穴位埋線對局灶性腦缺血再灌注損傷大鼠運(yùn)動功能的影響

黃琴，周立志，譚彩玲，鄭蘇，彭力

1.湖北醫(yī)藥學(xué)院附屬醫(yī)院（十堰市太和醫(yī)院）中醫(yī)康復(fù)綜合部，湖北十堰市 442000；2.十堰市中醫(yī)醫(yī)院，湖北十堰市442000

腦卒中在世界范圍內(nèi)60歲及以上人群中居死因第2 位，15～59 歲人群中居死因第5 位[1]，其高發(fā)病率、高死亡率和高致殘率給家庭和社會帶來沉重的負(fù)擔(dān)。腦卒中的治療關(guān)鍵在于通過溶栓等手段恢復(fù)缺血區(qū)域的血流，但實(shí)際上只有11%腦卒中患者接受組織型纖溶酶原激活劑溶栓；而在這些患者中，仍有一半患者伴隨不同程度的運(yùn)動功能障礙[2]。日常生活活動能力訓(xùn)練、神經(jīng)促進(jìn)技術(shù)、運(yùn)動再學(xué)習(xí)等康復(fù)手段可促進(jìn)腦卒中后運(yùn)動功能的恢復(fù)，但大多數(shù)腦卒中后遺癥患者即使經(jīng)過康復(fù)治療，仍表現(xiàn)出持續(xù)性運(yùn)動功能障礙[3]。尋求對腦卒中后運(yùn)動障礙新的有效治療方法是臨床上亟待解決的重要難題。

穴位埋線是中醫(yī)針灸學(xué)的延伸和發(fā)展，它通過針具和藥線在特定穴位產(chǎn)生緩慢而持久的刺激，避免患者每日接受針刺的疼痛，逐漸被應(yīng)用于臨床。穴位埋線可調(diào)節(jié)神經(jīng)反射，促進(jìn)神經(jīng)功能恢復(fù)[4]；抑制炎性因子釋放，減少細(xì)胞凋亡[5]。本研究觀察穴位埋線對缺血再灌注損傷大鼠運(yùn)動功能障礙的治療作用，探討其可能的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物

健康SPF 級雄性Sprague-Dawley 大鼠48 只，3 月齡，體質(zhì)量250～280 g，由湖北醫(yī)藥學(xué)院實(shí)驗(yàn)動物中心提供，動物許可證號SCXK(鄂)2011-0008。飼養(yǎng)于(23±1) ℃、相對濕度50%、12 h 晝夜交替的SPF 實(shí)驗(yàn)環(huán)境中，自由飲用食物和水。實(shí)驗(yàn)過程中的所有操作均遵循湖北醫(yī)藥學(xué)院動物倫理委員會的相關(guān)要求。

1.2 模型制作和分組

采用隨機(jī)數(shù)字表法分為假手術(shù)組、模型組和穴位埋線組，每組16只。

采用Longa 法[6]制作大腦中動脈閉塞(middle cerebral artery occlusion,MCAO)模型。分離大鼠右側(cè)頸總動脈、頸外動脈和頸內(nèi)動脈，用血管電凝器離斷頸外動脈，從頸外動脈殘端置入線栓，經(jīng)頸內(nèi)動脈入顱后遇阻力即停止，置入線栓長度約19 mm，90 min 后拔出線栓恢復(fù)血液灌注。

假手術(shù)組僅離斷右側(cè)頸外動脈；模型組和穴位埋線組制作MCAO模型；穴位埋線組缺血再灌注90 min后，于百會穴、右側(cè)頂顳前斜線進(jìn)行埋線。手術(shù)過程中室溫保持27 ℃，大鼠保持肛溫為(37.0±0.5)℃，術(shù)后單籠飼養(yǎng)，5%利多卡因涂抹手術(shù)切口。

