基于1H-NMR 研究齊刺法對(duì)急性胃黏膜損傷小鼠代謝的影響

韓 嚴(yán)，楊宗保，程燕彬，陳寶華，黃婉儀，王 超*

（1.湖南中醫(yī)藥大學(xué)針灸推拿學(xué)院，湖南 長(zhǎng)沙410208；2.廈門(mén)大學(xué)醫(yī)學(xué)院中醫(yī)系，福建 廈門(mén)361005；3.福建中醫(yī)藥大學(xué)針灸學(xué)院，福建 福州350000）

胃黏膜損傷與多種疾病相關(guān)，根據(jù)其臨床表現(xiàn)，中醫(yī)學(xué)多認(rèn)為與“胃脘痛”“嘔吐”等相關(guān)，是消化系統(tǒng)常見(jiàn)病，進(jìn)一步發(fā)展可導(dǎo)致胃黏膜潰瘍、壞死和腺體萎縮、穿孔、癌變等惡性病變，更是多種嚴(yán)重胃腸疾病的始動(dòng)病理環(huán)節(jié)[1]。胃黏膜損傷具有高發(fā)病率、高復(fù)發(fā)率等特點(diǎn)，是臨床的棘手問(wèn)題，而且在損傷后局部或者整體出現(xiàn)氨基酸、糖和脂質(zhì)等代謝紊亂，甚至衍生出其他臟腑疾病，例如肝膽炎癥。近些年，電針治療胃黏膜損傷[2]相關(guān)報(bào)道較多。研究表明[3]中醫(yī)電針胃經(jīng)穴對(duì)胃運(yùn)動(dòng)、胃相關(guān)外周神經(jīng)、胃分泌等皆能起到顯著調(diào)節(jié)恢復(fù)作用。齊刺法是一種傳統(tǒng)的針刺手法，其操作特點(diǎn)是：病變部位的正中直刺一針，再在其左右（上下）各斜刺（直刺）一針。由于三針齊下，故名為齊刺，又叫做三刺。它具有增強(qiáng)疏通經(jīng)絡(luò)、行氣止痛的功效，對(duì)于急性病癥具有加強(qiáng)治療作用的效果。

代謝組學(xué)是針對(duì)生物或細(xì)胞所有代謝物進(jìn)行定量和定性分析的學(xué)科，它從機(jī)體的整體代謝狀態(tài)觀察生物體生理和病理代謝產(chǎn)物的變化[4]，與中醫(yī)學(xué)整體觀念相契合，是一種新興的代謝檢測(cè)技術(shù)手段。代謝組學(xué)研究方法種類很多，常用的包括氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)（GC/MS）、液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)（LC/MS）、核磁共振（NMR）[5]技術(shù)，其中NMR 技術(shù)是通過(guò)將液態(tài)生物樣品置于高磁場(chǎng)環(huán)境中，獲得代謝物的峰，通過(guò)分析峰歸屬以及峰值可確定代謝物的種類與含量[6]，是研究代謝組學(xué)最常見(jiàn)的分析工具。

足三里為足陽(yáng)明經(jīng)的下合穴，且足陽(yáng)明經(jīng)是后天之本，氣血生化之源，多氣多血，與胃腑關(guān)系密切。三陰交為足太陰、足少陰、足厥陰經(jīng)交會(huì)穴，為臨床常用穴。足太陰脾經(jīng)與足陽(yáng)明胃經(jīng)互為表里經(jīng)，燥濕相濟(jì)，升降相因，在功能上相輔相成。本論文研究齊刺足三里穴對(duì)急性胃黏膜損傷小鼠的代謝影響及促進(jìn)胃黏膜損傷修復(fù)的分子機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

