20]。

1.3.3.2 圓筒攀爬探索實驗

將小鼠放于一透明的有機玻璃圓筒(直徑15 cm、高20 cm)內，攝像機記錄直立狀態下使用左側前肢攀爬圓筒壁的偏好程度。每次攀爬小鼠可能選擇左、右、雙側攀爬，計算使用左側前肢的比率。每次以動物直立狀態下前肢接觸筒壁，然后雙前肢放回地面記為一組。召集大學生志愿者分析前10 次圓筒攀爬情況，最長觀察15 min[18,21]。

1.3.4 皮質脊髓束的順行示蹤

術后6 周，所有小鼠腹腔注射1%戊巴比妥鈉50 mg/kg 麻醉，備皮消毒后俯臥位固定于腦立體定位儀上。切開頭部皮膚，雙氧水清除多余筋膜，暴露顱骨骨縫。顱骨鉆在右側運動皮質區鉆孔，采用漢密爾頓微量進液器裝載10%BDA 以0.1 μl/min 緩慢注射到大腦右側運動皮質區(前囟右側1.0 mm，前后1.0 mm、0.5 mm、0、-0.5 mm、-1.0 mm，深度0.5 mm)[19]。每點0.5 μl，共5 點，每個點注射結束后滯針3 min，緩慢拔針。術后縫合頭部皮膚。

1.3.5 前肢運動誘發電位檢測

術后8周，小鼠腹腔注射1%戊巴比妥鈉50 mg/kg麻醉，剃去頭頂及左前肢周圍皮毛。皮膚消毒后，于前臂內側切開，止血鉗鈍性分離并暴露較粗大的正中神經。細線穿過正中神經，蘸取少許生理鹽水避免局部干燥。將小鼠固定在立體定位儀上，沿正中線切開頭部皮膚，鈍性分離筋膜，小心暴露之前所鉆的孔。刺激電極經顱骨鉆開處輕觸硬腦膜，記錄電極用鉤狀電極鉤住正中神經，參考電極夾在頭皮切口附近，地線夾1 寸毫針刺入鼠尾根部。應用Powelab/16SP 誘發電位儀，刺激頻率4 Hz，波寬0.2 ms，強度5.0 mA，以鼠爪輕微抽動為宜。每次檢測至少重復刺激3 次從而得到穩定波形，并記錄各波峰潛伏期。

1.3.6 組織標本的制備

完成運動誘發電位檢測，補充過量麻藥后行心臟灌注。取出鼠腦，延髓，以C5為中心、長1 mm 的頸段脊髓，以T10為中心、長1 mm 的胸段脊髓。4%多聚甲醛磷酸鹽緩沖液固定過夜，梯度蔗糖脫水后，包埋組織。鼠腦、延髓、脊髓均采用冠狀位切片，厚18 μm。

1.3.7 免疫熒光組織化學染色

室溫下復溫冰凍切片2 h 后，0.01 mol/L PBS 洗滌5 min，共3次；0.3%TritonX-100 PBS 0.01 mol/L室溫孵育30 min；0.01 mol/L PBS 洗滌5 min，共3 次；晾干后，5%驢血清封閉30 min；加入相應一抗，室溫過夜；0.01 mol/L PBS 洗滌5 min，共3 次；晾干后，加入相應二抗，37 ℃下孵育45 min；0.01 mol/L PBS洗滌5 min，共3 次；加DAPI 0.5 μg/ml，2 min 后0.01 mol/L PBS 洗滌5 min，共3 次；晾干后，50%甘油封片。

1.4 圖片分析

激光共聚焦采圖時，各組切片曝光度和像素保持一致，并取相同部位進行量化分析。

采用NIH Image J軟件計算。

軸突出芽量：計算左側灰質前角內BDA 總熒光強度(arbitrary units,a.u.)[22]。

軸突出芽與神經元共區域：計算左側灰質前角單位面積內NeuN 標記的綠色神經元被BDA 標記的紅色軸突連接的細胞個數。

突觸素的表達量：計算左側灰質前角單位面積內Synapsin I平均熒光強度。

1.5 統計學分析

采用SPSS 20.0 統計軟件進行數據分析。計量資料以()表示，多組均數比較采用單因素方差分析(one-way ANOVA)，并進行Bonferroni 多重比較。顯著性水平α=0.05。

2 結果

2.1 模型鑒定

假手術組胸段脊髓背側皮質脊髓束(dorsal corticospinal tract,dCST)區域呈PKC-γ 染色陽性，C5鉗夾造模成功的dCST 區域呈PKC-γ 染色陰性。如果在胸段dCST 區域出現任何一點PKC-γ 染色陽性情況，則說明在C5處未完全夾斷dCST，應剔除該小鼠數據。

2.2 BDA順行示蹤皮質脊髓束

BDA示蹤劑被成功注射進入小鼠右側大腦運動皮質，標記皮質脊髓神經元胞體(圖2A)。皮質脊髓神經元胞體發出的軸突——皮質脊髓束經延髓交叉向下傳導被BDA順行示蹤(圖2B)。

2.3 誘發電位檢測

術后8 周，三組前肢運動誘發電位潛伏期具有非常高度顯著性差異(P< 0.001)。與假手術組比較，模型組P1、N1 潛伏期延長(P< 0.05)；與模型組比較，訓練組P1、N1潛伏期縮短(P<0.05)。見表1、圖3。