1.3 實(shí)驗(yàn)試劑

線栓：廣州佳靈生物技術(shù)有限公司。氯化三苯基四氮唑(2,3,5-triphenyltetrazolium chloride,TTC)、蛋白酶抑制劑：美國SIGMA公司。膠質(zhì)纖維酸性蛋白(glial fibrillary acidic protein,GFAP)抗體、突觸素I 抗體：美國ABCAM 公司。酶標(biāo)山羊抗小鼠(PV-6002)、酶標(biāo)山羊抗兔(PV-6001)：北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。PIPA裂解液、Protein Marker：碧云天生物技術(shù)有限公司。BCA 蛋白定量試劑盒：天根生化科技(北京)有限公司。甘油醛-3-磷酸脫氫酶(glyce raldehyde -3-phosphate dehydrogenase,GADPH)抗體：美國CST 公司。Trizol、RNA later：美國ABI AMBION 公司。SYBR?Premix Ex TaqTMⅡ試劑盒、PrimeScriptTMRT Master Mix試劑盒：日本TAKARA公司。

1.4 觀察指標(biāo)及檢測方法

1.4.1 神經(jīng)行為學(xué)評分

各組隨機(jī)選取8 只大鼠，分別在造模成功后1 d、3 d、7 d、14 d 四個時間點(diǎn)行神經(jīng)功能評分[7]。于安靜環(huán)境內(nèi)由對分組不知情的實(shí)驗(yàn)者對大鼠5 min 內(nèi)自主活動、四肢對稱性、前肢對稱性、攀籠功能、軀體感覺功能及觸須感覺進(jìn)行評估。滿分18 分，評分越低，神經(jīng)功能損傷越嚴(yán)重。

各組隨機(jī)選取6 只大鼠，于造模成功后1 d、3 d、7 d、14 d 四個時間點(diǎn)行改良網(wǎng)屏實(shí)驗(yàn)。網(wǎng)屏為50×40 cm 網(wǎng)帶，網(wǎng)眼1×1 cm，網(wǎng)屏下方鋪12 cm 厚的海綿。將網(wǎng)屏傾斜30°和60°，將大鼠右側(cè)肢體用醫(yī)用膠帶纏縛然后放在網(wǎng)屏上，觀察其在60 s 內(nèi)維持于網(wǎng)屏上或用前爪抓握網(wǎng)屏的時間。大鼠在網(wǎng)屏上維持的時間越短，表明前肢功能損傷越重。

1.4.2 腦梗死灶體積檢測

于第14 天神經(jīng)功能評分結(jié)束后，各組隨機(jī)選取4只大鼠，水合氯醛3.5 ml/kg腹腔注射快速麻醉后斷頭處死，取完整腦組織置于-20 ℃中保存60 min，去除嗅球和低位腦干后，沿冠狀面自額極向后連續(xù)、均勻切成7 片，每片厚2 mm。將腦片置入2% TTC 中，37 ℃避光孵育30 min 后顯色，4%多聚甲醛后固定6 h，掃描儀獲取圖像，Image Plus 6.0 軟件計算腦組織梗死面積。

校正腦梗死體積百分比=[總梗死體積-(缺血側(cè)腦組織體積-對側(cè)腦組織體積)]/對側(cè)腦組織×100%

1.4.3 HE染色及免疫組化染色

在實(shí)驗(yàn)第14 天，每組取4 只大鼠，同法處死，取缺血半暗帶腦組織石蠟包埋，切片，片厚3 μm，常規(guī)脫蠟、脫水，HE 染色，分別在10、20、40 倍物鏡下觀察各組腦組織的組織形態(tài)學(xué)變化。

石蠟切片常規(guī)脫蠟至水，乙二胺四乙酸(ethylene diamine tetraacetic acid,EDTA)抗原修復(fù)10 min；3%H2O2室溫孵育10 min；PBS 沖洗3 次，每次5 min，10%山羊血清室溫孵育30 min，分別滴加突觸素I(1∶200)、GFAP (1∶600)一抗工作液，37 ℃孵育1 h；PBS 沖洗3 次，每次5 min，滴加相應(yīng)標(biāo)記二抗工作液，37 ℃孵育10 min；PBS 沖洗3 次，每次5 min；DAB 顯色，蘇木素復(fù)染，PBS 返藍(lán)，梯度酒精脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片。顯微鏡(德國LEICA)觀察，Image Pro Plus 6.0 圖像分析軟件采集大鼠右側(cè)病灶區(qū)的免疫信號，計算校正光密度值(corrected optical density,COD)。每張切片選取缺血半暗帶區(qū)4 個不重疊區(qū)域觀察，取均值。

