麻杏石甘湯對(duì)流感病毒感染小鼠肺組織CCL3、CCL25 表達(dá)水平的影響

趙 澄，吳 濤，盧芳國*，王 平，張香港，陳純靜，肖 榮，李 玲，魏 科，寧 毅

（湖南中醫(yī)藥大學(xué)，湖南 長沙410208）

流行性感冒（簡(jiǎn)稱流感）是由流感病毒經(jīng)呼吸道進(jìn)入機(jī)體而引起的急性傳染病，據(jù)世界衛(wèi)生組織估計(jì)，季節(jié)性流感每年可造成300～500 萬例嚴(yán)重病例，導(dǎo)致29～65 萬人死亡[1]。 由于抗原變異，新病毒株乃至新亞型不斷形成，使流感病毒反復(fù)多次突破人群過往免疫保護(hù)而引起流感中小型乃至世界性大流行。由于抗原變異，新的抗原決定簇不斷形成，普通疫苗預(yù)防效果受到影響。中醫(yī)藥防治流感歷史悠久，療效穩(wěn)定。不少中藥復(fù)方（如：銀翹散、麻杏石甘湯、升降散等）、中藥制劑（如：蓮花清溫膠囊毒、熱平注射液等）以及單味中藥（如：板藍(lán)根、金銀花等）在流感的防治中得到應(yīng)用[2-3]。團(tuán)隊(duì)前期研究發(fā)現(xiàn)，麻杏石甘湯不僅在體內(nèi)、體外對(duì)流感病毒增殖和宿主細(xì)胞凋亡有抑制作用，而且可以通過調(diào)節(jié)肺組織細(xì)胞因子（IFN-γ、IL-2、MCP-1 等）蛋白表達(dá)水平而改善流感肺炎模型肺組織病理損傷和超微結(jié)構(gòu)[4-6]。為進(jìn)一步探討麻杏石甘湯抗流感病毒的作用和效應(yīng)機(jī)制，本文研究與分析了該方對(duì)流感病毒感染小鼠肺組織趨化因子CCL3 和CCL25 表達(dá)水平的影響。

1 材料

1.1 動(dòng)物

SPF 級(jí)BLAB/c 小鼠100 只，體質(zhì)量(20±2) g，雌雄各半。購自湖南斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司，動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK(湘）2016-0002，實(shí)驗(yàn)單位使用許可證編號(hào)：SYXK（湘）2015-003。 實(shí)驗(yàn)過程中對(duì)小鼠的處理措施已通過湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院醫(yī)學(xué)創(chuàng)新實(shí)驗(yàn)中心動(dòng)物倫理委員會(huì)同意。

1.2 藥物

麻杏石甘湯的藥材由麻黃（去節(jié)）9 g、杏仁(去皮尖)9 g、生石膏（碎，棉裹）18 g、甘草（炙）6 g 組成，中藥飲片均購自湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院門診部。 磷酸奧司他韋膠囊（批號(hào)：M1036，意大利Roche S.p.A.生產(chǎn)，上海羅氏制藥有限公司分裝）；抗病毒口服液（批號(hào)：201705007，廣州香雪制藥股份有限公司）。

1.3 病毒株

A 型流感病毒小鼠肺適應(yīng)株（A/PR/8/34），湖南師范大學(xué)病毒研究室惠贈(zèng)，由湖南中醫(yī)藥大學(xué)病原生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室保存。經(jīng)10 日齡雞胚尿囊腔接種培養(yǎng)傳代，血凝效價(jià)1∶640 用于實(shí)驗(yàn)。

1.4 試劑

兔抗鼠CCL3 抗體（批號(hào)：51558-18，Abcam 公司）；山羊抗鼠CCL25 抗體（批號(hào)：ANO0212081，美國R&D Systems 公司）；β-actin 抗體（批號(hào)：0070175，美國Proteintech 公司）；驢抗兔熒光二抗（批號(hào)：GR324044-4，美國Abcam 公司）；兔抗山羊二抗（批號(hào)：SA00004-4，美 國Proteintech 公 司）；SDSPAGE 凝膠電泳試劑盒（批號(hào)：20410，康為世紀(jì)生物科技有限公司）；BCA 蛋白定量檢測(cè)試劑盒（康為世紀(jì)生物科技有限公司）。

1.5 主要儀器

PB1501-E 型電子分析天平（美國Mettler 公司）；5415R 型高速冷凍離心機(jī)（德國EPPendorf 公司）；ELx800 酶標(biāo)儀[美國伯騰儀器有限公司（BioTek）]；顯微鏡Motic-BA400（日本Olympus 公司）；電泳儀（美國BIO-RAD 公司）。

