支持高密度BHK-21細胞培養和高產FMD病毒的無血清培養基開發與優化

陳敏 劉旭平 趙亮

（1. 上海倍諳基生物科技有限公司，上海 201203；2. 華東理工大學 生物反應器工程國家重點實驗室，上海 200237）

口蹄疫是一種具有高度傳染性的偶蹄類動物疫病，由口蹄疫病毒（含多種血清型：O、A、C、SAT1［Southern african territories 1）、SAT2、SAT3和Asia1］引起，豬、牛、羊等養殖畜類及水牛等野生動物易感，感染發病率100%，其爆發會對畜牧業造成嚴重的損失。目前最為有效的防控手段是口蹄疫疫苗的接種［1-5］。畜牧業的發展、種群密度的加大都增加了防疫的難度，也進一步提高了對疫苗的需求。近年來，各類新型疫苗不斷涌現，大量文獻介紹了這些新型疫苗所能解決的、現有疫苗存在的問題［6-10］。但是，目前被廣泛使用的疫苗仍以滅活病毒疫苗為主。考慮到滅活疫苗價格昂貴、保質期短、保護作用短、需要重復接種的問題［7-10］，提高現有工藝的疫苗生產能力，加大產能，降低生產成本，無疑是解決當前疫苗需求困境的最佳策略。從生產工藝的角度，BHK-21細胞懸浮培養工藝優于貼壁生產工藝并將逐步取代后者已在領域內達成共識，急需解決的是血清引入可能導致的安全隱患和完全無血清體系下支持高密度細胞培養和高效病毒擴增的問題。

目前利用BHK-21懸浮細胞生產口蹄疫病毒疫苗使用的接毒細胞密度通常在3×106cells/mL-5×106cells/mL，根據病毒血清型不同，收獲病毒完整顆粒在1 μg/mL-10 μg/mL不等。“細胞密度效應”是指基于動物細胞培養技術的病毒生產工藝中發生的病毒收獲量不能隨接毒時細胞密度增高而增高，甚至出現下降的現象［11-14］，是生產工藝在擴大規模和提高產能時的主要瓶頸。這一現象最有可能的原因是高密度細胞培養導致體系內重要營養物質缺乏［15］（如葡萄糖、氨基酸）、有毒代謝副產物積累［16-17］（如乳酸、氨）以及培養環境參數改變［18-19］（如pH），進而影響了細胞的生理狀態以及后續的細胞產毒過程。

本單位前期已開展了大量開發工作，獲得了能夠支持BHK-21懸浮細胞穩定傳代和口蹄疫病毒擴增的多個無血清培養基配方和生產工藝［20-22］。然而，在實際應用時仍需添加低濃度的血清以達到最佳的病毒產量和病毒效價［20-21］。為實現完全的無血清培養工藝，本研究首先將BHK-21細胞培養于前期開發的一款無血清培養基中［20］，觀測細胞生長和接毒時的生理代謝狀態，通過代謝通量分析，了解細胞生長和病毒擴增時的營養需求以及可能導致有毒代謝物積累或培養環境惡化的原因，識別關鍵的營養成分，采用合理的實驗設計，旨在得到一款能夠支持BHK-21細胞高密度懸浮生長和口蹄疫病毒高效擴增的無血清培養基，從而取代現有的低血清培養工藝，并獲得超高細胞密度接毒（＞107cells/mL）、病毒高產量和簡化接毒操作的新工藝。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細胞株 BHK-21貼壁細胞購自中國科學院上海生命科學研究院，使用本單位開發的無血清培養基懸浮馴化，并經單克隆篩選后獲得懸浮細胞株。

1.1.2 培養基 優化前的無血清培養基為本單位自主開發，命名為primary SFM（簡稱P-SFM），包含葡萄糖、氨基酸、維生素、微量元素以及多種血清替代物等營養物質。

