石榴皮多酚乳膏對金黃地鼠皮脂腺斑組織中AMPK/ACC-1 信號通路的影響

魏 露，朱明芳*，吳淑輝，劉 娟，張 曦

（湖南中醫藥大學第二附屬醫院，湖南 長沙410005）

痤瘡是一種累及毛囊皮脂腺的慢性炎癥性皮膚病。痤瘡嚴重影響容貌，且好發于青少年，此階段患者心理較為敏感，痤瘡極易對患者的社交、心理健康等造成影響。多因素介導痤瘡的發生發展，痤瘡丙酸桿菌定植、雄激素誘導的皮脂分泌過多、毛囊角化過度、炎癥免疫反應、壓力、飲食、遺傳等參與痤瘡進程[1]。皮脂是皮脂腺分泌的復雜混合物，研究表明皮脂成分、含量、代謝紊亂等引起的皮脂穩態失衡是痤瘡的主要發病機制之一[2]。深入研究導致皮脂穩態失衡的分子機制可為痤瘡的防治提供思路。腺苷酸活化蛋白激酶(AMP-activated protein kinase,AMPK)是一種絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，廣泛分布于肝臟、脂肪、骨骼肌等組織中，可調控多種細胞的脂質代謝[3-4]。乙酰輔酶A 羧化酶（acetyl-COA carboxylase,ACC）是脂肪酸合成的第一個限速酶，具有ACC-1和ACC-2 兩種亞型。ACC-1 是AMPK 的特征性靶點，活化的AMPK 可降低ACC-1 mRNA 的表達，進而調節脂質穩態[5]。隨著研究的深入，代謝綜合征與痤瘡、銀屑病等皮膚科疾病的相關性逐漸得到認可[6-7]。研究表明，AMPK/ACC-1 信號通路參與肥胖、高脂血癥、糖尿病等代謝性疾病的發展，但其介導的脂質代謝是否參與痤瘡發展尚不明確[8-9]。

象思維及取象比類法在皮膚病的診療中應用極為廣泛，于皮損描述、病癥命名、病因病機、辨證及治法方藥上均有體現。“以皮治皮”是國家級名老中醫歐陽恒教授根據中醫取象比類法和中藥藥象學原理創造性地提出的直觀論治五法之一。朱明芳教授跟師歐陽恒教授10 余年，基于“以皮治皮”思想，選用皮類中藥石榴皮治療痤瘡屢獲佳效[10-11]。本課題組前期研究表明石榴皮多酚具有抗炎、抗角化、抗痤瘡增生性瘢痕形成的作用[12-13]。 金黃地鼠側腹部皮脂腺斑是雄激素依賴性器官，其內包含有毛囊及皮脂腺等，其生物學特征與人相似，是國內外學者公認的篩選和研究藥物抗雄激素及皮脂腺增生活性的動物模型[14-15]。

1 材料

1.1 實驗動物

SPF 級雄性金黃地鼠24 只，體質量110～130 g，購自北京維通利華實驗動物技術有限公司，許可證號：SCXK（京）2016-0011，實驗場所由中南大學實驗動物學部提供，室內溫度21～23 ℃，濕度52%～60%，通風，分籠飼養，飼料及水均由中南大學實驗動物學部提供，待適應性飼養1 周后用于實驗。

1.2 藥物和試劑

70%石榴皮多酚提取物（批號：RY151119，西安瑞盈生物科技有限公司）制成石榴皮多酚乳膏，其制作方法及步驟參考課題組的前期研究[8]。10%水合氯醛（分析純，上海山浦化工有限公司）；蘇木素-伊紅染色液（廣州維格斯生物科技有限公司）；中性樹膠(中國上海標本模型廠)；二甲苯（湖南匯虹試劑有限公司）；0.025%維A 酸乳膏（15 g/支，重慶華邦制藥有限公司）；AMPK 兔單克隆抗體（美國Abcam 公司，批號：ab32047），ACC-1 多克隆抗體（美國Proteintech公司，批號：21923-1-AP）。

1.3 主要儀器

生物組織攤烤片機（武漢俊杰電子有限公司）；RM2235 輪轉石蠟切片機（徠卡顯微系統（上海）貿易有限公司）；Motic BA410 研究型顯微鏡；Motic 6.0 數碼醫學圖像分析系統（麥克奧迪（廈門）醫療診斷系統有限公司）。

2 方法

2.1 動物分組及給藥

按隨機數字表將受試動物分為4 組，即空白組、基質組、石榴皮多酚乳膏組、陽性對照組，根據人體表面積換算[16]，分別于各組動物雙側皮脂腺斑處涂抹蒸餾水、乳膏基質、石榴皮多酚乳膏[0.32 g/(kg·d)，相當于等效劑量的2 倍]、0.025%維A 酸乳膏[5.24 g/(kg·d)，相當于等效劑量]，2 次/d，連續用藥4 周。

