冰片配伍黃芪甲苷和三七總皂苷對大鼠腦缺血再灌注損傷神經元的保護作用

歐陽波，劉曉丹，楊筱倩，丁 煌，唐 三，黃小平*，鄧常清*

（湖南中醫藥大學分子病理實驗室，中西醫結合心腦疾病防治湖南省重點實驗室，細胞生物學與分子技術湖南省高校重點實驗室，湖南 長沙410208）

缺血性腦卒中是嚴重威脅人類生命健康的疾病，具有高致病率、高致殘率和高致死率的特點。中醫認為缺血性腦卒中的主要病機是氣虛血瘀。中藥黃芪配伍三七具有補氣活血的功效，能針對腦缺血的主要病機發揮藥理作用，是治療缺血性腦卒中的常用中藥。現代藥理學研究表明，黃芪的主要有效組分是黃芪甲苷(astragaloside Ⅳ, AST Ⅳ)[1]，三七的主要有效組分是三七總皂苷(panax notoginseng saponins, PNS)[2]。在中藥復方有效組（成）分配伍研究模式指導下，課題組前期研究表明，AST Ⅳ配伍PNS 可以通過多環節、多靶點機制發揮抗腦缺血作用[3-4]。但是，在腦組織和外周血液之間存在一個復雜的細胞結構屏障——血腦屏障(blood-brain barrier, BBB)。BBB 控制腦脊液與血液之間的物質轉運，雖然能阻止大分子有害物質進入腦組織，但是也限制了大分子藥物進入腦內發揮藥理作用。AST Ⅳ及PNS 相對分子量均較大，難以透過BBB進入腦組織，這就限制了其發揮藥理作用。冰片可“引藥上行”，能促進一些大分子藥物透過BBB[5]。我們以往的研究表明，冰片與AST IV、PNS 配伍后，能促進AST IV 及PNS 的主要成分人參皂苷Rb1、Rg1 和三七皂苷R1 向大腦皮層富集，尤其是向腦缺血再灌注損傷(cerebral ischemia reperfusion injury,CIRI)側大腦皮層富集[6]。進一步研究表明，冰片配伍AST IV 和PNS 不但不增加腦缺血后BBB 的通透性，反而對受損BBB 具有保護作用，其促進藥物透過BBB的作用是通過抑制BBB 上藥物轉運相關的外排蛋白、促進藥物攝取蛋白表達而促進藥物進入腦組織[7]。以上研究提示冰片配伍AST Ⅳ和PNS后可促進藥物透過BBB 入腦，更好地發揮抗腦缺血的作用。本文進一步研究冰片配伍AST Ⅳ和PNS對腦缺血后神經元的保護作用，從而為其合理應用與開發提供實驗依據。

1 材料與方法

1.1 動物

雄性SPF 級SD 大鼠，體質量240～260 g，由湖南斯萊克景達實驗動物有限公司提供，動物生產合格證號：43004700037715。飼養于湖南中醫藥大學動物實驗中心，場地許可證號：SKY(湘)2013-0005。 實驗前適應性喂養5～7 d，給藥前禁食12 h，自由飲水。 動物的使用符合科技部《關于善待實驗動物的指導性意見》相關規定。

1.2 主要藥物

冰片(左旋龍腦，主要成分為1,7-三甲基-二環庚-2-醇，含量86%，購自湖北俊輝有限公司，批號：20170815)；AST Ⅳ(純度≥98%，批號：MUST-17022804)、PNS(純度≥98%，批號：MUST-17060601)均購自成都曼思特生物科技有限公司，用時以0.5%羧甲基纖維素鈉配成混懸液。 依達拉奉注射液（3-甲基-1-苯基-2-吡唑啉-5 酮）購自南京先聲東元制藥有限公司，批號：80-090104，規格10 mg/支(5 mL)，用時以生理鹽水配成0.4 mg·mL-1溶液備用。