低血清培養基（簡稱LSM）為優化前的無血清培養基加1%新生牛血清。

TCID50測試中使用的DMEM購自Sigma。

1.1.3 毒株 O型口蹄疫毒株，懸浮細胞生產獲得，由合作客戶提供，種毒TCID50值為7.25 lgTCID50/0.1mL。

1.2 方法

1.2.1 BHK-21細胞在搖瓶體系中的培養 取復蘇后可穩定傳代且活性大于95%的BHK-21細胞用于本研究。

取處于對數生長期、活性大于95%的足量細胞置于50 mL離心管，1 000 r/min離心5 min后棄上清，加入30 mL實驗組無血清培養基后重懸細胞并轉移至125 mL搖瓶內。搖床轉速設定為130 r/min，培養條件為37℃、5% CO2、飽和濕度。

批培養時，每24 h取樣計數，樣品于10 000 r/min下離心5 min，保留上清凍存于-20℃，用于營養代謝物的分析。

傳代培養或擴培時，每48 h將細胞液用新鮮的無血清培養基稀釋至活細胞密度為1×106cells/mL，培養體積根據傳代或擴培的需要進行調整。

1.2.2 葡萄糖濃度的優化 依據BHK-21細胞在P-SFM中的生長和代謝情況，以指數期葡萄糖的比消耗速率（1.07 mmol/109cells·day）和預期達到的最高活細胞密度（2×107cells/mL）進行計算，葡萄糖需增加的濃度約為8 mmol/L（公式1）。為避免乳酸過量累積，本節設計在初始濃度的基礎上分別增加5 mmol/L和10 mmol/L葡萄糖進行考察。

1.2.3 氨基酸濃度的優化 依據BHK-21細胞在P-SFM中的生長和代謝情況，對谷氨酰胺、天冬氨酸、天冬酰胺3種氨基酸的濃度進行優化。假設活細胞密度和指數期（D0-D3期間）平均比消耗速率均保持不變，以第3天各氨基酸剩余濃度為初始濃度的30%、45%為準，算得各氨基酸的推薦增加濃度（表1）。計算公式如下：

表1 氨基酸濃度優化的理論添加量

依據表1推薦的濃度，該部分實驗分別將3種氨基酸按照原濃度增加60%和30%作為兩個濃度水平，高濃度記為“+”，低濃度為“-”，設計如表2。

表2 氨基酸濃度優化的實驗設計

1.2.4 銅鋅離子濃度的優化 銅離子、鋅離子分別設計3個濃度水平進行考察，實驗設計如表3所示。

1.2.5 基于搖瓶培養體系的接毒操作 直接接毒：將BHK-21細胞以1×106cells/mL接種于搖瓶，待細胞擴增至0.9 cells/mL-1.0×107cells/mL，以MOI=0.1接種口蹄疫病毒，細胞病變90%以上時收獲毒液。

表3 銅鋅離子濃度實驗設計表

接毒前流加補液：將BHK-21細胞以1 cells/mL×106cells/mL接種于搖瓶，待細胞擴增至0.9 cells/mL-1.0×107cells/mL，流加20%濃縮培養基，并以MOI=0.1接種口蹄疫病毒，細胞病變90%以上時收獲毒液。

接毒前離心換液：將BHK-21細胞以1 cells/mL×106cells/mL接種于搖瓶，待細胞擴增至0.9 cells/mL-1.0×107cells/mL，離心去上清，使用新鮮培養基重懸細胞，并以MOI=0.1接種口蹄疫病毒，細胞病變90%以上時收獲毒液。

1.2.6 接毒時設定不同的活細胞密度 將BHK-21細胞以1×106cells/mL接種于搖瓶，48 h后取樣計數，離心更換新鮮培養基，調整活細胞密度分別為3×106cells/mL、6×106cells/mL和9×106cells/mL，以MOI=0.1接種口蹄疫病毒，細胞病變90%以上時收獲毒液。

1.2.7 BHK-21細胞在生物反應器中的培養 將BHK-21細胞以1×106cells/mL的活細胞密度接種于確認無菌的2 L生物反應器，培養體積1 L，每24 h取樣計數。生物反應器的操作參數設置為：溫度37℃，轉速150 r/min，pH控制在7.2-7.4，溶氧設定為40%，表層通氣控制在（50-100）mL/min，堿液使用1 mol/L的Na2CO3溶液。

1.2.8 基于生物反應器培養體系的接毒操作 按照方法1.2.7在2 L生物反應器中培養BHK-21細胞，48 h后4℃低溫沉降換液，換液量約80%，按照MOI =0.1接種口蹄疫病毒，調節pH為7.2-7.4，接毒6 h后每2 h取樣計數，待細胞病變90%以上，收集病毒液于樣品瓶中，-80℃保存。留樣用于測定TCID50和146s含量。