SPF 級(jí)雄性KM 小鼠24 只，鼠齡6～8 周，體質(zhì)量18～22 g 購(gòu)自吳氏實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物合格證號(hào)：SCXK(京)2014-0004。在廈門(mén)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心適應(yīng)性飼養(yǎng)1 周后進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，飼養(yǎng)室溫度（20±2） ℃，相對(duì)濕度（65±5）%，自然光暗周期。整個(gè)實(shí)驗(yàn)過(guò)程獲得廈門(mén)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)的批準(zhǔn)，并且符合國(guó)家科技部發(fā)布的《關(guān)于善待實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的指導(dǎo)性意見(jiàn)》[7]操作規(guī)范。

1.2 分組與處理

按照隨機(jī)數(shù)字表法將24 只小鼠分為正常組、模型組、足三里組、三陰交組，每組6 只。 適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后，進(jìn)行造模。造模成功后，足三里組和三陰交組用鼠板固定并分別電針（4 Hz，50 Hz）足三里穴和三陰交穴，穴位定位參考實(shí)驗(yàn)針灸學(xué)和模擬人體經(jīng)絡(luò)穴位的動(dòng)物穴位定位法[8]。使用漢醫(yī)牌一次性無(wú)菌針灸針（0.18 mm×13 mm）行齊刺法，深度約為5 mm，連接電針治療儀，兩組極線分別接一側(cè)的足三里穴或三陰交穴。采用疏密波（疏波時(shí)間5 s，密波時(shí)間10 s，負(fù)載電壓2～4 V，脈沖寬度0.5 ms，疏波4 Hz，密波50 Hz），強(qiáng)度以毫針針體出現(xiàn)輕微震顫為度，電針時(shí)間30 min。正常組和模型組用鼠板固定30 min。所有干預(yù)每日1 次，共7 d。

1.3 造模方法

采用國(guó)際公認(rèn)的束縛-冷浸法[9]建立急性胃黏膜損傷模型。 造模前將小鼠禁食不禁水24 h，然后固定在鼠板浸入水箱中，水位浸沒(méi)劍突位，水箱溫度保持在20 ℃，10 h 后解除束縛冷浸。預(yù)實(shí)驗(yàn)小鼠予以斷頭處死，摘出全胃，沿胃底剪開(kāi)暴露胃腔，肉眼明顯可見(jiàn)黏膜潮紅色充血、多處斑點(diǎn)狀糜爛，光鏡下可見(jiàn)黏膜缺損、炎性細(xì)胞浸潤(rùn)、上皮細(xì)胞脫落，則說(shuō)明模型復(fù)制成功[10]。

1.4 樣本采集與處理

標(biāo)本采集之前，各組小鼠均禁食不禁水24 h，之后予以10%水合氯醛（0.3 mL/100 g）腹腔注射麻醉，置于冰層上，迅速剖開(kāi)腹腔，取出全胃，沿胃大彎剪開(kāi)，使用0.9%生理鹽水清洗，于冰層上平鋪展開(kāi)，以片狀斑點(diǎn)糜爛為中心剪出2 cm×2 cm 組織塊，放入4%多聚甲醛中固定24 h。剩余胃體分別快速投放液氮桶中，之后一并移入－80 ℃冰箱保存。

1.5 觀察指標(biāo)與方法

1.5.1 光鏡觀察胃黏膜 于－80 ℃冰箱中取出2 cm×2 cm 組織塊并在－20 ℃冰箱中解凍，之后置于冰層上將其修剪為1 cm×0.5 cm 大小，常規(guī)石蠟包埋、切片、烘干，依次經(jīng)過(guò)二甲苯、梯度酒精、伊紅、蘇木精染色并清洗多余染料，均勻涂抹中性樹(shù)膠，覆以蓋玻片，于光鏡下查看。

