復方當歸注射液對叔丁基過氧化氫誘導的EA.hy926 細胞氧化損傷的保護作用

冀宇蘭 ，郭博文 ，苗俊秋 ，原紅霞 ，李青山

（1.山西中醫藥大學中藥與食品工程學院，山西晉中030619；2.山西中醫藥大學，基于炎性反應的重大疾病創新藥物山西省重點實驗室，山西晉中030619）

●“實驗”雖然是現代科學研究常用的方法，然在我國卻自古有之。古代學者王沖說“等類眾多，行事比肩，略舉較著，以定實驗也”，顏之推說“昔在江南，不信有千 人帳，及來河北，不信有二萬斛船，皆實驗也”，大凡此義均與現代科學意義上的experiment相通。照此，傳統中醫藥學并非只是經驗之學，而更充滿實驗的思想和方法。實驗中醫藥學，將現代實驗科學的方法和傳統中醫藥學的實驗方法融合起來，開拓現代實驗生物學、醫學和藥物科學的新領域。

心血管疾病是導致人類死亡的主要原因之一，其發病率和致死率呈逐年上升趨勢［1-3］。研究發現，氧化應激誘導血管內皮細胞損傷是誘發心血管疾病如心力衰竭、缺血再灌注損傷等的重要因素［4］。

復方當歸注射液是由當歸、川芎和紅花制成的常用中藥復方制劑，其功效為活血通經、祛瘀止痛［5］，臨床上常用于心腦血管缺血性疾病的治療［6］?，F代藥理學實驗表明，復方當歸注射液具有改善大鼠腦缺血、心肌缺血等作用［7］，目前針對復方當歸注射液的臨床研究和藥理研究報道較多，但其作用機制報道較少。因此，本研究從抗氧化應激的角度，以1，1-二苯基-2-三硝基苯肼自由基（DPPH）清除法及羥基自由基清除法測定復方當歸注射液的抗氧化活性，在此基礎上以對叔丁基過氧化氫（t-BHP）誘導人臍靜脈內皮細胞（EA.hy926）氧化應激損傷建立體外模型，進一步研究復方當歸注射液在細胞水平的抗氧化活性。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 藥物與試劑 EA.hy926 人臍靜脈細胞融合細胞購自中科院上海細胞庫；復方當歸注射液購自上海新亞藥業高郵有限公司，批號：180605-2）。高糖DMEM、胎牛血清、0.25%胰蛋白酶-EDTA 消化液均購自武漢博士德生物工程有限公司，乳酸脫氫酶（LDH）、丙二醛（MDA）、超氧化物歧化酶（SOD）、還原性谷胱甘肽（GSH-Px）試劑盒均購自碧云天生物技術研究所，噻唑藍、二甲基亞砜（DMSO）均購自北京索萊寶科技有限公司。

1.1.2 實驗儀器 生物安全柜（ESCO，型號AC2-4S1）；二氧化碳恒溫培養箱（ESCO，型號CCL-170B-8）；倒置光學顯微鏡（麥克奧迪）；連續波長多功能化學發光熒光酶標儀（Molecular devices）；臺式高速冷凍離心機（Genespeed）；-80 ℃超低溫冰箱（ESCO，型號 UUS-714A-1-5D-SS）；微量加樣器（Eppendorf）；96 孔板混勻儀（WIGGENS）。

1.2 實驗方法

1.2.1 復方當歸注射液DPPH 自由基清除率測定 參照 Siow HL 等［8］方法測定 DPPH 自由基清除率。具體步驟如下：取2 mL DPPH 溶液（濃度約為0.05 mg/mL），與不同濃度復方當歸注射液2 mL，充分混勻，暗處反應30 min，517 nm 處測量其吸光度值Asample，控制樣本用2 mL 蒸餾水代替提取物，進行相同的處理后，于517 nm 處測定吸光度，結果記為Acontrol。BHT 為陽性對照。按公式（Acontrol-Asample）/Acontrol×100%，計算復方當歸注射液的DPPH 自由基清除率（%）。

