隔姜灸對大鼠脊髓損傷后神經源性膀胱M2、M3乙酰膽堿mRNA及P2X3受體表達的影響

閆曉，李在洺，馮曉東，，白俊敏，劉承梅，

脊髓損傷(Spinal Cord Injury，SCI)是由各種因素造成損害的相應脊髓節段出現病理反射，肌張力異常及運動、感覺功能障礙的相應改變。神經源性膀胱是脊髓損傷患者最常見并發癥，約占65.96%[1]。尿潴留、尿失禁及尿頻、尿急等癥狀是神經源性膀胱的主要臨床表現，易誘發泌尿系統感染及腎功能異常[2]。由于患者膀胱功能障礙是不斷變化的過程，故需對其膀胱功能整體情況進行實時評估和分型，早發現、早處理、正確護理、終身護理和定期隨訪，最大限度地避免并發癥的發生，提高生活質量。研究發現，隔姜灸可改善脊髓損傷后神經源性膀胱的相關癥狀[3-6]，但隔姜灸治療的確切機制尚不明確。本研究擬探討隔姜灸改善脊髓損傷后大鼠神經源性膀胱障礙的作用，了解隔姜灸對脊髓損傷后神經源性膀胱的作用靶點，闡明其作用機制，為臨床干預提供理論依據。

1 材料與方法

1.1動物分組與處理 選取清潔級、健康、成年雄性、SD大鼠為實驗動物，體質量(260.00±20.00)g，由河南省實驗動物中心提供[許可證號：SCXK(豫)2017-0001]，于河南中醫藥大學第一附屬醫院中心實驗室飼養，溫度22℃、濕度50%～70%、模擬標準晝夜系統(12 h光照+12 h黑夜)，給予1周適應喂養。隨機分組制備動物模型后最終納入假手術組、模型組、隔姜灸組各10只，共30只SD大鼠。動物實驗已通過河南中醫藥大學第一附屬醫院倫理委員會批準，操作過程嚴格遵守國際動物保護和使用指南的規定，術后對三組動物均給予抗感染、創口護理及Crede手法[7]協助排尿。

1.2脊髓損傷制模 ①脊髓損傷模型制備。術前所有實驗SD大鼠禁食12 h，自由飲水，稱重后采用10%水合氯醛按3.5 mL/kg的標準腹腔注射麻醉。成功麻醉后，用剃毛器將SD大鼠背部手術區皮毛處理干凈，將其俯臥位固定，消毒備皮。以T10棘突為中心作背部正中切口，長度3～5 cm，依次切開皮膚、淺筋膜、深筋膜及其它皮下組織，鈍性分離椎旁肌肉，用組織嵌夾持T9椎體固定脊柱，用蚊式有齒血管鉗仔細咬除T10～T11棘突及兩側椎板直至關節突，將脊髓暴露約5 mm。在直徑約1.0 cm的圓形區域，應用IH-0400型脊髓致傷儀(美國，PSI)，采用改良Allen′s垂直打擊法設定打擊力度為 200 g建立SD大鼠T10節段脊髓損傷模型。撞擊成功后見尾部痙攣樣擺動，撞擊部位脊髓充血水腫，麻醉清醒后出現雙下肢癱瘓。假手術組僅切除T10椎板，不破壞脊髓。術后用溫鹽水紗布覆蓋傷處數分鐘，在無活動性出血后逐層縫合椎旁肌肉及組織，完畢將SD大鼠置于暖燈處，待其蘇醒后單籠飼養。②脊髓損傷模型評估。成功脊髓損傷模型標準為動物麻醉清醒后，只有前肢參與行走，后肢處于拖動狀態。③膀胱功能評估。脊髓損傷后神經源性膀胱模型建立成功的標準為脊休克期有尿潴留、膀胱充盈表現，腹部可觸及脹大膀胱，無自主排尿，飼養籠內墊料干燥。

1.3術后護理 術后給予SD大鼠創口護理并按照0.2 mL/只的標準給予硫酸慶大霉素腹腔注射以預防感染，每天1次，連續5 d；每日每只SD大鼠腹腔注射5%葡萄糖氯化鈉溶液2 mL以輔助飲食，上、下午各1次，直至能自行進食為止。給予Crede手法輔助排尿，于體表膀胱上方擠壓膀胱協助排尿，每天上下午各1次，至可自主排尿為止。