2.2 皮脂腺斑大小測量

首次給藥前及末次給藥24 h 后，用剃須刀剔除金黃地鼠雙側側腹部毛發，使皮脂腺斑充分暴露，于強光照射下，用游標卡尺測量并記錄皮脂腺斑的最大橫徑（DT）、最大縱徑（DL）。

皮脂腺面積=DT（mm）×DL（mm）

2.3 組織病理學

末次給藥24 h 后，剪下各組金黃地鼠左側一半皮脂腺斑組織，經4%多聚甲醛固定后，經石蠟包埋、切片、HE 染色后于顯微鏡下觀察。

2.4 免疫組化檢測

剪下各組金黃地鼠左側另一半皮脂腺斑，經石蠟包埋，制成4 μm 切片，經二甲苯脫蠟和無水乙醇水化，PBS 洗兩次，3% H2O2室溫封閉10 min，蒸餾水洗3 次后進行抗原修復；滴加正常山羊血清封閉液，室溫20 min，后滴加一抗；室溫放置1 h；PBS沖洗3次后滴加生物素化二抗，37 ℃孵育20 min，PBS 沖洗3 次；滴加試劑SABC，37 ℃孵育20 min；PBS 沖洗4次；DAB 顯色，蒸餾水沖洗；蘇木素復染2 min，鹽酸乙醇分化、脫水、透明、封片、鏡檢。在顯微鏡低倍鏡下(10×10)對皮脂腺組織進行定位，然后再在高倍鏡下(10×40)觀察陽性細胞的形態和分布，采用Motic 6.0 數碼醫學圖像分析系統對觀測圖像進行分析，隨機選擇5 個視野測定蛋白平均積分光密度值，作為蛋白的表達量。

2.5 統計學處理

3 結果

3.1 各組皮脂腺斑面積比較

給藥前，空白組、基質組、石榴皮多酚乳膏組、陽性對照組4 組皮脂腺斑大小差異無統計學意義，具有可比性。給藥后，與空白組相比，基質組同側皮脂腺斑面積無明顯變化，差異無統計學意義（P＞0.05）；陽性對照組和石榴皮多酚乳膏組的同側皮脂腺斑面積均有明顯縮小，差異有統計學意義（P＜0.05）。與陽性對照組相比，石榴皮多酚乳膏組左側皮脂腺斑的面積有縮小，差異有統計學意義（P＜0.05）。詳見表1。

表1 治療前后各組金黃地鼠雙側皮脂腺斑面積的比較（±s，n=6，mm2）

表1 治療前后各組金黃地鼠雙側皮脂腺斑面積的比較（±s，n=6，mm2）

注：與空白組比較，*P＜0.05；與陽性對照組比較，△P＜0.05

組別給藥前左側 右側給藥后左側 右側空白組基質組石榴皮多酚乳膏組陽性對照組F 值P 值37.97±2.52 38.23±2.76 37.54±3.01 38.54±2.24 0.152 0.927 37.81±4.55 39.78±3.76 38.05±5.32 39.75±5.00 0.308 0.820 51.90±1.63 52.04±1.74 47.56±1.05*△49.73±2.27*9.021 0.001 51.58±2.68 51.63±2.56 47.95±1.30*48.71±2.18*4.353 0.016

3.2 各組組織病理學觀察

空白組：金黃地鼠皮脂腺呈分葉狀分布，腺體飽滿，數量多，排列緊密而厚；基質組：部分皮脂腺較大，排列較緊較厚；陽性對照組：皮脂腺腺厚度較空白組變薄，腺體體積變小，排列疏松；石榴皮多酚乳膏組：皮脂腺腺體萎縮，數量少，排列較陽性對照組松散，腺體變小且數目減少。 見圖1。

圖1 各組金黃地鼠皮脂腺斑組織病理學觀察（HE 染色，×100）

3.3 各組皮脂腺斑組織中AMPK、ACC-1 的蛋白表達情況

免疫組化顯示，與空白組相比，基質組AMPK、ACC-1 的表達無明顯差異，差異無統計學意義（P＞0.05）；與空白組相比，陽性對照組、石榴皮多酚乳膏組皮脂腺斑AMPK 均有不同程度升高，差異有統計學意義（P＜0.05），ACC-1 表達有不同程度降低，差異有統計學意義（P＜0.05）；與陽性對照組相比，石榴皮多酚乳膏組ACC-1 表達降低，差異有統計學意義（P＜0.05）。 見表2 和圖2。

表2 各組金黃地鼠皮脂腺斑AMPK、ACC-1 表達情況的積分光密度比較（±s，n=6）

表2 各組金黃地鼠皮脂腺斑AMPK、ACC-1 表達情況的積分光密度比較（±s，n=6）

注：與空白組比較，*P＜0.05；與陽性對照組比較，△P＜0.05

組別空白組基質組石榴皮多酚乳膏組陽性對照組F 值P 值AMPK 0.36±0.02 0.37±0.03 0.43±0.05*0.42±0.06*3.806 0.026 ACC-1 0.44±0.25 0.45±0.02 0.39±0.02*△0.42±0.02*10.262＜0.001