1.2.2 復方當歸注射液羥基自由基清除率測定 參照惠和平等［9］方法稍做修改測定羥基自由基清除率。具體步驟如下：在反應體系中分別加入0.2 mL 7.5 mmol/L 鄰二氮菲、2 mL PBS 溶液（0.15 mol/L，pH 7.5）、0.2 mL 7.5 mmol/L 硫酸亞鐵溶液和 3.8 mL蒸餾水，加入待測樣品0.4 mL 混勻后，加入0.4 mL體積分數1 %雙氧水溶液搖勻，37 ℃條件下水浴60 min，在 510 nm 處測其吸光度（A 樣）；另設陰性對照管和正常管，陰性對照管不加待測樣品（用0.4 mL 蒸餾水代替樣品液），重復上述操作，在510 nm 處測其吸光度（A 損）；正常管不加待測樣品和雙氧水溶液（用0.8 mL 蒸餾水代替），重復上述操作，在510 nm 處測其吸光度（A 空）。按公式（A 樣-A 損）/（A 空-A 損）×100%，計算復方當歸注射液羥基自由基清除率（%）。

1.2.3 復方當歸注射液對EA.hy926 細胞氧化損傷保護作用

1.2.3.1 EA.hy926 細胞培養 EA.hy926 細胞常規培養于含10 %（V/V）胎牛血清和1 %青鏈霉素混合液的高糖DMEM 培養基中，置于37 ℃、5%CO2、飽和濕度的培養箱中，待細胞達到80%左右的融合度時，用0.25%胰蛋白酶消化并傳代，取生長狀態良好處于對數生長期的細胞用于實驗。

1.2.3.2 MTT 法檢測細胞活性 取對數生長期的EA.hy926 細胞，以每毫升 1.0×105個接種于 96 孔板，每孔100 μL。將培養板放入孵箱中，37 ℃、5%CO2及飽和濕度條件下正常培養，待細胞貼壁后，以不同濃度（5，10，20 μL/mL）的復方當歸注射液分別孵育6 h，12 h 和24 h，棄去培養液，再以600 μmol/L 的t-BHP 繼續處理3 h。以含1%雙抗的DMEM 培養基為正常組，每組各5 個平行。每孔加入 MTT（5 mg/mL）10 μL，繼續培養 4 h，小心吸取上清液，每孔加入100 μL 的DMSO 溶解結晶顆粒，波長490 nm 處測定光密度值。

1.2.3.3 LDH 活力、MDA 含量及 GSH-Px、SOD 活性檢測 EA.hy926 細胞經不同濃度（5，10，20 μL/mL）復方當歸注射液預處理，棄去培養液，再以600 μmol/L t-BHP 作用 3 h 后，0.25 %胰酶消化，冷PBS 清洗兩次，然后采用細胞裂解緩沖液進行細胞裂解，10 000 r/min、4 ℃離心 10 min，取上清，分別按 LDH、MDA、GSH-Px 和 SOD 試劑盒說明書進行檢測。

1.3 統計學分析

2 結 果

2.1 復方當歸注射液清除DPPH 自由基的能力

不同濃度的復方當歸注射液DPPH 自由基清除活性如圖1A 所示，結果表明復方當歸注射液對DPPH 自由基具有清除作用，且具有量效關系。應用GraphPad Prism 7.04 軟件處理復方當歸注射液的量-效關系數據并計算其清除DPPH 自由基的 EC50值為 20.88 μL/mL。

2.2 復方當歸注射液清除羥基自由基的能力

不同濃度的復方當歸注射液羥基自由基清除活性如圖1B 所示，結果表明復方當歸注射液對羥基自由基的清除活性隨濃度升高而增大，呈現濃度依賴性。應用GraphPad Prism 7.04 軟件處理復方當歸注射液的量-效關系數據并計算其清除羥基自由基的EC50值為0.8211 mL/mL。