1.4干預措施 ①隔姜灸組。參考《實驗針灸學》[8]并結合人體穴位分布特點選取關元(臍下約25 mm處)、命門(背部后正中線上，第二腰椎棘突下凹陷處)、足三里(膝關節后外側，在腓骨頭下約5 mm處)、陰陵泉(在小腿內側與陽陵泉相對，陽陵泉距足三里上外側5 mm處)、八髎(位于第1、2、3、4骶后孔處)給予隔姜灸。灸前用寵物剃毛器將所灸穴位區皮毛剃除，關元、足三里、陰陵泉在隔姜灸操作時，將SD大鼠仰臥位固定；命門、八髎在隔姜灸操作時，將SD大鼠俯臥位固定。將已搗碎的生姜泥制成厚度為0.5 cm平鋪于穴位上，用浸泡過生姜汁的濕紗布固定；將特制艾灸條分割成小體積點燃后放于適應穴位區大小的溫灸架和溫筒器內，用彈力繃帶固定于穴位上，每個穴位灸10 min；每天1次，共12 d。②模型組。術后單籠飼養，給予術后護理。③假手術組。術后單籠飼養，給予術后護理。

1.5取材及檢測

各組大鼠按3.5 mL/kg用10%水合氯醛麻醉后，于下腹部作切口，迅速取出其膀胱并分裝放入凍存管后轉入盛有液氮的容器內速凍。膀胱取出后迅速斷頭暴露背部皮膚肌肉及相應的脊髓節段，取背神經節標本，分裝于凍存管后放入液氮內速凍。之后將所有凍存管轉至-80℃冰箱備用。

1.5.1Western blot檢測脊髓神經節P2X3受體表達 按每1個DRG加入20 μL裂解液(每1 mL RIPA加入10 μL PMSF)的比例加入裂解液用研磨器研磨，直至充分裂解，靜止10 min后12 000 g離心5 min。測濃度，獲取上清液樣本。取適量上清液以60 V、30 min，80 V電泳至溴酚藍將要跑出分離膠時終止電泳，以12 V、60 min半干法轉膜，結束后以1×TBST漂洗3次，每次5 min，漂洗結束后將PVDF膜移至5%脫脂奶粉封閉液中，室溫搖床搖動封閉1.5 h。結合一抗、二抗、化學發光顯影后使用Image Pro Plus軟件進行圖像分析條帶灰度值。以GAPDH為內參，并以每張膜的假手術組條帶灰度值進行均一化校正，進而得到P2X3受體的相對表達量。

1.5.2RT-PCR檢測膀胱組織M2、M3乙酰膽堿mRNA的表達 ①提總RNA。取100 mg組織加入1 mL裂解液、研磨，按照總RNA提取試劑盒的操作說明提取RNA，測濃度，按1 μg的上樣量，計算體積。②RNA逆轉錄反應。按照HiScript?Ⅱ1st Strand cDNA Synthesis Kit 試劑盒操作說明書配制20 μL的逆轉錄反應體系(RNA=1 μg)，輕微震蕩離心后置于逆轉錄梯度PCR儀上。按設置的反應程序25℃，5 min；50℃，15 min；85℃，2 min進行反應。③qPCR反應。反應體系為20 μL，其中cDNA為1 μL，Forward primers、Reverse primers各1 μL，PowerUPTMSYBRTMGreen Master Mix(2X)為10 μL，RNase free ddH2O為7 μL。擴增參數設置：UDG酶激活，50℃、2 min，1個循環；預變性95℃、5 min，1個循環；變性、退火、延伸反應為95℃、15 s，60℃、1 min，45個循環；熔解反應，95℃、15 s，60℃、1 min，升溫至95℃，37℃、2 min、1個循環。M2乙酰膽堿、M3乙酰膽堿基因相對表達定量分析采用2-△△Ct法進行計算，Ct值為擴增曲線達到設定閾值時的循環數，以beta actin為內參基因進行校正，計算mRNA相對表達量。

1.6統計學方法 數據采用SPSS22.0軟件進行處理，采用單因素方差分析，檢驗水準α=0.05。

2 結果

三組大鼠嘌呤能P2X3 受體蛋白及M2、M3乙酰膽堿mRNA相對表達量比較，見表1。

表1 三組大鼠嘌呤能P2X3 受體蛋白及M2、M3乙酰膽堿mRNA相對表達量比較

3 討論

在中醫學中，脊髓損傷后神經源性膀胱功能障礙歸屬于“癃閉”范疇，主要以小便量少甚則閉塞不通，排尿困難為主癥，其病位在腎與膀胱，基本病機為膀胱氣化功能失調，治療主要按照“腑以通為用”的原則，根據證候不同而辨證論治[9]。臨床實踐中，在恢復膀胱正常排尿反射，減少并發癥，降低對患者正常生活影響的總體目標指導下，對神經源性膀胱患者的護理主要采用適應患者的導尿術[10]、給予行為訓練及輔助排尿等指導，施加盆底肌肉鍛煉等方法[11]。治療上采用包括藥物、針灸、手術、電刺激物理治療、綜合治療等方法[12]。在眾多療法中，以改善患者膀胱功能、促進自主排尿功能重建為目標的中醫綜合康復是解決脊髓損傷后神經源性膀胱尿潴留的有效手段[13]。

