大豆對菲脅迫的生理響應及耐菲機理研究

楊丹 王罡 王戊騰 樊亞君 肖薇薇 張思琪 李倩 季靜

（天津大學環境科學與工程學院，天津 300072）

多 環 芳 烴（Polycyclic aromatic hydrocarbons，PAHs）是一種存在于空氣、土壤及水體環境中，具有毒性，且高度持久的污染物［1］。據報道，在中國長江三角洲地區就存在著多環芳烴污染的問題［2］。伴隨著人類城市化和工業化進程的推進，人類活動，例如日常生活中汽車尾氣以及工業“三廢”的大量排放［3］所造成的碳基燃料消耗量日益增加，致使多環芳烴在全球環境中的含量與日俱增，且分布愈加廣泛。環境中的多環芳烴大多存在于地表土壤中，土壤中的多環芳烴會被植物吸收，從而對植物的生長造成傷害［4-5］。與此同時，空氣中的多環芳烴也同樣會被植物葉片吸收［6-7］。菲（Phenanthrene，Phe）是含有3個苯環的煤焦油加工產品之一，也是最簡單的非線性多環芳烴之一。菲在工業中具有廣泛的應用，如可用于制造染料及樹脂等。然而，菲會對人類的健康造成影響，其已經被世界衛生組織列為了致癌物質。

近年來，對多環芳烴污染環境的修復也逐漸成為研究的熱點，植物修復作為一種低成本且環境友好的環境治理技術正在受到積極的關注［8］。Yin等［9］的研究表明，大豆在較低pH（4.5）及較高濃度的菲（0.8-1.2 mg /L）脅迫處理下，其細胞質膜具有較強的去極化，H+-ATPase的活性更高，轉運蛋白與菲的親和力更大，從而促使大豆可以吸收更多的菲。由此可見，大豆是可以進行菲污染修復的重要植物。此外大豆也是我國重要的糧食作物，是我國農業發展的重要支柱［10］。然而，大豆作為潛在的菲污染修復植物，其對菲的生理響應以及應對菲脅迫的防御機制，人們還知之甚少。現有研究表明，生長于較高濃度多環芳烴污染環境中的水稻的水含量、生物量、光合色素含量、電解質滲透率、抗氧化酶活性以及可溶性蛋白含量等都受到影響［11］。較高濃度的多環芳烴脅迫會影響大豆幼苗的發芽勢、最終發芽率、胞間CO2濃度、葉綠素含量以及熒光強度［12］。鑒于此，本研究以菲作為多環芳烴的模式污染物，通過對菲脅迫下植物的生物量變化、光合色素含量變化、氧化損傷程度以及抗逆系統的活性等方面進行分析，研究菲對植物生長的影響，探究大豆響應多環芳烴脅迫的生理機制，為利用植物進行多環芳烴污染土壤的修復提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料

本研究所選用的大豆（合豐25）種子由本實驗室保存。選取籽粒飽滿、大小均勻的大豆種子使用15% NaClO浸泡15 min后使用無菌水沖洗3次，隨后將消毒后的種子置于無菌水中暗培養4 d。待種子生根后移至1/2 Hoagland 營養液中，使用16 h光照/8 h黑暗的光照周期，于25℃環境中培養。

1.2 方法

1.2.1 植物的脅迫處理 待大豆幼苗長出第一對真葉后，選取長勢相似的幼苗移至Hoagland培養液。試驗中使用甲醇配制100 mmol/L的菲母液，并在隨后的試驗中使用甲醇將母液稀釋至25 μmol/L（P25），50 μmol/L（P50），75 μmol/L（P75），100 μmol/L（P100）。使用不同濃度的菲溶液，對葉片進行隔天噴施處理，每次噴施2 mL處理液。其中CK組作為對照組噴施等量的甲醇作為對照。取處理后第10天的幼苗進行隨后的生理數據的測定。

1.2.2 生物量指標的測定 鮮重（FW）的測量：選取待測植株，清水洗凈后，用濾紙吸干植物表面水分后稱量。干重（DW）的測量：將新鮮的植株樣品于105℃下殺青10 min，隨后保持80℃恒溫將樣品烘干至恒重。