2 方法

2.1 模型制備與分組給藥

選用BLAB/c 小鼠100 只，適應(yīng)性喂養(yǎng)2 d后，根據(jù)完全隨機(jī)設(shè)計(jì)原則將小鼠分為正常對(duì)照組、模型對(duì)照組、奧司他韋組、抗病毒口服液組、麻杏石甘湯組，每組20 只。除正常對(duì)照組小鼠外，其余各組小鼠經(jīng)鼻腔接種50 個(gè)單位的LD50（50 LD50）流感病毒液0.05 mL 建立流感病毒感染模型[7]。 正常對(duì)照組小鼠按同樣方法接種0.9%生理鹽水0.05 mL。 以60 kg 成人每日服用藥物劑量與20 g小鼠體表面積換算比值進(jìn)行換算[8]，計(jì)算出各藥物組的臨床等效劑量為：奧司他韋21.50 mg/（kg·d）、抗病毒口服液4.33 mL/（kg·d）、麻杏石甘湯6.05 g/（kg·d）。各治療組于感染后24 h 開始灌胃給藥，正常對(duì)照組、模型對(duì)照組灌胃生理鹽水，每日灌胃1 次，持續(xù)灌胃給藥3 d 和7 d。

2.2 標(biāo)本采集與指標(biāo)檢測(cè)

2.2.1 體質(zhì)量、肺指數(shù) 分別于給藥3、7 d 后禁食、禁水8 h，按常規(guī)稱量小鼠體質(zhì)量，取肺臟稱重，計(jì)算肺指數(shù)。

肺指數(shù)（mg/g）=肺臟質(zhì)量（mg）/體質(zhì)量（g）

2.2.2 肺組織病理學(xué)變化 取小鼠肺組織，用4%多聚甲醛固定一周后，按常規(guī)步驟制備石蠟包埋切片，二甲苯脫蠟、乙醇梯度脫水后，蘇木精-伊紅（HE）染色，再常規(guī)脫水、透明、樹脂封片，于光學(xué)顯微鏡下觀察各組小鼠肺組織的病理學(xué)變化。

2.2.3 Western blot 法檢測(cè)肺組織CCL3、CCL25 的蛋白表達(dá) 取小鼠肺組織100 mg，用小號(hào)研磨缽以液氮將組織研磨成粉末狀，加入預(yù)冷的含PMSF的RIPA 裂解液500 μL，冰上裂解30 min 后，4 ℃，12 000 r/min，離心15 min，取上清，用BCA 蛋白試劑盒檢測(cè)蛋白濃度，加入5×上樣緩沖液,配平使各組蛋白濃度、體積一致，100 ℃水浴10 min；置于5%電泳濃縮膠濃縮，10%蛋白電泳分離膠分離，再經(jīng)轉(zhuǎn)膜，5%脫脂奶粉封閉1 h；加入CCL3 一抗(1∶2 000)、CCL25 一抗(1∶2 000)、β-actin（1∶10 000），4 ℃孵育過夜；TBS-T 漂洗10 min×3 次， 室溫避光孵育熒光二抗（1∶1 000）2 h，TBS-T 漂洗10 min×3 次；顯影。使用Image-Pro plus 6.0 圖像分析軟件測(cè)量各蛋白條帶的灰度值，以β-actin 蛋白灰度值作為內(nèi)參，計(jì)算CCL3和CCL25/β-actin 蛋白的相對(duì)灰度值表示結(jié)果。

2.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

將收集的資料錄入SPSS 21.0 統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件分析，計(jì)量資料以“±s”表示，采用單因素方差分析。方差齊時(shí)，組間兩兩比較采用LSD 檢驗(yàn)；方差不齊時(shí)，采用Dunnett’s T3 檢驗(yàn)。 P＜0.05 表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 麻杏石甘湯對(duì)流感病毒感染小鼠體質(zhì)量、肺指數(shù)的影響

給藥治療3、7 d 后，與正常對(duì)照組比較，模型對(duì)照組體質(zhì)量顯著降低（P＜0.01）、肺指數(shù)顯著升高（P＜0.01）；與模型對(duì)照組比較，各藥物治療組小鼠體質(zhì)量均顯著升高（P＜0.01）、肺指數(shù)均顯著降低（P＜0.05或P＜0.01）。給藥治療3 d 后，與奧司他韋組比較，麻杏石甘湯組小鼠體質(zhì)量顯著降低（P＜0.05）；與抗病毒口服液組比較，麻杏石甘湯組小鼠體質(zhì)量顯著升高（P＜0.05）；各藥物治療組間小鼠肺指數(shù)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。 給藥治療7 d 后，各藥物治療組間小鼠體質(zhì)量、肺指數(shù)無顯著差異（P＞0.05）。見表1。

