超短波對急性肺損傷大鼠炎癥反應的療效及其機制

周君 ，劉丹妮，王麗瓊，王謙，李懿，屈萌艱，劉靜，曾亞華，何成奇

1.四川大學華西醫院康復醫學科，四川成都市 610041；2.康復醫學四川省重點實驗室，四川成都市 610041；3.南華大學附屬第一醫院康復醫學科，湖南衡陽市421001

急性肺損傷(acute lung injury,ALI)是指各種內、外致病因素導致的急性、彌漫性肺損傷[1]。ALI 發病機制復雜，目前尚未完全明確，但炎性遞質參與的過度炎癥反應被公認是ALI 發生的主要原因[2-3]。核苷酸結合寡聚化結構域樣受體蛋白3 (nucleotide-binding oligomerization domain like receptor protein 3,NLRP3)炎癥小體的激活在ALI 發生、發展過程中發揮重要作用[4-7]。抑制NLRP3炎癥小體的激活，是控制ALI過度炎癥反應的重要策略[8-11]。

超短波療法是指利用高頻振蕩電流產生超高頻電磁場作用于人體的高頻電療法，可促進局部血液循環，改善血管通透性，促進炎癥因子的消散，發揮抗炎作用[12-15]。超短波被廣泛應用于肺部炎癥的對癥治療[16-19]。新型冠狀病毒病(coronavirus disease 2019,COVID-19)重癥患者具有ALI癥狀和病理表現[20]。對COVID-19患者是否使用超短波治療，專家的意見并不完全一致[21-24]。本研究探討超短波對ALI 的療效及作用機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

3 月齡清潔級Sprague-Dawley 雄性大鼠24 只，購于湖南省斯萊克景達實驗動物有限公司，實驗動物合格證號SCXK(湘)2019-0004，體質量(427.0±40.7) g。飼養于南華大學實驗動物中心，室溫(24±2)℃，濕度(55±5)%，12 h 黑暗/光照循環交替；大鼠自由攝食、飲水。適應性飼養1周后，行后續實驗。

相關操作均嚴格遵循我國《實驗動物管理條例》和南華大學附屬第一醫院倫理委員會的相關規定。

1.2 主要試劑與儀器

脂多糖：北京SOLARBIO 公司。白細胞介素(interleukin,IL)-1β ELISA 試劑盒：美國PROTEINTECH公司。IL-18 ELISA 試劑盒：武漢華美生物工程有限公司。熒光定量聚合酶鏈反應(polymerase chain reaction,PCR)儀、熒光PCR 板、Trizol 試劑：美國THERMO 公司。Tris 試劑：美國SIGMA 公司。引物合成及探針修飾：上海生物工程有限公司。NLRP3 一抗、IL-1β 一抗、山羊抗小鼠IgG (HRP)：美國PROTEINTECH公司。caspase-1 一抗：美國CST 公司。臺式冷凍離心機：中國湖南湘儀公司。光學顯微鏡：日本奧林巴斯株式會社。切片機：德國LEICA公司。CDB-1超短波電療機：上海醫療器械高技術公司。

1.3 方法

隨機數字表法將大鼠隨機分為對照組、ALI 組和超短波組，每組8 只。后兩組參照本課題組前期造模方法[8]，10%水合氯醛3 ml/kg 腹腔注射麻醉，頸部正中切口，暴露氣管，1 ml注射器刺入氣管，緩慢滴注5 mg/ml 脂多糖5 mg/kg。對照組同法滴注等體積生理鹽水。

超短波組在造模后即刻、4 h、8 h，分別予超短波干預15 min：工作頻率40.68 MHz，強度50 mA，兩個29×20 cm 電極板對置于塑料盒(28×20×11 cm)的上面和下面。干預時，每次取2只大鼠置于塑料盒里，大鼠可以自由活動。

對照組、ALI組不做任何干預。

造模后24 h，同法麻醉，眼眶取血4 ml，脫頸斷頭處死動物。取右上肺測量計算肺組織濕/干重比(wet/dry mass ratio,W/D)；取左下肺行HE 染色；取右下肺液氮罐中低溫保存，用于逆轉錄PCR (reverse transcription PCR,RT-PCR)和Western blotting檢測。