1.2.3 葉片相對含水量的測定 飽和鮮重（TW）的測定：取樣品頂端葉片并將葉子漂浮在含有蒸餾水且密閉的培養皿中3 h至葉片恒重后取出，使用濾紙吸干葉片表面水分后稱量，計為飽和鮮重。隨后，按照公式計算葉片的相對含水量（RWC）：RWC=（FW-DW）/（TW-DW）×100%［13］。

1.2.4 MDA含量的測定 將新鮮葉子0.1 g，使用0.2 mol/L磷酸鹽緩沖溶液（PBS）研磨，加入硫代巴比妥酸，并充分混勻。將勻漿物在100℃加熱15 min，然后在4℃以10 000 r/min離心10 min。使用島津UV-2550紫外分光光度計測定上清液在600 nm，532 nm和450 nm處的吸光值，計算葉片中的MDA含量［14］。

1.2.5 光合色素含量的測定 本研究使用的葉綠素測定方法與Ma等［15］報道的相似。取新鮮植物葉片0.1 g，將葉片剪碎后浸沒在3 mL 95%乙醇中48 h，至葉片完全變成白色。8 000 r/min離心5 min后，取上清液測定其在665 nm，649 nm及470 nm下的吸光度，計算總葉綠素及類胡蘿卜素含量。

1.2.6 抗氧化酶活性的測定 取新鮮葉片0.1 g，使用2 mL濃度為10 mmol/L，pH為7.2的磷酸緩沖液充分研磨。將勻漿液在4℃下10 000 r/min離心15 min，取上清作為酶提取液備用。葉片中超氧化物歧化SOD酶活性使用硝基四氮唑藍（NBT）光化還原法進行測定。葉片中POD酶活性使用愈創木酚法進行測定［14］。

1.2.7 滲透脅迫物質含量的測定 葉片中的脯氨酸含量測定時，使用酸性茚三酮法［14］。取0.1 g葉片置于3 mL的3%的磺基水楊酸中，沸水浴10 min。隨后將其與2 mL的2.5% 的酸性茚三酮，以及2 mL的冰醋酸混合均勻后，置于沸水中40 min。隨后迅速等卻反應液，并向其中加入4 mL甲苯，混合均勻后靜置，直至分層明顯，取上層液體測定520 nm下的吸光值。

1.2.8 數據處理 采用Spss 18.0及單因素分析方法進行統計學分析，使用Origin 9.0進行圖表的繪制。

2 結果

2.1 菲對大豆幼苗生物量的影響

表1顯示了不同濃度的菲對大豆幼苗的葉片及根部生物量的影響。由表1可知，與對照相比，在較低濃度的菲（≤25 μmol/L）處理時，葉片及根的鮮重與干重均有明顯的升高，這說明低濃度的菲對大豆葉的生物量有明顯的促進作用。當菲的濃度上升到50 μmol/L時，葉片的的生物量有所提高。當菲的濃度達到100 μmol/L時，大豆葉片生物量都有明顯的降低，表現為抑制作用。而隨著菲濃度的增大，根部的生物量與對照相比，盡管差異不明顯，但仍呈現出下降的趨勢。

2.2 菲對大豆葉片相對含水量的影響

不同濃度的菲脅迫對大豆葉片水分含量的影響如圖1所示。由圖可知，隨著菲濃度的增加，大豆葉片的含水量表現出先增加后降低的趨勢，在50 μmol/L的菲存在時，植株葉片的含水量達到最高。當菲的濃度高于50 μmol/L時，葉片的相對含水量明顯降低，當處理濃度達到100 μmol/L時，葉片的相對含水量降到最低。

表1 不同濃度菲脅迫對大豆生物量的影響

圖1 不同濃度的菲脅迫對大豆葉片相對水含量的影響

2.3 菲脅迫下大豆葉片損傷程度情況

圖2為在不同濃度的菲脅迫下，葉片受到損傷的程度。結果顯示，植物葉片中MDA含量隨著菲處理濃度的增大而逐漸增大。當在100 μmol/L處理濃度下，MDA的含量最大，其MDA的含量是CK的2.77倍。

圖2 不同濃度菲脅迫下葉片MDA含量差異

2.4 菲脅迫對大豆光合色素的影響

由圖3-A可知，隨著菲濃度的增大，葉綠素的含量先升后降，在50 μmol/L處理下達到最高。當處理濃度大于50 μmol/L后，葉綠素的濃度逐漸降低，在100 μmol/L處理下達到最低。類胡蘿卜素是另外一類參與植物光合作用的重要色素。圖3-B顯示，隨著菲濃度的提高，葉片的類胡蘿卜素的含量較CK組雖然沒有明顯差異，但呈現升高趨勢，當菲的處理濃度達到75 μmol/L時達最高，為CK組的1.81倍。而當菲處理濃度達到100 μmol/L時，類胡蘿卜素的含量則表現出了降低的趨勢，盡管不明顯但仍然高于CK組，為CK組的1.37倍。