1.4.4 Western blotting

每組取4只大鼠，于再灌注14 d后冰上斷頭取腦，取缺血半暗帶區(qū)大腦皮質(zhì)(根據(jù)Ashwal等[8]方法確定)。提取總蛋白，加入預(yù)冷組織裂解液9 ml/g，組織勻漿后冰上裂解30 min，4 ℃離心20 min 后取上清液。BCA 法蛋白定量，100 ℃加熱15 min 變性，總蛋白上清液60 g經(jīng)10%十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳(sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel-electrophoresis,SDS-PAGE)分離，將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)膜至聚偏二氟乙烯(polyvinylidene fluoride,PVDF)膜上，5%脫脂奶粉封閉2 h，加GFAP 抗體(1∶5000)、突觸素I 抗體(1∶5000)、GADPH 多克隆抗體(1∶5000)4 ℃冰箱孵育過夜，洗膜緩沖液(tris buffered saline tween,TBST)洗膜3 次，加入相應(yīng)二抗(1∶5000)室溫孵育1 h，ECL 顯影。Image J分析目的條帶，以目的蛋白灰度值與內(nèi)參灰度值比值表示其相對表達(dá)量。

1.4.5 逆轉(zhuǎn)錄實(shí)時定量聚合酶鏈反應(yīng)(reverse transcription real-time quantitative polymerase chain reaction,RTqPCR)檢測

再灌注14 d 后，每組取4 只大鼠水合氯醛麻醉后冰上斷頭取腦，取缺血半暗帶區(qū)大腦皮質(zhì)。按Trizol一步法提取總RNA，反轉(zhuǎn)錄成為cDNA，設(shè)計GFAP和突觸素I特異性引物，以GAPDH為內(nèi)參對照，根據(jù)熒光閾值(cyclethreshold,Ct) 差異，計算目的基因2-△△Ct。

引物序列如下。GFAP 上游：5'-ATC TGG AGA GGA AGG TTG A-3'。GFAP 下游：5'-CGT ACT GAG TGC GAA TCT-3'。突觸素I 上游：5'-AGG CTC TGC TAT GCT TGA-3'。突觸素I 下游：5'-GCT GCT TGT CTT CAT CCT-3'。GAPDH 上游：5'-AGG TCG GTG TGA ACG GAT TTG-3'。GAPDH 下游：5'-TGT AGA CCA TGT AGT TGA GGT CA-3'。

1.5 統(tǒng)計學(xué)分析

采用SPSS 19.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析。計量資料符合正態(tài)分布，以()表示，多組間比較采用單因素方差分析，事后比較采用LSD-t檢驗(yàn)。顯著性水平α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 神經(jīng)功能評分

各時間點(diǎn)間，假手術(shù)組神經(jīng)功能評分無變化，模型組和穴位埋線組神經(jīng)功能評分逐漸增加(P< 0.05)。與假手術(shù)組比較，模型組各時間點(diǎn)神經(jīng)功能評分均顯著降低(P< 0.001)；與模型組比較，穴位埋線組各時間點(diǎn)神經(jīng)功能評分均顯著增加(P<0.001)。見表1。

2.2 網(wǎng)屏實(shí)驗(yàn)

各時間點(diǎn)間比較，假手術(shù)組網(wǎng)屏實(shí)驗(yàn)時間均無顯著性差異(P>0.05)。模型組在術(shù)后第1 天較假手術(shù)組網(wǎng)屏實(shí)驗(yàn)時間顯著縮短(P< 0.001)，之后逐漸增加(P<0.01)。穴位埋線組在術(shù)后第1 天較模型組網(wǎng)屏實(shí)驗(yàn)時間顯著增加(P<0.001)，之后逐漸增加(P<0.05)。見表2和表3。

表1 三組神經(jīng)功能評分比較

表2 三組網(wǎng)屏實(shí)驗(yàn)(30°)時間比較(s)

表3 三組網(wǎng)屏實(shí)驗(yàn)(60°)時間比較(s)

2.3 腦梗死體積

與模型組比較，穴位埋線組腦梗死體積顯著減小(P<0.001)，但未達(dá)到正常水平。見圖1、表4。

2.4 HE染色

假手術(shù)組神經(jīng)元結(jié)構(gòu)完整對稱，排列有序，符合正常細(xì)胞形態(tài)；模型組半暗帶區(qū)可見大量神經(jīng)細(xì)胞凋亡和壞死，細(xì)胞核皺縮破裂并被深染；穴位埋線組缺血半暗帶區(qū)域仍有病理變化，但較模型組神經(jīng)元死亡情況減輕。見圖2、圖3。