1.2.9 細胞計數 使用自動計數儀（IC1000，Countstar）進行細胞計數，并在計數前添加臺盼藍染液識別體系中的死細胞。

1.2.10 代謝物濃度檢測 葡萄糖、乳酸和氨的濃度使用生化分析儀（BP400，Nova）進行檢測；氨基酸濃度使用HPLC（1260，Agilent）基于OPA+FMOC在線衍生的方法進行檢測。

1.2.11 TCID50的測定 病毒感染半數細胞培養物的稀釋倍數常用TCID50進行表示，是病毒感染能力的重要指標。檢測方法參考文獻方法［20-21］。簡言之，將不同稀釋倍數的病毒液加入貼壁培養的單層BHK-21細胞，觀察細胞的病變情況，并以下式計算TCID50：

其中，L為孔板中病變率在50%以上的最高稀釋度對數；D為孔板中病變率在50%以上的最高稀釋度對數與病變率低于50%的最低稀釋度對數之間的差值；S為孔板中病變率的總和。

1.2.12 146s含量的測定 口蹄疫病毒完整粒子146s采用密度梯度離心法進行檢測，參考文獻方法［23］。

1.2.13 數據處理

（1）比生長速率

μ：比生長速率（day-1）；X2、X1：兩個采樣點的活細胞密度（cells/mL）；?t：兩個采樣點的間隔時間（day）。

（2）活細胞密度對時間積分

IVCC：活細胞密度對時間的積分（109cells·day/L）。

（3）比生成/比消耗速率

Qp：兩個采樣點之間葡萄糖的比消耗速率或乳 酸/氨/氨 基 酸 的 比 生 成 速 率（mmol/（109cells·day））；?p：兩個采樣點之間單位體積培養物中該物質的消耗量或生成量（mmol/L）。

（4）細胞病變率

CPE：BHK-21細胞被口蹄疫病毒感染后的病變率（Cytopathic effect，%）；Xt：t時刻培養體系中的活細胞密度（cells/mL）；Xm：細胞從接種口蹄疫病毒到病變完成過程中的最大活細胞密度（cells/mL）。

（5）單細胞產毒能力

Svy：單位細胞產毒量（Cell-specific virus yield，virions/cell）；146s：口蹄疫病毒完整粒子量（10-6g/mL）；Mv：常數，單個完整病毒粒子的質量，1.146×10-17g/virion；Xm：細胞從接種口蹄疫病毒到病變完成過程中的最大活細胞密度（cells/mL）。

（6）數理統計 文章中的數據以均值±標準偏差進行標示，組間數據對比采用學生T檢驗法，當P<0.05時認為差異顯著。

2 結果

2.1 BHK-21細胞在P-SFM中的生長和代謝

BHK-21細胞在P-SFM中進行批培養的生長和關鍵代謝情況如圖1所示。0-2 d是明顯的指數生長期，平均比生長速率0.96/day，第2-3天比生長速率下降為0.39/day，第3天最高活細胞密度達到13.7×106cells/mL并開始下降。培養至第3天時，葡萄糖的濃度為初始濃度的30%左右，不構成營養限制，而谷氨酰胺、天冬氨酸、天冬酰胺3種氨基酸的濃度不足初始濃度的15%（圖1-B），有可能是細胞生長的限制因素。

如圖1-A所示，0-3 d內，乳酸和氨處在持續積累的狀態，乳酸最高濃度為26.6 mmol/L，氨為5.02 mmol/L，均已達到抑制細胞生長和影響病毒表達的水平［17，24-25］。有研究結果表明，不適當的營養成分補充［26-27］（如葡萄糖、谷氨酰胺）和一些微量元素（如銅離子［28-29］和鋅離子［30］）會影響細胞的代謝和產毒過程。因此，針對此款無血清培養基，本研究從葡萄糖、氨基酸（谷氨酰胺、天冬氨酸、天冬酰胺）、微量元素（銅離子、鋅離子）3個方面進行優化。