圖3 不同濃度菲處理對光合色素含量的影響

2.5 菲脅迫對大豆葉片抗氧化酶活性的影響

由圖4-A可見，培養液中添加低濃度的菲時，大豆葉片中的SOD酶活隨著菲濃度的增加而提高。與對照相比，當使用0-50 μmol/L菲處理大豆時，SOD的活性逐漸升高，在菲濃度達到50 μmol/L時，SOD的酶活性達到最大，是CK組的2.03倍。隨著菲濃度的繼續增大，SOD的活性則逐漸降低。當菲濃度為100 μmol/L時，降至最低，且低于對照。

菲處理下POD的酶活性同樣受到影響。由圖4-B可知，隨著菲濃度的增加，POD的活性逐漸升高，且明顯高于對照，且在75 μmol/L時達到最大值。繼續增加菲的濃度到100 μmol/L，POD的活性則表現出了下降的趨勢，其活性仍然明顯高于CK組。

圖4 不同濃度的菲處理對葉片SOD及POD酶活性的影響

2.6 菲脅迫下大豆葉片中游離脯氨酸的積累

圖5顯示了在不同濃度的菲脅迫下，葉片中游離脯氨酸的積累情況。如圖所示，葉片中脯氨酸的含量隨著菲處理濃度的增高而逐漸升高。當菲的濃度小于50 μmol/L時，雖然差異不明顯，但非處理下脯氨酸含量的含量仍高于CK組。當菲濃度高于50 μmol/L時，與CK組相比，出現明顯差異。在菲濃度達到100 μmol/L時，葉片中脯氨酸的含量達到最高。

圖5 不同濃度菲脅迫下葉片脯氨酸含量差異

3 討論

多環芳烴是一類廣泛存在的環境危害性污染物，植物會通過菲/氫質子泵同向轉運系統（PHE/nH+symport）等方式將菲運送到植物體內，并對植物的生長產生危害［16-17］。試驗結果顯示，大豆幼苗中葉片的相對含水量隨著葉施菲處理濃度的增加表現出先增加后降低的趨勢，這與李玉龍等［18］的研究結果相似。本研究還發現，使用較低濃度的菲（≤25 μmol/L）處理植物時，葉片的干重與鮮重都有顯著增加。而使用較高濃度的菲（≥75 μmol/L）處理植物時，則生物量明顯下降。而在中濃度的菲（25-75 μmol/L）處理下葉片的生物量則保持較穩定的增長，而對植物根部的生物量的影響不大。這與鐘建丹等［19］在研究不同濃度菲對水稻幼苗生長時，以及Chiapusio等［20］在研究菲對黑麥草（LoliumperenneL.）和紅車軸草（Trifolium pratenseL.）的影響時的研究結果相似，即低濃度的菲會促進植物生物量的增加，而高濃度的菲則會造成明顯的生物量的下降。這些結果表明，葉片施用不同濃度的菲會對植物葉片的含水量以及生物量產生影響。擬南芥受到脅迫產生的活性氧簇會氧化質膜并最終轉化為MDA，導致菲脅迫的擬南芥中MDA的含量會隨著菲濃度的增加而升高［21］。本研究的結果顯示，幼苗葉片中的MDA含量隨著菲處理濃度的增加而持續升高。此前的研究結果表明，生長于菲污染土壤中的大豆幼苗的MDA含量隨著菲濃度的增加（0-200 μg/g）以及脅迫時間的延長（0-8 d）表現出顯著的升高［22］，與本研究的結果一致。以上的研究結果說明，葉片施以不同濃度的菲會造成植物葉片中MDA的積累，進而影響了植物體內水分及養分的運輸，造成了葉片水分含量的降低，以及生物量的減小。