3.2 麻杏石甘湯對(duì)流感病毒感染小鼠肺組織病理學(xué)變化的影響

正常對(duì)照組小鼠肺泡、肺泡隔形態(tài)、結(jié)構(gòu)完整。模型對(duì)照組小鼠出現(xiàn)明顯肺組織病理變化，表現(xiàn)為肺組織充血水腫，大量淋巴細(xì)胞及巨噬細(xì)胞浸潤、并出現(xiàn)大面積壞死實(shí)變。與模型對(duì)照組比較，給藥治療3、7 d 的各藥物組小鼠肺組織病理損傷都得到明顯改善，充血水腫減輕，炎性細(xì)胞浸潤減少，壞死實(shí)變面積減少。以奧司他韋組改善最明顯，抗病毒口服液組和麻杏石甘湯組肺泡輪廓較清晰，肺泡壁增厚，可見少量炎性細(xì)胞浸潤。 見圖1。

表1 麻杏石甘湯對(duì)流感病毒感染小鼠體質(zhì)量、肺指數(shù)的影響（±s，n=8）

表1 麻杏石甘湯對(duì)流感病毒感染小鼠體質(zhì)量、肺指數(shù)的影響（±s，n=8）

注：與正常對(duì)照組比較，**P＜0.01；與模型對(duì)照組比較，△P＜0.05，△△P＜0.01；與奧司他韋組比較，▲P＜0.05；與抗病毒口服液組比較，□P＜0.05

組別 感染前體質(zhì)量/g正常對(duì)照組模型對(duì)照組奧司他韋組抗病毒口服液組麻杏石甘湯組F 值P 值20.77±0.25 20.22±0.22 20.77±0.16 20.63±0.23 20.66±0.12 1.442 0.225給藥3 d體質(zhì)量/g 肺指數(shù)27.12±1.14 17.90±1.30**26.10±0.71△△22.44±1.65△△23.83±1.64△△▲□58.825 0.000 6.69±0.47 18.31±6.84**9.40±3.15△△13.20±2.84△10.62±3.76△△11.664 0.000給藥7 d體質(zhì)量/g 肺指數(shù)30.71±1.35 19.33±0.69**28.54±1.25△△28.05±0.68△△28.36±1.06△△142.365 0.000 6.53±0.29 9.79±1.79**6.64±0.76△△7.87±1.24△7.83±1.12△9.738 0.000

圖1 各組小鼠肺組織病理觀察（HE，×200）

3.3 麻杏石甘湯對(duì)流感病毒感染小鼠肺組織CCL3、CCL25 蛋白表達(dá)水平的影響

給藥治療3 d 后，與正常對(duì)照組比較，模型對(duì)照組小鼠肺組織CCL3 蛋白表達(dá)水平顯著升高（P＜0.01）；與模型對(duì)照組比較，各藥物治療組小鼠肺組織CCL3 蛋白表達(dá)水平均顯著降低（P＜0.05 或P＜0.01）；與奧司他韋組比較，麻杏石甘湯組小鼠肺組織CCL3 蛋白表達(dá)水平顯著降低（P＜0.05）；與抗病毒口服液組比較，麻杏石甘湯組小鼠肺組織CCL3 蛋白表達(dá)水平顯著降低（P＜0.01）。給藥治療7 d 后，各組間小鼠肺組織CCL3 蛋白表達(dá)水平差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。 見圖2。

圖2 各組小鼠肺組織CCL3 蛋白表達(dá)水平

給藥治療3 d 后，與正常對(duì)照組比較，模型對(duì)照組小鼠肺組織CCL25 蛋白表達(dá)水平顯著升高（P＜0.01）；與模型對(duì)照組比較，各藥物治療組小鼠肺組織CCL25 蛋白表達(dá)水平均顯著降低（P＜0.01）；與奧司他韋組比較，麻杏石甘湯組小鼠肺組織CCL25 蛋白表達(dá)水平顯著升高（P＜0.05）；與抗病毒口服液組比較，麻杏石甘湯組小鼠肺組織CCL25 蛋白表達(dá)水平差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。 給藥治療7 d 后，各組間小鼠肺組織CCL25 蛋白表達(dá)水平差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。 見圖3。