圖2 AMPK、ACC-1 在皮脂腺細胞中的表達（免疫組化，×400）

4 討論

痤瘡對患者生命安全雖無較大影響，但嚴重影響患者生活質量。 流行病學調查顯示，美國每年的痤瘡醫療投入高達30 億美元[17]。 因此，積極尋找有效的防治措施是皮膚科同道共同的努力方向。 研究表明，皮脂穩態失衡可誘導并加重痤瘡[18-19]。 高糖、高乳蛋白等西方飲食習慣可誘導胰島素抵抗，促使皮脂腺細胞增殖分化，引起皮脂成分及含量的變化，導致痤瘡發生。根據脂質代謝穩態失衡這一相同的致病機制，代謝綜合征與痤瘡的相關性逐漸得到研究者們的關注。盡早地對痤瘡患者進行健康教育，或許可以降低其未來發生代謝綜合征的風險。

低密度脂蛋白受體相關蛋白1(low density lipoprotein receptor-related protein 1, LRP1)在脂質代謝和葡萄糖穩態中發揮關鍵作用。 研究顯示，LRP1依賴心鈉素軸調控肝臟AMPK/ACC 信號通路及能量代謝，缺乏LRP1 將導致胰島素抵抗和肥胖[20]。PARK M 等[21]發現蓮心堿在3T3-L1 細胞分化過程中通過激活AMPK/ACC 信號通路，降低脂質合成，促進脂質代謝，因此，蓮心堿被認為是治療肥胖的候選藥物。GUO S 等[22]利用當歸提取物藁本內脂干預糖尿病模型大鼠，發現其通過激活AMPK、下調ACC 等降低肥胖指數、改善胰島素抵抗、減少脂質積累及肝腎組織病理損傷。同時有研究表明[23]，表沒食子兒茶素沒食子酸酯通過激活SEB-1 皮脂腺細胞中的AMPK，進而降低固醇調節元件結合蛋白-1（sterol regulatory element-binding protein-1,SREBP-1）的表達和脂肪生成治療痤瘡。 JIN S 等[24]的研究表明，在皮脂細胞中，大麻籽正己烷提取物通過激活胰島素樣生長因子-1 誘導的AMPK，抑制SREBP1、ACC 和脂肪酸合成酶表達，抑制脂質生成及炎癥反應，進而治療尋常痤瘡。同時，AMPK 參與環境污染物二噁英誘導的氯痤瘡。MUKU GE 等[25]發現芳香烴受體調節劑通過激活SEB-1 皮脂腺細胞AMPK的表達，抑制SRBEP-1水平，調控皮脂穩態。

國家級名老中醫歐陽恒教授根據多年行醫經驗，在中醫取象比類法和中藥藥象學原理的理論指導下，結合皮膚病的特點，創造性地提出了“以色制色、以皮治皮、以形治形、以毒攻毒、寓搔止瘙”的直觀論治五法。 其中，“以皮治皮”法是指以藥材皮部入藥以治療某些皮膚病的方法。 石榴皮性味酸、澀、溫，歸大腸經，臨床上多取其收澀之功。大腸與肺相表里，肺主皮毛，一方面，大腸與皮膚之間通過肺臟間接聯系，相互感傳。另一方面，《靈樞·本臟》指出：“皮厚者，大腸厚；皮薄者，大腸薄；皮緩，腹裹大者，大腸緩而長；皮急者，大腸急而短；皮滑者，大腸直；皮肉不相離者，大腸結”。 朱明芳教授在歐老“以皮治皮”理論的指導下，結合“肺與大腸相表里”通腑益膚之理，選用光滑厚澤的石榴皮治療痤瘡，取得了良好的社會效益。

本研究以AMPK/ACC-1 信號通路介導的脂質代謝為切入點，通過檢測AMPK、ACC-1 表達水平，探討石榴皮多酚基于AMPK/ACC-1 信號通路抗皮脂腺增生、調控皮脂穩態，進而治療痤瘡的作用。金黃地鼠皮脂腺斑面積給藥前后比較顯示，相較于空白組，石榴皮多酚乳膏組皮脂腺斑面積明顯減小。 組織病理學結果表明，石榴皮多酚乳膏能使金黃地鼠皮脂腺斑腺葉萎縮、數量減少、排列疏松，說明石榴皮多酚能夠抗皮脂腺斑增生；免疫組化結果提示，石榴皮多酚能夠上調皮脂腺組織中AMPK 表達水平、同時抑制ACC-1 的表達。因此推測，石榴皮多酚乳膏可能通過激活AMPK/ACC-1信號通路、抗皮脂腺增生、調控皮脂穩態以達到防治痤瘡的作用。本研究目前處于初步探索階段，未來將結合脂質組學對模型皮脂成分及含量的中藥干預進一步深入探討。