圖1 各組TTC染色

圖2 梗死中心區(qū)和缺血半暗帶區(qū)腦區(qū)定位

圖3 三組腦組織HE染色結(jié)果

2.5 免疫組化染色

模型組GFAP 陽性表達(dá)增加，突觸素I 表達(dá)降低(P<0.05)；穴位埋線組GFAP陽性表達(dá)降低，突觸素I表達(dá)增加(P<0.05)。見圖4、表5。

圖4 三組GFAP和突觸素I陽性細(xì)胞(免疫組化染色，×200)

2.6 Western blotting

與假手術(shù)組比較，模型組突觸素I 的蛋白水平降低，GFAP的蛋白水平增高(P<0.05)；與模型組比較，穴位埋線組突觸素I的蛋白水平升高，GFAP的蛋白水平下降(P<0.05)。見圖5、表6。

表4 三組腦梗死體積比較(%)

表5 三組GFAP與突觸素I免疫組化陽性細(xì)胞比較(COD)

表6 三組GFAP與突觸素I蛋白水平比較(/GADPH)

2.7 RT-qPCR

與假手術(shù)組比較，模型組突觸素I 的mRNA 表達(dá)水平降低，GFAP 的mRNA 表達(dá)水平下降(P< 0.05)；與模型組比較，穴位埋線組突觸素I 的mRNA 表達(dá)水平升高，GFAP 的mRNA 表達(dá)水平下降(P< 0.05)。見表7。

3 討論

目前，針對腦卒中后功能障礙，臨床主要通過物理治療、作業(yè)治療、言語治療等手段進(jìn)行系統(tǒng)性康復(fù)訓(xùn)練。除此之外，計算機(jī)[9-11]、人工智能[12-13]、干細(xì)胞[14-16]等新型醫(yī)療技術(shù)也逐漸應(yīng)用于腦卒中康復(fù)。以針刺、推拿為主的傳統(tǒng)康復(fù)治療方法，也在腦卒中康復(fù)中廣泛應(yīng)用。穴位埋線能在一定程度上改善腦卒中患者的運(yùn)動功能，提高生活質(zhì)量[17]。

圖5 三組GFAP和突觸素I的Western blotting

表7 三組GFAP與突觸素I的mRNA水平比較(/GADPH)

腦卒中后運(yùn)動功能障礙，中醫(yī)稱為“半身不遂”“歪僻不遂”等，認(rèn)為病位在腦，病機(jī)多因氣血逆亂、腦脈痹阻、經(jīng)脈失養(yǎng)所致。百會穴居巔頂，為百脈之會。于百會穴進(jìn)行埋線，能通達(dá)陰陽脈絡(luò)，連貫周身經(jīng)穴，調(diào)節(jié)機(jī)體的整體功能。頂顳前斜線位于頭頂部側(cè)面，為頭部經(jīng)外奇穴前神聰與顳部膽經(jīng)懸厘之間的連線，臨床多將百會穴與頂顳前斜線連用，用于治療腦卒中后運(yùn)動不利。

缺血半暗帶是指正常腦血流量區(qū)與核心梗死區(qū)之間存在的選擇性神經(jīng)元死亡區(qū)、蛋白變性區(qū)、缺氧區(qū)和彌散受限區(qū)[18]。及時恢復(fù)潛在恢復(fù)期的細(xì)胞功能可有效改善缺血后的運(yùn)動功能障礙[19]。缺血半暗帶主要分布于大腦皮質(zhì)，基底節(jié)皮質(zhì)下深部半暗帶組織較少[20]。且感覺皮質(zhì)、運(yùn)動皮質(zhì)及輔助運(yùn)動皮質(zhì)等區(qū)域存在廣泛、復(fù)雜的結(jié)構(gòu)和功能聯(lián)系，共同完成精細(xì)、復(fù)雜隨意運(yùn)動的中樞控制[21]。大腦皮質(zhì)損傷和相關(guān)功能重構(gòu)被認(rèn)為是導(dǎo)致多種神經(jīng)系統(tǒng)疾病或損傷(如腦卒中、腦外傷等)患者運(yùn)動功能障礙發(fā)生和恢復(fù)的重要原因之一[22]。