圖3 各組小鼠肺組織CCL25 蛋白表達(dá)水平

4 討論

流行性感冒是由流感病毒引起的傳染性疾病，臨床表現(xiàn)有輕重之分，輕癥表現(xiàn)為突然起病，畏寒高熱，伴頭痛、全身肌肉關(guān)節(jié)酸痛、乏力、食欲減退等全身癥狀，多在一周內(nèi)自愈；重癥患者會(huì)出現(xiàn)高熱持續(xù)不退、呼吸急促、休克及彌漫性血管內(nèi)凝血等嚴(yán)重癥狀[9]。這些癥狀的出現(xiàn)可能與“細(xì)胞因子風(fēng)暴”所導(dǎo)致的免疫病理損傷相關(guān)。 流感病毒經(jīng)呼吸道進(jìn)入機(jī)體后， 能促進(jìn)肺巨噬細(xì)胞分泌大量趨化因子 （如：CCL3、CCL25、CXCL-10 等）和炎癥因子（如：IL-1、IL-6、TNF-α 等），進(jìn)而導(dǎo)致肺部免疫病理損傷[10]。如H1N1 流感病毒肺部感染模型肺組織的病理損傷程度與肺泡灌洗液中CXCL-10 的含量水平呈正相關(guān)[11]。CCL3 又稱巨噬細(xì)胞炎性蛋白1-α，可以募集巨噬細(xì)胞、單核細(xì)胞和中性粒細(xì)胞等炎性細(xì)胞到感染部位[12]，CCL25 為胸腺表達(dá)趨化因子，對(duì)胸腺細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和樹突狀細(xì)胞等有趨化作用[13]。本研究發(fā)現(xiàn)：流感病毒感染模型小鼠體質(zhì)量下降、肺指數(shù)增加，并伴有肺組織充血水腫、壞死實(shí)變和大量炎性細(xì)胞浸潤。 蛋白免疫印跡法結(jié)果發(fā)現(xiàn)模型組小鼠肺組織趨化因子CCL3、CCL25 的表達(dá)水平顯著高于正常對(duì)照組。說明過量表達(dá)與分泌的CCL3、CCL25 在流感病毒所導(dǎo)致的肺組織免疫病理損傷中扮演著重要的角色。

麻杏石甘湯源自東漢醫(yī)圣張仲景的《傷寒論》，主治肺熱火盛的肺炎和熱邪犯肺的哮喘[14]。 研究表明：該方不僅具有鎮(zhèn)咳、祛痰、平喘、解熱之功效，還有抗菌、消炎、抗病毒等作用，目前已廣泛用于病毒性肺炎、病毒性腦炎、支氣管炎、扁桃體炎、肺腦病、肺心病等多種疾病治療，特別是2003 年以來該方在季節(jié)性流感、甲型H1N1 流感、人禽流感、非典和新冠肺炎防治的臨床應(yīng)用中受到高度重視[15-16]。國家衛(wèi)生健康委員會(huì)發(fā)布的《人感染H7N9 禽流感診療方案（2014 年版）》《流行性感冒診療方案（2018年版修訂版）》和《流行性感冒診療方案（2019 年版）》中的中醫(yī)診療方案均已將該方作為基礎(chǔ)方用于流感熱毒襲肺證的辨證治療[17-19]。該方防治流感及其相關(guān)病證的臨床療效機(jī)制與其影響流感病毒增殖、細(xì)胞因子表達(dá)和分泌水平密切相關(guān)。本研究發(fā)現(xiàn)：麻杏石甘湯能顯著抑制流感病毒感染所致小鼠體質(zhì)量下降和肺指數(shù)增加，減輕小鼠肺組織炎性細(xì)胞浸潤，下調(diào)流感病毒感染模型小鼠肺組織趨化因子CCL3、CCL25 蛋白的表達(dá)水平。 說明該方可能是通過下調(diào)趨化因子CCL3、CCL25 的表達(dá)水平，減輕流感病毒所導(dǎo)致的免疫病理損傷，而實(shí)現(xiàn)抗流感病毒的作用。麻杏石甘湯具有調(diào)節(jié)趨化因子表達(dá)的作用，但作為中藥復(fù)方，其有效成分復(fù)雜，靶點(diǎn)尚不明確，其抗流感病毒的物質(zhì)基礎(chǔ)和免疫學(xué)機(jī)制需進(jìn)一步研究。