1.5.2 代謝組學(xué)檢測(cè)胃黏膜組織 于－80 ℃冰箱中取出組織塊并在-20 ℃冰箱中解凍，之后置于冰層上，電子天平稱取（100±10） mg 組織放入1.5 mL 無(wú)菌微量離心管（EP 管）中，充分剪碎后加入300 mL雙蒸水（ddH2O）和600 mL 甲醇，渦旋混合30 s，勻漿器將組織塊均碎，隨后加入300 mL 氯仿，渦旋30 s，超聲5 min，離心（15 min，1 3000 r/min，4 ℃），取上清液650 μL 移入1.5 mL 新的EP 管中，全程均在碎冰層中操作。之后于氮吹儀中濃縮完全干燥加入內(nèi)含0.015%總懸浮顆粒（TSP）的重水（D2O）溶液600 μL，避免晃動(dòng)，取500 μL 溶液移至干燥的5 mm NMR 管中，蓋好橡膠圈，送至Bruker 600 MHz 光譜儀，采用Carr-Purcell-Meiboom-Gill（CPMG）脈沖序列；具體掃描參數(shù)設(shè)置為：譜寬12.019 kHz，弛豫時(shí)間320 ms，掃描次數(shù)64 次，F(xiàn)id 轉(zhuǎn)換LB＝0.3 Hz，PW＝30 ℃（12.7 μs），RD＝1.0 s。所有代謝物均按照人類代謝組數(shù)據(jù)庫(kù)（http：//www.hmdb.ca/）查找。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

通過(guò)MestReNova V9.0.1軟件（Mestrelab Research,Santiago de Compostella,西班牙）對(duì)組織樣品所有核磁共振氫譜技術(shù)（1H-NMR）譜圖進(jìn)行基線矯正和相位調(diào)整。以0.0 ppm 處的TSP 單峰作為參考，隨后對(duì)所有譜圖進(jìn)行峰對(duì)齊，移除δ 4.67～4.95 ppm 段以排除水的影響，譜圖以0.01 ppm 的步長(zhǎng)在δ 0.76～8.99 ppm 的區(qū)域內(nèi)進(jìn)行積分，并將每個(gè)譜的積分值進(jìn)行歸一化，然后將歸一化數(shù)據(jù)導(dǎo)入SIMCA-P 14.1軟件中進(jìn)行多元統(tǒng)計(jì)分析。先用主成分分析（PCA）對(duì)所有組別進(jìn)行直觀的組間分離，然后用正交偏最小二判別分析（OPLS-DA）最大化組間差異。同時(shí)，OPLS-DA 模型通過(guò)模型適應(yīng)性（R2）和預(yù)測(cè)能力（Q2）的參數(shù)來(lái)評(píng)估，并使用S-plot 圖分析潛在的變量。最后，根據(jù)樣本OPLS-DA 模型變量的重要性（VIP≥1）以及t 檢驗(yàn)（P＜0.05）獲取潛在的生物標(biāo)志物。

2 結(jié)果

2.1 小鼠胃黏膜組織病理學(xué)觀察

正常組小鼠胃黏膜上皮完整，上皮細(xì)胞排列整齊，腺體排列緊密，形狀大小正常，未見(jiàn)潰瘍性損害(圖1-C)。 模型組小鼠胃黏膜出現(xiàn)明顯潰瘍?cè)睿つぜ?xì)胞稀疏甚至出現(xiàn)空洞，大量細(xì)胞壞死、脫落，腺體排列紊亂，大部分腺體結(jié)構(gòu)被破壞，其間有大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，組織間存在明顯充血與水腫(圖1-M)。足三里組小鼠胃黏膜結(jié)構(gòu)明顯改善，腺體結(jié)構(gòu)清晰，排列整齊，組織間仍有少量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，無(wú)明顯充血及水腫(圖1-Z)。 三陰交組小鼠胃黏膜結(jié)構(gòu)略有改善，但仍有部分胃黏膜脫落，腺體結(jié)構(gòu)排列紊亂，其間仍可見(jiàn)炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，組織充血及水腫（圖1-S）。

2.2 胃組織代謝物表達(dá)