中醫綜合康復中艾灸以其治療方法簡單、療效好而被患者接受。艾灸是借灸火的溫熱刺激及藥物作用在相應的經絡腧穴發揮溫皮通脈、溫補氣血、扶正祛邪、防治疾病作用的一種治療方法。艾灸具有獨特的療效，有“灸治百病”之說[14]。隔姜灸能發揮艾灸與姜片的雙重作用，與一般灸法比較具有更好的溫經通絡、祛寒鎮痛作用。在隔姜灸治療中，正確選擇腧穴至關重要，有研究發現，在關元、命門、足三里、陰陵泉、八髎等腧穴采用艾灸療法對脊髓損傷后神經源性膀胱的療效較好[15]。中醫理論認為，關元為元氣所存之處[16]，是任脈與足三陰經交會穴，具有補下元、促氣化的作用；陰陵泉為脾經合穴，具有清濕熱、利小便的功效；八髎穴位于足太陽膀胱經上，主治小便不利等病癥，足三里為胃之下合穴，為強壯保健的要穴，可以主治虛勞諸證。上述諸穴配伍使用結合隔姜灸對脊髓損傷后神經源性膀胱患者膀胱功能的改善有較好的療效。

脊髓是排尿神經中樞，調節尿道括約肌和逼尿肌功能活動，構成神經傳導通路。脊髓損傷破壞了自主控制和協調膀胱括約肌功能的正常反射途徑。當脊髓損傷發生在骶髓以上時，骶髓排尿中樞失去骶髓以上排尿中樞的抑制作用，會造成逼尿肌反射亢進，膀胱最大容量減少、膀胱順應性下降等病理生理變化[17]。在脊休克期損傷節段以下為遲緩性癱瘓狀態，表現為感覺、運動、反射均消失，尿潴留；脊休克期結束后，各種反射活動依次恢復，此時損傷部位不同，膀胱障礙表現也不同[18-19]。

P2X受體為配體離子門控通道，是非腎上腺素非膽堿能(NANC)重要成員[20]，分為P2X1～P2X7共7個亞型，而P2X3受體主要在膀胱上皮表達，參與膀胱的傳入神經活動和膀胱感覺功能的調節[21]。本研究結果顯示，隔姜灸組治療后嘌呤能P2X3受體的表達水平顯著高于模型組(P<0.05)，提示脊髓損傷術后神經源性膀胱大鼠尿潴留、膀胱充盈的表現與嘌呤能P2X3受體的表達水平降低有關，而隔姜灸治療可改善嘌呤能P2X3受體的表達水平，從而有利于膀胱功能的恢復。實驗過程也發現，隔姜灸治療后實驗大鼠尿潴留、膀胱充盈的癥狀改善，有自主排尿的表現。與Cockayne等[22]研究結果一致。分析作用機制可能為，隔姜灸通過溫經通絡促進膀胱上皮釋放ATP，激活嘌呤能P2X3受體的表達，從而改善脊髓損傷后神經源性膀胱大鼠尿潴留、膀胱充盈的癥狀。

支配膀胱逼尿肌的神經主要為膽堿能神經，該神經通過副交感神經節后纖維釋放的乙酰膽堿作用于膀胱逼尿肌內M受體發揮作用。乙酰膽堿M受體分為M1～M5 5個亞型，M2、M3受體在逼尿肌收縮活動中發揮重要作用。有學者認為，M3受體發揮直接收縮作用，而M2受體則發揮間接介導作用[23-24]。隔姜灸組治療后M2、M3乙酰膽堿mRNA的表達水平顯著高于模型組(均P<0.05)。提示隔姜灸治療可改善脊髓損傷大鼠M2、M3乙酰膽堿mRNA的表達水平，從而增強膀胱逼尿肌收縮力，改善脊髓損傷后神經源性膀胱大鼠尿潴留、膀胱充盈的癥狀，與上述理論研究一致。

本實驗結果表明，隔姜灸治療可提高脊髓損傷大鼠脊髓神經節嘌呤能P2X3受體及膀胱組織中M2、M3乙酰膽堿mRNA的表達，有利于神經源性膀胱功能障礙的改善。隔姜灸可作為臨床脊髓損傷神經源性膀胱患者治療的借鑒；其理論探討可作為相關研究的參照。今后研究可應用尿流動力學檢測技術完善膀胱功能多項指標的檢測，為脊髓損傷神經源性膀胱患者提供更詳實的實證依據。