表1 各組前肢運動誘發電位潛伏期(ms)

2.4 水平樓梯實驗

術前，各組左前肢錯誤率都很低，約為2%。術后，模型組和訓練組左前肢錯誤率明顯升高，且各時間點均高于假手術組(P<0.05)。術后6周和術后8周，訓練組左前肢錯誤率低于模型組(P<0.05)。見表2。

2.5 圓筒攀爬探索實驗

術前，三組左前肢使用率基本相當，約為10%。術后3 d，模型組和訓練組左前肢使用率下降，均低于假手術組(P<0.05)；術后2～6 周雖逐漸恢復但均未達傷前水平。術后8 周，訓練組左前肢使用率高于模型組(P< 0.05)，甚至與假手術組無顯著性差異(P>0.05)。見表3。

圖2 BDA順行示蹤皮質脊髓束(免疫熒光染色，bar=100 μm)

表2 各組不同時間點水平樓梯實驗左前肢錯誤率比較(%)

表3 各組不同時間點圓筒攀爬探索實驗左前肢使用率比較(%)

圖3 各組前肢運動誘發電位

表4 各組在病灶上段軸突出芽情況

表5 各組病灶節段Synapsin I表達比較

2.6 軸突出芽與神經元結構

在C5上方500 μm 范圍內，三組左側灰質前角中BDA 標記的軸突數量有顯著性差異(P<0.001)。訓練組軸突多于假手術組和模型組(P<0.05)。與假手術組和模型組比較，訓練組出芽軸突多與神經元共區域(P<0.05)。見圖4、表4。

2.7 Synapsin I表達

在C5病灶節段，三組左側灰質前角內Synapsin I表達有非常高度顯著性差異(P< 0.001)。與假手術組比較，模型組和訓練組的Synapsin I 表達減少(P<0.05)；與模型組比較，訓練組Synapsin I 表達增加(P<0.05)。見圖5、表5。

3 討論

任務導向性康復訓練是脊髓損傷患者常用的康復治療手段，如作業治療中訓練患者插木釘等，旨在以某項特殊任務提高患者上肢的精細運動能力。本研究將單個小球抓取(single pellet grasping,SPG)作為一項訓練小鼠前肢熟練運動的任務。SPG 早期被用于大腦半球損傷性疾病(如腦卒中[23-24]、帕金森病[25]等)后的康復治療，后來對這項任務進行動作分析，發現SPG 包含伸肘、抓握等一系列前肢的精細運動[26]。現在SPG任務被廣泛應用于嚙齒類動物前肢精細運動的研究和神經障礙后的康復訓練手段[15,27]。有文獻報道[14]，超早期的康復訓練不利于脊髓損傷后的運動功能恢復；加之軸突出芽需要時間，且本研究康復訓練目的是引導出芽軸突的功能適應性重塑，故在傷后4 周開始對訓練組進行訓練。

Maier 等[28]發現，脊髓損傷大鼠在接受任務導向性康復訓練3 周后，健側皮質脊髓束出芽增強，并且與肢體功能恢復成正相關。Wahl等[14]發現，SPG 能改善健側皮質脊髓束出芽軸突的功能適應性重塑。本實驗對脊髓損傷后患側皮質脊髓束進行觀察，發現患側皮質脊髓束上段同樣也存在類似再生性出芽的現象。假手術組皮質脊髓束在灰質里的出芽量不多；而損傷后，病灶上段會發出部分新分支，這可能是脊髓損傷后的一種代償現象。本研究還發現，SPG 或許能促進上段皮質脊髓束主干出芽增多并引導其投射進入灰質前角區域。由于脊髓內的灰質前角包含許多支配前肢運動控制的神經元，所以這些出芽的軸突很有可能會參與脊髓損傷后患側上肢運動功能的適應性重塑[29]。

圖4 各組病灶上段軸突出芽情況(免疫熒光染色，bar=20 μm)

圖5 各組病灶節段Synapsin I表達(免疫熒光染色，bar=20 μm)

突觸重塑是神經功能重塑的一個重要組成部分[30]。步行訓練曾被證實能提高腰段運動神經元突觸素的表達，恢復脊髓損傷后抑制性與興奮性突觸之間的平衡，從而有助于步行功能的恢復[31-33]。本研究發現，SPG 可以提高Synapsin I 在灰質前角中的表達，這提示任務導向性康復訓練同樣能促進頸段脊髓內的突觸重塑。

水平樓梯和圓筒攀爬探索實驗是國外常用的一類評估小鼠前肢運動的方法，分別檢測前肢精細運動和粗大運動[17-18,20-21]。本研究發現，訓練2 周后(傷后6周)，水平樓梯的錯誤率開始下降，且持續到訓練結束后(傷后8 周)；而圓筒內患側前肢的使用率要訓練結束后(傷后8 周)才上升。這可能是由于SPG 主要訓練小鼠前肢的精細運動(如前爪抓握能力)，而對圓筒測試中的粗大運動改善并不明顯。運動誘發電位檢測發現，康復訓練能較好地縮短P1、N1 的潛伏期，說明神經傳導功能有所改善。

綜上所述，任務導向性康復訓練能促進脊髓損傷病灶上段的軸突出芽以及病灶附近突觸重塑，這種局部神經回路可塑性變化有助于促進頸段脊髓損傷后的前肢運動功能恢復。