2.2.1 胃組織1H-NMR 譜圖表達(dá) 胃組織典型1HNMR 譜圖如圖2 所示。譜圖中的主要代謝物是根據(jù)人類代謝組學(xué)數(shù)據(jù)庫(kù)（HMDB：http：//www.hmdb.ca/）、已經(jīng)發(fā)表的文獻(xiàn)以及本課題組前期所積累的數(shù)據(jù)庫(kù)所確定的，共鑒定出17 種主要標(biāo)志代謝物。見(jiàn)表1。

2.2.2 胃組織代謝輪廓分析 由于1H-NMR 譜圖的復(fù)雜性，肉眼觀察各組之間差異并不明顯，因此，為了對(duì)各組數(shù)據(jù)的差異做出更好評(píng)估，使用OPLSDA 對(duì)各組數(shù)據(jù)進(jìn)行聚類分析，用來(lái)尋找正常組與模型組、模型組與足三里組、足三里組與三陰交組之間可能存在的變量。在胃組織的代謝樣本中，可以直觀地看出各組之間具有明顯的離散，如圖3-A所示，其中模型組與正常組分散比較明顯，在圖3-B和圖3-D 中兩組之間分離程度明顯，在圖3-C 中模型組與三陰交組并未表現(xiàn)出明顯分離。

圖1 小鼠胃黏膜病理組織情況（HE 染色）

圖2 小鼠胃黏膜17 個(gè)代謝物1H-NMR 譜圖

表1 小鼠胃組織1H-NMR 譜圖所含主要標(biāo)志代謝物

本研究共發(fā)現(xiàn)17 個(gè)內(nèi)源性差異代謝物，其中膽堿、乙醇胺、甘油、丙氨酸、谷氨酸、谷氨酰胺在各組的表達(dá)量發(fā)生明顯變化。 采用S-plots 分析及t 檢驗(yàn)進(jìn)行進(jìn)一步的比較分析，相對(duì)應(yīng)的S-plots 圖見(jiàn)圖4。 結(jié)果發(fā)現(xiàn)與正常組相比，模型組膽堿、乙醇胺含量增加（P＜0.05），甘油、丙氨酸、谷氨酸、谷氨酰胺含量減少（P＜0.05）（見(jiàn)圖4-a）；與模型組小鼠相比較，足三里組膽堿、乙醇胺含量減少（P＜0.05），甘油、丙氨酸、谷氨酸、谷氨酰胺含量增加（P＜0.05）（見(jiàn)圖4-b）；與模型組比較，三陰交組膽堿、乙醇胺減少，甘油、丙氨酸、谷氨酸、谷氨酰胺含量增加，但差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。 足三里組與三陰交組比較，膽堿、乙醇胺含量減少（P＜0.05），甘油、丙氨酸、谷氨酸、谷氨酰胺含量增加（P＜0.05）。 從表2 各組小鼠差異代謝物的VIP 值和P 值可以看出6 種特征代謝物在不同組別比較中的差異性，模型組與三陰交組的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.762），在圖4-c 中也有體現(xiàn)。

3 討論

胃黏膜損傷是一種多因素、多途徑參與的臨床常見(jiàn)疾病，是一系列神經(jīng)-內(nèi)分泌異常改變引起胃壁屏障保護(hù)作用減弱和損傷增加的結(jié)果。針灸學(xué)是中醫(yī)學(xué)的重要分支，針灸治療胃黏膜損傷具有療效明顯、不良反應(yīng)少等特點(diǎn)[11]。本課題前期研究證明電針胃經(jīng)穴能有效促進(jìn)胃黏膜的損傷修復(fù)[12]。

表2 各組小鼠差異代謝物VIP 值和P 值比較

圖3 胃黏膜組織1H-NMR 代謝輪廓的OPLS-DA 得分圖

圖4 小鼠相對(duì)應(yīng)S-plots 圖

“十二刺法”中的第4 種刺法稱作“齊刺”。 《靈樞·官針》：“四曰齊刺，齊刺者，直入一，傍入二，以治寒氣小深者。或曰三刺，三刺者，治痹氣小深者也。”齊刺法多針作用于患處，增強(qiáng)針感，促進(jìn)經(jīng)絡(luò)感傳，達(dá)到比單針此法更為顯著的效果[13]。