1.3 主要試劑

甲苯胺藍染液（谷歌生物，批號G1032）；小鼠抗大鼠神經絲蛋白200(neurofilament-200, NF-200)單克隆抗體(美國CST 公司，批號2836)；小鼠抗大鼠αII-血影蛋白(αII-Spectrin, αII SP)單克隆抗體（美國Abcam 公司，批號ab11755）；兔抗大鼠β-actin多克隆抗體（美國ABclonal 公司，批號A7248）；HRP標記的山羊抗兔二抗(美國Proteintech 公司，批號SA00001-2)；HRP 標記的山羊抗小鼠二抗(美國ABclonal公司，批號AS003)；Cy5 標記山羊抗小鼠IgG（谷歌生物，批號GB27301）；DAPI 染色液（北京鼎國昌盛生物科技有限公司，批號GD3410）；RIPA 蛋白裂解液（康為世紀生物科技有限公司，批號CW2333）；蛋白酶抑制劑混合物（批號P1005）、磷酸酶抑制劑混合物A（批號P1082）（碧云天生物技術有限公司）；ECL 化學發光液(北京鼎國昌盛生物科技有限公司，批號GE2301)；蛋白Marker(美國Thermo-fisher公司，批號515683)；BCA 蛋白定量試劑盒(北京中杉金橋生物技術有限公司，批號K176810E)。

1.4 主要儀器

BX51 光學顯微鏡（日本Olympus 公司）；Nikon Eclipse C1 正置熒光顯微鏡、Nikon DS-U3 成像系統（日本Nikon 公司）；EG1160 組織病理包埋儀（德國leica 公司）；Chemi-DoC-XRS+化學發光成像分析儀、041BR132283 電泳/轉膜裝置（美國Bio-Rad 公司）；ELX800 多功能酶標儀（美國Biotek 公司）。

2 方法

2.1 動物分組與給藥

根據以往研究[8]，將動物隨機分為假手術組、模型組、冰片組（7.5 mg·kg-1）、AST Ⅳ組（10 mg·kg-1）、PNS 組（25 mg·kg-1）、AST Ⅳ+PNS 組（AST Ⅳ10 mg·kg-1+PNS 25 mg·kg-1）、低劑量組（冰片7.5 mg·kg-1+AST Ⅳ10 mg·kg-1+PNS 25 mg·kg-1）、高劑量組（冰片15 mg·kg-1+AST Ⅳ20 mg·kg-1+PNS 50 mg·kg-1）、依達拉奉組（4 mg·kg-1）。 冰片、AST Ⅳ、PNS 及其配伍各組于造模前3 d 灌胃給藥，每日2 次，同時腹腔注射等量生理鹽水。依達拉奉組腹腔注射給藥，同時灌胃等量0.5%羧甲基纖維素鈉，每日2 次。假手術組和模型組以0.5%羧甲基纖維素鈉10 mL·kg-1劑量灌胃給藥，同時腹腔注射等量生理鹽水，每日2 次。末次給藥后2 h 造模。 缺血2 h 后進行再灌注，再灌注期間同前給藥，再灌注后22 h 進行檢測。

2.2 右側大腦中動脈阻塞（middle cerebral artery occlusion, MCAO）制備大鼠CIRI 模型

按以往方法[3]制作線栓法MCAO 局灶性腦缺血模型，阻斷2 h 后，拔出線栓進行再灌注22 h。假手術組不做插線處理，其他操作同模型組。各組納入Bederson 評分[9]為1～3 分的大鼠，剔除評分為0 分或4 分的大鼠。

2.3 檢測指標

2.3.1 神經功能缺損評分 采用Zea Longa 評分法[10]測定神經功能評分。0 分：無明顯神經功能缺失癥狀；1 分：輕度局灶性神經功能障礙（不能完全伸展左側前肢）；2 分：中度局灶性神經功能障礙（行走時向左側旋轉）；3 分：重度神經功能障礙（行走時向左側傾倒）；4 分：極重度神經功能障礙（不能自發行走或意識喪失）。