菲的添加會對葉片中的葉綠素含量造成影響［21］。本研究顯示，葉片中葉綠素的含量在菲的脅迫下，以50 μmol/L的菲濃度為分界，呈現出了先升高后降低的趨勢。有報道稱，在菲處理下，葉綠素合成和降解都會得到增強，但速率不同，而葉片的顏色表現是葉綠素的合成和降解的綜合結果［23］。因此，在較低菲濃度時，可能是葉綠素的合成速率高于降解速率，表現出了葉綠素含量的提高。而當菲濃度繼續加大，葉綠素的合成速率低于降解速率，最終呈現出葉綠素含量的降低。這說明菲脅迫會造成植物葉片中葉綠素含量的改變，并通過迫影響了葉片的光合色素含量等，進而影響了植物體內水分及養分的運輸，造成了葉片水分含量的降低，以及生物量的減小。此外，大豆葉片中的類胡蘿卜素含量先上升后降低，但始終高于CK組，這與Shen等［24］的研究結果相一致。此外，在研究外源施加類胡蘿卜素對菲脅迫小麥的影響時，發現類胡蘿卜素的添加恢復了小麥葉片中的葉綠素組成以及MDA含量［23］，這也證實了類胡蘿卜素在抵御菲脅迫中的重要作用。這些結果表明，在菲脅迫下，葉片中的類胡蘿卜素可能通過幫助維持光合作用以及降低膜氧化損傷程度來克服菲脅迫對植物生長造成的影響。

SOD酶是參與菲積累的小麥葉片中ROS清除的最有效的抗氧化劑［25］。POD酶作為ROS清除劑，其活性在菲脅迫時較敏感［26］。研究表明抗氧化酶的活性伴隨著ROS的產生而增強［27］。本試驗結果顯示，SOD的活性在菲的濃度高于50 μmol/L后，出現了下降趨勢，當菲的濃度達到100 μmol/L時，SOD的活性都有顯著的降低，這說明在高濃度的菲處理下，SOD受到了更嚴重的ROS攻擊，酶活性逐漸受到抑制，甚至失活［28］。Liu等［22］研究中發現，使用較低濃度菲（50 μg/g）處理大豆幼苗時，其SOD活性總體呈現上升趨勢；而使用較高濃度菲（100 μg/g以及200 μg/g）脅迫大豆幼苗時，幼苗中的SOD酶的活性總體隨著處理時間的延長呈現先上升后降低的趨勢。這與本研究的結果相似，即隨著菲處理濃度的升高，大豆葉片中的SOD酶活性先升高再降低。于此同時，隨著菲濃度的升高，POD的酶活性始終高于對照組，這說明在較高濃度菲脅迫下，POD發揮了主要的抗氧化功能。而由于較高的POD活性，有效地減輕植物體受到的氧化脅迫，從而減緩了菲對大豆幼苗的傷害。當菲的濃度高于75 μmol/L時，POD的活性出現了下降的趨勢，說明當環境中的菲濃度的持續增加，也會導致POD酶的失活，并最終影響到植物的生長。這些結果表明，植物葉片在受到直接的菲脅迫時，會通過提高酶的活性來抵御低濃度菲脅迫造成的損傷。SOD以及POD酶在克服菲脅迫時發揮了很重要的抗氧化作用。且本研究結果發現，在較高濃度的菲處理下，POD酶的作用更明顯。

逆境脅迫會促使植物積累大量的脯氨酸以降低滲透脅迫造成的傷害，因此，植物體內脯氨酸的含量能夠反映出植物受到逆境脅迫的強弱。傅聿青等［29］在研究不同濃度的鹽對不同品種桑樹的影響時，發現了其脯氨酸的含量隨鹽處理濃度增加而增加的情況。本研究結果顯示，植物中脯氨酸的含量與MDA含量的變化趨勢相似，即隨著菲處理濃度的增加而逐漸升高，這說明隨著菲濃度的增加，植物受到的滲透脅迫等也越來越強，并且植物會通過合成脯氨酸等物質來抵御菲脅迫造成的滲透脅迫。

4 結論

葉片噴施菲會對植物的生長造成不利影響。本研究結果表明，當大豆葉面噴施的菲濃度低于50 μmol/L時會提高植物生物量、類胡蘿卜素含量、SOD以及POD酶活性，但仍然會造成葉綠素含量的降低、MDA的積累以及脯氨酸含量的升高。高濃度的菲（75-100 μmol/L）下類胡蘿卜素含量、POD酶活性以及脯氨酸含量始終保持較高水平，但同樣會降低幼苗生物量、葉綠素含量以及SOD酶活性，并增加MDA的積累。