谷氨酸是機(jī)體神經(jīng)系統(tǒng)中一種含量最豐富的快速興奮性神經(jīng)遞質(zhì)，谷氨酰胺則是谷氨酸類神經(jīng)遞質(zhì)的前體[14]，同時(shí)谷氨酰胺在維持胃腸黏膜的完整性中起著重要的作用[15]。甜菜堿又稱三甲基甘氨酸，存在于細(xì)胞內(nèi)，維持蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)穩(wěn)定和細(xì)胞膜完整性并且對(duì)脂質(zhì)代謝具有突出調(diào)控作用[16]，膽堿是甜菜堿合成的主要來(lái)源，是構(gòu)成生物細(xì)胞膜的重要組分，具有維持細(xì)胞膜完整性及細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)功能[17]。甘油是在脂肪中形成脂肪酸的骨架，甘油可以轉(zhuǎn)化為葡萄糖，為細(xì)胞提供能量，當(dāng)身體有儲(chǔ)存的脂肪作為能量時(shí)，甘油和脂肪酸就會(huì)釋放出來(lái)[18]。丙氨酸參與葡萄糖-丙氨酸循環(huán)，在哺乳動(dòng)物中，肌肉及其他組織分解氨基酸作為能量時(shí)，氨基會(huì)以谷氨酸的形式收集，并在丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶的作用下形成丙氨酸，丙氨酸被輸送至肝臟，參與糖異生，形成葡萄糖，再次輸送至其他組織[19]。 乙醇胺是卵磷脂的重要組成部分，與細(xì)胞膜的組成有關(guān)[20]。 在該實(shí)驗(yàn)中，造模之后，膽堿和乙醇胺在模型組含量明顯上調(diào)，而甘油、谷氨酸、丙氨酸、谷氨酰胺含量明顯下調(diào)，考慮急性應(yīng)激破壞細(xì)胞膜完整性所致。 大量的膽堿和乙醇胺游離在組織液中，而甘油、丙氨酸、谷氨酸和谷氨酰胺因無(wú)法繼續(xù)參與膜內(nèi)代謝故含量下降。干預(yù)結(jié)束后，膽堿和乙醇胺在足三里組含量明顯下調(diào)，而甘油、谷氨酸、丙氨酸、谷氨酰胺含量明顯上調(diào)，考慮齊刺法電針足三里后聯(lián)動(dòng)神經(jīng)-內(nèi)分泌調(diào)節(jié)機(jī)制，加快神經(jīng)遞質(zhì)的傳導(dǎo)，促進(jìn)胃黏膜內(nèi)血流加速，一定程度上促進(jìn)了細(xì)胞的修復(fù)，重塑黏膜組織所致。通過(guò)對(duì)三陰交組代謝物變化趨勢(shì)的橫向縱比較發(fā)現(xiàn)，雖然其差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，但從側(cè)面提示針刺脾經(jīng)穴也可對(duì)急性胃黏膜損傷具有一定修復(fù)意義，后期應(yīng)當(dāng)加以補(bǔ)充實(shí)驗(yàn)探究脾經(jīng)穴對(duì)胃運(yùn)動(dòng)修復(fù)的作用，并探明信號(hào)通路轉(zhuǎn)導(dǎo)。

綜上所述，齊刺胃經(jīng)穴可有效促進(jìn)急性胃黏膜損傷修復(fù)。胃組織的代謝組學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，急性胃黏膜損傷會(huì)影響機(jī)體的神經(jīng)遞質(zhì)、氨基酸等代謝物表達(dá)水平。但是各相關(guān)差異物的信號(hào)通路以及彼此之間的代謝是否有影響關(guān)系目前尚不清楚，因此，相關(guān)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和通路研究是課題組今后的努力方向。