2.3.2 尼氏染色法測定腦組織CA1 區病理形態 再灌注22 h 后，再次麻醉動物，經心臟灌流生理鹽水，斷頭取腦，去除小腦和腦干，4%多聚甲醛固定24～48 h。自視交叉后2～4 mm 處，冠狀切取2 mm 厚腦組織(含有海馬)，常規脫水、二甲苯透明、石蠟包埋，冠狀位切片，片厚5 μm。 行尼氏染色：依次將切片放入二甲苯Ⅰ(20 min)、二甲苯Ⅱ（20 min）、無水乙醇Ⅰ（5 min）、無水乙醇Ⅱ（5 min）、75%酒精（5 min），自來水沖洗。 蒸餾水稍洗后，置于1%甲苯胺藍染液中50～60 ℃浸染30 min。繼續蒸餾水稍洗，于95%酒精中迅速分化，使用無水酒精脫水、二甲苯透明、中性樹膠封片。按照文獻[11]方法，觀察缺血側海馬CA1 區，取長度200 μm 海馬CA1 區，用ImageJ 圖像分析軟件計錄氏體數量，每張切片計數3 個不重復視野的尼氏體數量，取均值進行分析。

2.3.3 免疫熒光法檢測NF-200 蛋白表達 按“2.3.2”項方法制成石蠟切片。將石蠟切片脫蠟至水后置于抗原修復緩沖液中行抗原修復；然后滴加3% BSA孵育30 min；再滴加小鼠抗大鼠NF-200單克隆抗體一抗(1∶500)，4 ℃孵育過夜。 滴加HRP標記的山羊抗小鼠二抗(1∶1 000)，于室溫孵育30 min。滴加Cy5 標記山羊抗小鼠IgG(1∶500)試劑，避光、室溫下孵育10 min。滴加自發熒光淬滅劑5 min；最后滴加DAPI 染液，避光、室溫下孵育10 min后，用抗熒光淬滅封片劑封片。 置熒光顯微鏡下觀察并采集右腦缺血側海馬CA1 區圖像，DAPI 激發為藍光熒光，CY5 激發為粉色熒光。隨機取3 個不重疊高倍視野(×400)拍照。 Nikon DS-U3 圖像采集分析系統測定海馬CA1 區NF-200 免疫熒光強度，以熒光強度表示蛋白的表達。

2.3.4 Western blot 檢測αⅡ-Spectrin 蛋白的表達 取患側視交叉后2～4 mm 腦組織50 mg，提取總蛋白，BCA 法測定總蛋白量。 每個樣本取80 μg 蛋白，100 ℃水浴10 min 使蛋白變性，SDS-PAGE 電泳90 min，200 mA 轉膜2 h，5%脫脂牛奶封閉1 h，分別加入小鼠抗大鼠αⅡ-Spectrin 單克隆抗體(1∶1 000)、兔抗大鼠β-actin 多克隆抗體(1∶1 000)，于4 ℃孵育過夜，TBST 洗膜3 次。 再分別加羊抗小鼠二抗(1∶8 000)或羊抗兔二抗(1∶5 000)，于37 ℃孵育1 h，TBST 洗膜3 次后加ECL 化學發光劑顯影。 用Image Lab 圖像分析軟件測定目的條帶的積分光密度值(integral optical density, IOD)，以目的條帶的IOD 值與β-actin 條帶IOD 值的比值作為該目的蛋白相對表達量。

2.4 統計分析

3 結果

3.1 冰片配伍AST Ⅳ和PNS 對神經功能缺損評分的影響

與假手術組比較，模型組大鼠出現神經功能障礙體征，神經功能缺損評分顯著升高(P＜0.01)。 與模型組比較，AST Ⅳ+PNS 組、低劑量組、高劑量組、依達拉奉組神經功能缺損評分顯著降低(P＜0.05，P＜0.01)，冰片組、AST Ⅳ組、PNS 組神經功能缺損評分差異無統計學意義(P＞0.05)。與AST Ⅳ組、PNS 組比較，AST Ⅳ+PNS 組神經功能缺損評分差異無統計學意義(P＞0.05)。與冰片組、AST Ⅳ組、PNS 組、ASTⅣ+PNS 組比較，低劑量組神經功能缺損評分顯著降低(P＜0.05 和P＜0.01)；與冰片組、AST Ⅳ組、PNS 組比較，高劑量組神經功能缺損評分顯著降低(P＜0.05和P＜0.01)，但與AST Ⅳ+PNS 組比較差異無統計學意義(P＞0.05)。 低劑量組和高劑量組比較，神經功能缺損評分差異無統計學意義(P＞0.05)。 見圖1。