腦損傷后，運(yùn)動功能障礙恢復(fù)的關(guān)鍵在于受損區(qū)域的皮質(zhì)重建和神經(jīng)細(xì)胞修復(fù)，這與突觸重塑的發(fā)生密切相關(guān)[23]。突觸是神經(jīng)元細(xì)胞間一種特殊的細(xì)胞-細(xì)胞接觸部位，是神經(jīng)系統(tǒng)參與化學(xué)神經(jīng)傳遞的主要結(jié)構(gòu)。急性缺血性腦卒中發(fā)生后，供應(yīng)大腦的動脈被阻塞，導(dǎo)致多種病理生理變化，包括血腦屏障破壞、腦水腫、神經(jīng)元死亡和腦突觸損傷等[24]。梗死區(qū)域以外的腦區(qū)和運(yùn)動束也可能出現(xiàn)結(jié)構(gòu)異常，并可能誘發(fā)功能障礙，導(dǎo)致行為缺陷[25]。

對腦卒中患者進(jìn)行電刺激，可以改善腦卒中患者的運(yùn)動功能，包括精細(xì)運(yùn)動功能[26]，缺血半暗帶在其中發(fā)揮著重要作用。

突觸素I 是突觸囊泡膜上的特異性蛋白質(zhì)，參與突觸囊泡的導(dǎo)入、轉(zhuǎn)運(yùn)和神經(jīng)遞質(zhì)的釋放、突觸囊泡再循環(huán)和突觸發(fā)生。病理狀態(tài)下，突觸素I 在損傷區(qū)域和大腦皮質(zhì)神經(jīng)元胞漿、突起及纖維束中的表達(dá)明顯下降；給予保護(hù)性措施后，突觸素I 又呈現(xiàn)動態(tài)性升高[27]。

缺血再灌注損傷后，星形膠質(zhì)細(xì)胞活化、增生，表現(xiàn)為細(xì)胞肥大，GFAP反應(yīng)性增高[28-29]。反應(yīng)性星形膠質(zhì)細(xì)胞增生生成的膠質(zhì)瘢痕抑制神經(jīng)元軸突的生長，且反應(yīng)性星形膠質(zhì)細(xì)胞增生后可釋放多種細(xì)胞因子加重炎癥反應(yīng)，并釋放具有神經(jīng)毒性的谷氨酸鹽與活性氧，加重神經(jīng)元的變性壞死[30]。

本研究顯示，穴位埋線后，缺血再灌注損傷大鼠的神經(jīng)功能和患側(cè)肢體肌力明顯提高，缺血半暗帶突觸素I陽性表達(dá)升高，GFAP陽性表達(dá)降低，推測穴位埋線可能通過提高缺血半暗帶區(qū)域的突觸傳遞，加強(qiáng)突觸間的聯(lián)系及傳導(dǎo)，進(jìn)而提高患側(cè)肢體的運(yùn)動功能。值得注意的是，由于樣本量的局限性，缺血再灌注損傷大鼠缺血半暗帶腦組織內(nèi)GFAP 在免疫組織化學(xué)、Western blotting 和RT-qPCR 檢測中有些許誤差，但這種誤差并未影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果，在后續(xù)實(shí)驗(yàn)研究中加大樣本量則可減少上述情況。

有研究表明[31-34]，在腦卒中患者生命體征穩(wěn)定后予穴位埋線治療，可使腦卒中患者運(yùn)動功能得到不同程度的改善。也有研究證明[35]，穴位埋線可改善腦缺血再灌注大鼠的肢體痙攣，可能與穴位埋線提高大鼠腦組織中谷氨酰胺合成酶的表達(dá)有關(guān)。

目前，穴位埋線的臨床應(yīng)用仍更多集中于更年期綜合征[36-38]及疼痛相關(guān)疾病[39-42]。本研究顯示，穴位埋線可用于腦卒中后運(yùn)動功能障礙的康復(fù)。

腦卒中后運(yùn)動功能障礙的機(jī)制復(fù)雜，要求我們采用多種方式和手段進(jìn)行綜合康復(fù)。穴位埋線的更多作用機(jī)制還需要進(jìn)一步研究。

利益沖突聲明：所有作者聲明不存在利益沖突。