圖1 BHK-21細胞在P-SFM批培養過程中的生長和代謝情況

2.2 無血清培養基的優化

如圖2-A，葡萄糖濃度提高5 mmol/L和10 mmol/L都對細胞的生長有促進作用，兩者之間無顯著性差異，但乳酸的積累也隨葡萄糖濃度的增高而增高。因此，優化后的培養基中葡萄糖濃度的增加量定為5 mmol/L。

氨基酸濃度優化的實驗中，以指數期的細胞比生長速率和葡萄糖濃度為指標時，天冬氨酸、天冬酰胺和谷氨酰胺的濃度在較高濃度添加時都顯示了微弱但不顯著的優勢。但是乳酸的累積和谷氨酰胺的增加呈正相關，且具有顯著性差異（圖2-B）。因此，優化后的培養基中天冬氨酸、天冬酰胺和谷氨酰胺的濃度分別以“+”、“+”、“-”的水平添加。

銅鋅離子濃度優化的實驗中，葡萄糖、谷氨酰胺的消耗、乳酸、氨的累積均沒有顯著性差異，而以0-3 d細胞總IVCC作為指標篩選出的最佳銅離子濃度為0.04 mmol/L，鋅離子濃度為0.2 mmol/L，且鋅離子濃度對細胞生長的影響更為顯著（圖2-C）。

調整以上成分的濃度后，新的無血清培養基被命名為Opt-SFM。

2.3 BHK-21細胞在Opt-SFM中的生長和代謝

搖瓶體系中，BHK-21細胞在Opt-SFM中0-3 d的細胞總IVCC顯著高于P-SFM組（圖3-A）；Opt-SFM支持細胞穩定傳代，48 h內的比生長速率為1.07-1.13/day（圖3-C），傳代過程中細胞活性始終高于98%；與P-SFM相比，Opt-SFM中的葡萄糖比消耗速率和乳酸比生成速率顯著降低（圖3-B）；在Opt-SFM中，細胞形態飽滿、尺寸均勻，且結團情況極少（圖3-D）。

圖2 無血清培養基的優化

反應器體系內，細胞的生長情況相比搖瓶體系有了更大的提升，如圖4-A所示，細胞在Opt-SFM中最高活細胞密度達到17×106-18×106cells/mL（最高紀錄為17.8×106cells/mL），與P-SFM相比提高約23.5%；前3 d的葡萄糖比消耗速率和乳酸、氨的比生成速率皆低于P-SFM（圖4-B）。

圖3 基于搖瓶體系，BHK-21細胞在Opt-SFM中的生長和代謝

圖4 基于反應器體系，BHK-21細胞在Opt-SFM中的生長和代謝

2.4 口蹄疫病毒在Opt-SFM中的擴增

2.4.1 搖瓶體系中口蹄疫病毒的擴增情況 以低血清培養基LSM作為對照，在Opt-SFM中，以任何接毒條件獲得的病毒完整顆粒146s產量和單細胞產毒能力都高于對照組。如圖5所示，病毒產量隨接毒時細胞密度升高而升高，接毒細胞密度9×106cells/mL時，Opt-SFM中146s產量達到15.45 μg/mL。接毒操作方式上，最優選擇是接毒前離心全量換液，流加補液其次，直接接毒所得病毒產量最低；在Opt-SFM中，接毒前離心換液的接毒操作最終得到了14.39 μg/mL的146s病毒產量，單細胞產毒能力達到13.95×104virions/mL。

圖5 細胞密度和接毒方式對病毒產量和單細胞產毒能力的影響

2.4.2 反應器體系中口蹄疫病毒的擴增情況 反應器體系中，接毒前BHK-21細胞的密度達到10.1×106cells/mL，比生長速率為1.14/day，優于搖瓶體系，說明細胞不但達到了非常高的密度，而且仍處在活躍的指數生長期內。接毒0 h細胞形態飽滿、均勻分散（圖6-B）。接毒12 h后細胞病變率達到90%以上（圖6-A），計細胞數時視野中出現大量死細胞和細胞碎片（圖6-C）。

如圖7，在Opt-SFM中，細胞病變90%以上收毒后測得毒液的效價為7.25 lgTCID50/0.1mL，與LSM實驗組水平相似，但是在Opt-SFM中獲得的146s含量為15.6 μg/mL，比LSM組提高了50.7%。