1.3.1 W/D

取右上肺組織約1 cm3，干凈濾紙吸干表面水分后稱濕質量；肺組織錫箔包裹，60 ℃恒溫箱烘烤48 h，至質量不再減少時，再次稱量干質量，計算W/D。

1.3.2 HE染色

左下肺組織常規HE 染色，觀察肺組織形態，參照相關評分標準[25-27]行肺組織損傷評分。分4 項：肺泡充血、出血、肺泡腔或血管壁中性粒細胞浸潤或聚集、肺泡壁增厚和/或透明膜形成。依病變輕重分別評0～4 分：0 分，無病變或非常輕微病變；1 分，輕度病變；2 分，中度病變；3 分，重度病變；4 分，極重度病變。計算4項評分總和。

1.3.3 血清IL-1β和IL-18

血液標本25 ℃放置2 h，冰凍離心機3000 r/min離心30 min，取上清液600 μl，-80 ℃冰箱保存。ELISA 試劑盒測定血清IL-1β、IL-18 水平，嚴格按照說明書操作。

1.3.4 NLRP3、caspase-1和IL-1β mRNA表達

Trizol 提取肺組織總RNA，以樣品總mRNA 為模板，行逆轉錄cDNA，以cDNA為模板，加入NLRP3、caspase-1 和IL-1β 上下游引物進行擴增。以β-actin 為內參。

NLRP3 引物：上游5'-CAC CTC TTC TCT GCC TAC CTG-3'；下游5'-AGC TGT AAA ATC TCT CGC AGT-3'。引物間片段長181 bp。

caspase-1 引物：上游5'-CTA GAC TAC AGA TGC CAA CCA C-3'；下游：5'-GGC TTC TTA TTG GCA TGA TTC CC-3'。引物間片段長128 bp。

IL-1β 引 物：上 游5'-CAG CAG CAT CTC GAC AAG AG-3'；下游5'-AAA GAA GGT GCT TGG GTC CT-3'。引物間片段長123 bp。

根據動力學曲線確定樣品管中熒光強度增加到特定閾值時的擴增循環數(Ct)，計算2－ΔΔCt。

1.3.5 NLRP3、caspase-1和IL-1β蛋白表達

肺組織清洗、研磨、裂解，4 ℃冷凍離心機12000 r/min 離心15 min，取上清400 μl；經電泳，轉膜，封閉，加NLRP3、caspase-1和IL-1β一抗、二抗孵育，顯色、曝光。底片掃描，采用QuantityOne 軟件進行灰度分析。

1.4 統計學分析

2 結果

2.1 W/D

ALI 組W/D 較對照組升高(P< 0.05)；超短波組W/D 較ALI 組有降低趨勢，但無顯著性差異(P>0.05)。見表1。

2.2 HE染色

對照組肺泡結構大致正常；ALI 組肺泡壁增厚，肺間質可見大量炎性細胞浸潤，肺泡可見紅細胞滲出；與ALI 組比較，超短波組肺損傷程度明顯減輕。見圖1。

ALI 組肺損傷評分比對照組增高(P<0.05)；超短波組較ALI組降低(P<0.05)。見表1。

2.3 血清IL-1β和IL-18

ALI 組血清IL-1β 和IL-18 水平較對照組升高(P<0.05)；超短波組較ALI組降低(P<0.05)。見表1。

2.4 NLRP3、caspase-1和IL-1β mRNA表達

ALI 組NLRP3、caspase-1 和IL-1β mRNA 較對照組增高(P< 0.05)；超短波組較ALI 組降低(P< 0.05)。見表2。

2.5 NLRP3、caspase-1和IL-1β蛋白表達

ALI 組NLRP3、caspase-1 和IL-1β 蛋白表達較對照組增高(P< 0.05)；超短波組較ALI 組降低(P<0.05)。蛋白表達水平變化趨勢與mRNA表達一致。見圖2、表3。

表2 各組NLRP3、caspase-1和IL-1β mRNA表達(2－ΔΔCt)

圖2 各組NLRP3、caspase-1和IL-1β蛋白表達(Western blotting)

表3 各組NLRP3、caspase-1和IL-1β蛋白表達(/β-actin)