圖1 復方當歸注射液對DPPH 自由基、羥基自由基清除率的影響

圖2 復方當歸注射液對t-BHP 誘導的EA.hy926 細胞存活率影響

2.3 復方當歸注射液對EA.hy926 細胞氧化損傷保護作用

2.3.1 復方當歸注射液對t-BHP 損傷的EA.hy926 細胞活性的影響 與正常細胞組相比，6 h，12 h 和24 h 3 個時間段模型組（t-BHP 損傷組）細胞活力顯著降低（P＜0.01）；與模型組（t-BHP 損傷組）相比，復方當歸注射液組細胞活力隨濃度梯度增高逐漸上升（P＜0.05，P＜0.01），呈現了明確的量效關系。結果見圖2。

2.3.2 復方當歸注射液對細胞培養液中SOD、GSH-Px 的活力及MDA、LDH 含量的影響 與正常細胞組相比，模型組（t-BHP 損傷組）SOD、GSH-Px活力明顯下降（P＜0.01），MDA、LDH 含量明顯上升（P＜0.01）；與模型組（t-BHP 損傷組）相比，復方當歸注射液組SOD、GSH-Px 活力顯著升高（P＜0.01），MDA、LDH 含量顯著下降（P＜0.05，P＜0.01）。結果見圖3。

圖3 復方當歸注射液對t-BHP 誘導的EA.hy926 細胞SOD、GSH-Px 的活力及 MDA、LDH 含量的影響

3 討 論

近年來大量研究表明生物體內過量的氧自由基及氧化應激是導致心血管系統心力衰竭、缺血再灌注損傷的重要原因之一［10］。復方當歸注射液作為當歸、川芎、紅花為組分制成的中藥復方注射液，臨床上常用于心腦血管缺血性疾病的防治［6］，為闡明臨床上復方當歸注射液的作用機制，本研究以DPPH 自由基及羥基自由基清除法并進一步在細胞水平建立氧化應激損傷模型來系統研究復方當歸注射液的體外抗氧化性能。

DPPH 自由基是一種很穩定的以氮為中心的自由基，其可以捕獲其他的自由基［11］，對 DPPH 自由基的清除效果可以反映物質的抗氧化能力。OH自由基能與絕大部分生物大分子物質發生反應，其反應可能導致嚴重的組織損傷或細胞死亡［12］。因此，及時清除多余的OH 自由基對保護機體的正常生命活動和生理代謝反應具有重要作用。本研究結果顯示，復方當歸注射液能有效地清除DPPH 自由基和羥基自由基，具有一定的體外抗氧化活性。

自由基激發的脂質過氧化物可以導致質膜損傷，當細胞破壞或細胞膜通透性增加時，LDH 從細胞內漏出，因此，LDH 水平可較準確反映細胞或細胞膜損傷的程度［13］。MDA 是脂質過氧化產物之一，其水平的高低可反映機體脂質過氧化的程度，細胞內MDA 含量可提示氧化應激損傷程度［14］。本研究中，模型組LDH 和MDA 升高，而不同濃度的給藥組LDH 和MDA 含量隨復方當歸注射液劑量的增加逐漸下降，表明復方當歸注射液可以維持EA.hy926 細胞的完整性。SOD 是一種重要的抗氧化酶，能清除超氧陰離子自由基，保護細胞免受損傷，其活性高低間接反映機體清除氧自由基的能力［15］。GSH-Px 作為抗氧化酶能夠拮抗氧化應激引起的細胞損傷，修復受損細胞，其活性可以反映機體的抗氧化能力。本研究中，模型組SOD 和GSH-Px 下降，而不同濃度給藥組中SOD 和GSHPx 隨復方當歸注射液劑量的增加則逐漸升高，表明復方當歸注射液具有潛在的抗氧化作用。

綜上所述，本研究結果表明復方當歸注射液對DPPH 自由基和OH 自由基均有較明顯的清除作用，對t-BHP 誘導EA.hy926 細胞氧化損傷有一定的保護作用，提示復方當歸注射液的藥理作用機制可能與其抗氧化作用密切相關。