3 討論

圖6 BHK-21細胞在Opt-SFM中接種口蹄疫病毒細胞生長與病變情況

口蹄疫病毒屬于烈性侵染病毒，一般24 h內使宿主細胞完全病變。作為病毒生產的“工廠”，接毒時BHK-21細胞的密度和狀態都與病毒的最終產量有重要的關系。Maranga等［31］利用昆蟲細胞桿狀病毒表達系統在無血清培養基中生產豬細小病毒樣顆粒（VLPs）時發現，選擇合適的接毒時間，確保細胞處于指數生長期，比選擇細胞密度高但處于穩定期的細胞更容易獲得較高的產量。本研究中BHK-21細胞在Opt-SFM中培養48 h時細胞密度雖已達到107cells/mL，但仍處于指數生長期，此時細胞狀態健康，細胞內各種酶的活性高，細胞產毒能力高，是理想的接毒時間。

圖7 培養基優化前后病毒效價TCID50和146s完整病毒顆粒的含量

破除“細胞密度效應”的關鍵在于營養成分的供應和有毒代謝副產物的消除［11-12］。Dill等［15］的實驗發現，培養體系中增加葡萄糖和谷氨酰胺的濃度時均不會影響病毒效價。然而，其文章中考察的葡萄糖濃度最低為22 mmol/L，僅支持最高3×106cells/mL的細胞密度，按照本文的結論，支持1.7×107cells/mL的BHK-21細胞密度僅需要45 mmol/L葡萄糖，因此，Dill等［15］的葡萄糖添加量已經超過了細胞對葡萄糖消耗的需求，成為葡萄糖濃度持續增加無法引起產量進一步提高，反而會導致乳酸大量積累的原因。進一步證明了按照細胞的代謝規律和細胞需求進行培養基設計和優化的重要性。本研究對無血清培養基中葡萄糖、3種氨基酸和銅鋅離子濃度的設計均以營養成分的代謝規律為基礎，滿足細胞需求的同時，降低細胞的生長壓力，因此代謝副產物的積累情況不升反降。降低乳酸和氨本身對病毒生產過程影響的同時［16-17］，也降低了因乳酸積累可能引起的pH值降低和滲透壓升高等環境條件的改變對產毒過程的負面影響［18-19］。

提高接毒時細胞密度和改善培養環境的另一個重要意義在于優化接毒操作。搖瓶體系篩選出的接毒前離心換液操作，在生物反應器水平實施時，通常采用低溫沉降的方式，與多數企業現行的操作相同，目的是減小培養體系積累的代謝副產物或其他不利因素對產毒過程的干擾［21］。但是，低溫沉降耗時耗力，而且不可避免地會影響細胞狀態，進而降低其產毒能力。作為可替代的接毒操作方式，接毒前流加補液一定程度上使細胞維持在穩定狀態，而且減少了換液操作可能引入的染菌風險。本文中，BHK-21細胞在Opt-SFM中接毒前流加補液的操作所獲得的病毒產量高于在LSM中實施換液后接毒，這一結果為改良接毒工藝提供了可能性。

采用不含血清和蛋白、化學成分明確的培養基進行BHK-21細胞懸浮培養和口蹄疫病毒疫苗生產，能夠在提高產能效率的同時降低血清等動物源性添加物的安全風險，并減少生產過程中雜蛋白對病毒疫苗純化制劑的壓力［32］。因此，使用無血清懸浮培養工藝生產病毒疫苗是生物制品產業發展的必然趨勢，本研究的成果對于無血清培養基的工業化應用具有極強的現實意義。

4 結論

本研究開發的無血清培養基能夠支持BHK-21懸浮細胞高密度培養和穩定傳代，最高活細胞密度可達1.78×107cells/mL，培養過程中，乳酸和氨等代謝副產物都維持在較低水平。以1×106cells/mL的接種密度，長至48 h時接毒，相同操作條件下，無血清培養基可獲得與低血清培養基相似的病毒效價（7.25 lgTCID50/0.1mL），而完整病毒粒子146s則達到了15.6 μg/mL，是低血清培養體系的1.5倍。無血清培養基具有完全替代低血清懸浮培養工藝生產口蹄疫病毒的潛能。