3 討論

ALI 發病率高，病死率高，臨床頗為棘手，肺內因素(重癥肺炎等)和肺外因素(嚴重創傷、膿毒血癥等)均可導致發病。病理表現為急性彌漫性毛細血管、肺泡損傷，進而引起肺不張、肺水腫，臨床表現為頑固性低氧、呼吸窘迫和急性呼吸衰竭等[28-30]。目前ALI 尚缺乏特效治療方法[31]。失控、過度的炎癥反應是ALI 的根本因素[32]。超短波常用于肺部感染的對癥治療，可縮短發熱時間，緩解咳嗽、咯痰癥狀[33]。本研究顯示，超短波能抑制ALI 炎癥反應，降低血清炎癥因子水平，抑制ALI 后NLRP3/caspase-1/IL-1β 信號通路。

脂多糖是革蘭氏陰性細菌的主要致病成分，常被用來復制ALI動物模型[34-35]。ALI后，肺毛細血管通透性增加，炎性遞質、蛋白進入肺泡和肺間質，引起肺水腫；炎癥因子損傷肺泡上皮細胞，導致肺泡表面活性物質生成減少，肺泡表面張力增大，肺泡毛細血管中液體向肺泡內濾出增多，加重肺水腫。本研究顯示，ALI 后，肺組織W/D 升高，出現嚴重肺水腫；超短波治療可能有降低肺水腫的作用，但尚不明確。有的研究中，肺組織干重于80 ℃烘干48 h 后測量[36-37]，本研究只60 ℃烘烤48 h，烘烤不足可能對結果有影響。

過度炎癥反應是本病發生的重要原因[38]。本研究顯示，ALI 大鼠炎性損傷嚴重，超短波治療能減輕肺損傷程度，抑制炎癥因子釋放。ALI 的病理特征為進行性炎癥失控，肺巨噬細胞焦亡可能是部分原因。巨噬細胞焦亡會釋放促炎癥因子IL-1β 和IL-18[39]，IL-1β和IL-18 是NLRP3 炎癥小體激活的產物，也可在支氣管肺泡灌洗液(bronchoalveolar lavage fluids,BALF)中檢測到。在脂多糖誘導的ALI 小鼠模型中，BALF 中出現中性粒細胞來源的細胞外組蛋白，直接激活NLRP3炎癥小體[40]。

眾多炎性遞質通過不同信號通路作用于巨噬細胞、中性粒細胞等效應細胞，介導ALI 的炎癥反應，其中NLRP3/caspase-1/IL-1β 信號通路在ALI 炎癥反應中起重要作用。NLRP3 炎性小體是一種多蛋白復合體，包括NLRP3、接頭蛋白凋亡相關斑點樣蛋白和前體caspase-1。當肺組織受到相應刺激后，炎癥小體將caspase-1 前體裂解成具有活性的caspase-1，進而促進IL-1β 和IL-18 前體生成有活性的成熟IL-1β 和IL-18，誘發其他炎性細胞因子合成和釋放，放大局部和全身炎癥反應，導致肺泡上皮通透性增加，肺泡屏障功能障礙，加重疾病進展[41]。本研究顯示，ALI 大鼠肺組織NLRP3、caspase-1 和IL-1β mRNA 和蛋白表達增高，超短波干預可顯著降低NLRP3、caspase-1 和IL-1β表達。

綜上所述，超短波療法能減輕脂多糖誘導的大鼠ALI 炎癥反應，可能與抑制NLRP3/caspase-1/IL-1β 信號通路有關。NLRP3/caspase-1/IL-1β 信號也是調控肺巨噬細胞焦亡的重要信號通路，細胞焦亡過程會釋放促炎因子IL-1β 和IL-18，肺巨噬細胞焦亡也是肺組織過度炎癥反應的重要原因[39]。本研究顯示，超短波治療后，隨著肺組織NLRP3/caspase-1/IL-1β 信號被抑制，血清炎癥因子IL-1β 和IL-18水平也降低。超短波是否通過抑制肺巨噬細胞焦亡，發揮抗炎、抑制肺損傷作用，有待進一步研究。鑒于超短波能抑制ALI 的炎癥反應，有可能對COVID-19 重癥患者有益，值得進一步探索。

利益沖突聲明：所有作者聲明不存在利益沖突。