圖1 各組神經功能缺損評分比較(±s,n=5）

3.2 冰片配伍AST Ⅳ和PNS 對海馬CA1 區尼氏體數量的影響

假手術組海馬CA1 區神經元胞質內可見深藍色斑塊狀尼氏體。與假手術組比較，模型組尼氏體數量顯著減少(P＜0.01)。與模型組比較，冰片組、ASTⅣ組、PNS 組、AST Ⅳ+PNS 組、低劑量組、高劑量組、依達拉奉組尼氏體數量顯著增加(P＜0.01)。 與AST Ⅳ組、PNS 組比較，AST Ⅳ+PNS 組尼氏體數量顯著增加(P＜0.05 和P＜0.01)。與冰片組、AST Ⅳ組、PNS 組和AST Ⅳ+PNS 組比較，低劑量組尼氏體數顯著增加(P＜0.01)。與冰片組、AST Ⅳ組、PNS 組比較，高劑量組尼氏體數顯著增加(P＜0.01)，但與AST Ⅳ+PNS 組比較，高劑量組差異無統計學意義(P＞0.05)。低劑量組和高劑量組比較，尼氏體數量差異無統計學意義(P＞0.05)。 見表1 和圖2。

表1 各組海馬CA1 區尼氏體數量比較(±s,n=5）

表1 各組海馬CA1 區尼氏體數量比較(±s,n=5）

注：與假手術組比較，##P＜0.01；與模型組比較，▲▲P＜0.01；與冰片組比較，●●P＜0.01；與AST Ⅳ比較，**P＜0.01；與PNS 組比較，★P＜0.05,★★P＜0.01；與AST Ⅳ+PNS 組比較，■■P＜0.01

尼氏體數/200 μm 48.2±3.1 29.6±2.1##34.6±1.5▲▲35.6±1.8▲▲37.6±2.2▲▲39.2±1.6▲▲**★43.4±1.5▲▲●●**★★■■42.0±1.6▲▲●●**★★40.4±2.6▲▲組別假手術組模型組冰片組AST Ⅳ組PNS 組AST Ⅳ+PNS 組低劑量組高劑量組依達拉奉組

圖2 各組海馬CA1 區尼氏體計數圖(×400)

3.3 冰片配伍AST Ⅳ和PNS 對海馬CA1 區NF-200 蛋白表達的影響

與假手術組比較，模型組海馬CA1 區NF-200蛋白表達顯著減少(P＜0.01)。與模型組比較，冰片組、AST Ⅳ組、PNS 組、AST Ⅳ+PNS 組 海 馬CA1 區NF-200 表達差異無統計學意義(P＞0.05)，低劑量組、高劑量組、依達拉奉組海馬CA1 區NF-200 表達顯著增加(P＜0.05，P＜0.01)。 與AST Ⅳ組、PNS 組比較，AST Ⅳ+PNS 組海馬CA1 區NF-200 表達差異無統計學意義(P＞0.05)。 與冰片組、AST Ⅳ組、PNS組和AST Ⅳ+PNS 組比較，低劑量組和高劑量組海馬CA1區NF-200 表達均顯著增加(P＜0.05，P＜0.01)。 低劑量組和高劑量組比較，海馬CA1 區NF-200 表達差異無統計學意義(P＞0.05)。 見圖3。

圖3 各組海馬CA1 區NF-200 蛋白表達的比較(±s,n=5，×400)

3.4 冰片配伍AST Ⅳ和PNS 對αⅡ-Spectrin 蛋白表達的影響

與假手術組比較，模型組αII-Spectrin 表達顯著減少(P＜0.01)。與模型組比較，冰片組、AST Ⅳ組、PNS 組、AST Ⅳ+PNS 組、高劑量組、依達拉奉組αII-Spectrin 表達差異無統計學意義(P＞0.05)，低劑量組αII-Spectrin表達顯著增加(P＜0.01)。 與AST Ⅳ組、PNS 組比較，AST Ⅳ+PNS 組αII-Spectrin 表達差異無統計學意義(P＞0.05)。與冰片組、AST Ⅳ組、PNS組和AST Ⅳ+PNS 組比較，低劑量組αII-Spectrin 表達顯著增加(P＜0.05 和P＜0.01)，但高劑量組αIISpectrin 表達差異無統計學意義(P＞0.05)。 與高劑量組比較，低劑量組αII-Spectrin 的表達組顯著增加(P＜0.05)。 見圖4。

圖4 各組αII-Spectrin 蛋白表達的比較(±s,n=5）

4 討論

CIRI 的病理是一個復雜的損傷級聯反應。當腦缺血缺氧后，腦組織能量代謝障礙、興奮性氨基酸毒性、氧化/硝化應激損傷、Ca2+超載、炎癥反應等一系列病理因素相互作用，形成惡性循環，損傷神經細胞和血腦屏障，加重腦水腫，導致腦組織不可逆性損傷[12-13]。 神經元是中樞神經系統的主要成分之一，CIRI 后可導致神經元損傷，引起神經功能障礙。因而，腦缺血后在盡快恢復腦血流的同時，減輕再灌注后神經元損傷、恢復神經功能對于缺血性腦損傷的治療具有重要意義。

尼氏體是分布在神經元除軸突和軸丘以外胞漿中的一種物質，是神經元胞體細胞質的特征結構[14]。當神經元變性死亡時，尼氏體可出現數量及位置的變化，甚至溶解，故尼氏體數量可作為神經元胞體損傷的指標[15]。NF-200 是成熟神經元特有的細胞骨架蛋白，是神經軸突的重要組成部分[16-17]。YU 等[18]研究表明，大鼠缺血區腦組織中NF-200 的表達在腦卒中急性期顯著降低。 故NF-200 可作為神經元軸突損傷的標志。αII-Spectrin 是神經元的一種重要的蛋白質成分，大量分布在軸突和突觸前終端[19]。在短暫性腦缺血、外傷性腦損傷時，Calpain-1 和Caspase-3 被激活，選擇性水解神經元的結構蛋白αII-Spectrin，使神經元的結構蛋白降解，細胞結構完整性受損，引起軸突運輸障礙，從而造成神經元損傷甚至死亡[20]。故αII-Spectrin 表達可以反映神經元的軸突和突觸損傷程度。 本研究表明，CIRI 后，大鼠出現明顯的神經功能障礙，AST Ⅳ+PNS、低劑量和高劑量組均能降低CIRI 后神經功能缺損評分；冰片、AST Ⅳ、PNS、AST Ⅳ+PNS、 低劑量和高劑量組均可增加尼氏體數量；冰片+AST Ⅳ+PNS 組可上調NF-200 蛋白表達，上調αII-Spectrin 表達。 提示冰片配伍AST Ⅳ和PNS 能減輕神經元胞體、樹突及軸突損傷，3 種藥物合用組的效應顯著強于各藥物單用組和AST Ⅳ+PNS 組，表明冰片與AST Ⅳ、PNS 配伍能減輕神經元損傷，改善CIRI 后的神經功能障礙。這可能與冰片能促進AST Ⅳ、PNS透過BBB 入腦，增強藥物抗CIRI 的效應有關。

綜上所述，冰片、AST Ⅳ、PNS 具有抗CIRI 后神經元損傷的作用，且冰片配伍AST Ⅳ+PNS 后，對腦缺血后具有比AST Ⅳ配伍PNS 更好的神經元保護作用，3 種藥物配伍的作用增強。目前冰片配伍AST Ⅳ和PNS 針對神經元細胞的保護作用探究只是一個初步的認識，而冰片配伍AST Ⅳ和PNS 增強抗缺血性腦損傷作用的確切機制及藥物的量效關系尚有待進一步闡明。