稻曲病菌菌株GZ-14-07中攜帶的全病毒基因組特征研究

張婷婷 滕麗 蔡小姚 龍慧 李升愉 劉紅美

（1. 貴州醫科大學 生物與醫學工程重點實驗室，貴陽 550000；2. 貴州醫科大學 基礎醫學院，貴陽 550000；3. 貴州醫科大學 環境污染與

疾病監控省部共建教育部重點實驗室，貴陽 550000）

水稻稻曲病（Rice false smut）稱作偽黑穗病、綠黑穗病，因為它多發生在高產量收獲的年份，所以又稱為“豐收果”。水稻稻曲病是由于水稻花器官感染了稻曲病菌（有性態：Villosiclava virens；無性態：Ustilaginoidea virens）引起的真菌性病害［1］。感染了稻曲病菌的水稻，稻穗的空秕率增加，稻谷的千粒重降低，從而導致了水稻產量嚴重下降，稻米產量的損失率與稻曲球的病粒率呈顯著性正相關［2］。自20世紀中葉以后，稻曲病在全世界主要稻區的發生無論在規模上還是嚴重程度方面均呈現出持續上升的趨勢［3］。過去數十年來我國稻曲病菌導致的稻曲病的發生一直呈不斷加重的趨勢，已由一個次要病害逐步演變成為危害水稻生產的主要病害之一，在所有水稻種植區都已成為一種破壞性病害［4-5］。稻曲病菌侵染水稻小穗形成假黑穗球，產生大量的墨綠色或黑色的厚垣孢子可影響其他水稻米粒的光澤，造成巨大的產量損失［6-7］。此外，假黑穗球還含有黑粉菌毒素，此毒素是微管的抑制劑，可明顯抑制動物的微管蛋白的組裝，對人和牲畜都有毒害作用［8］。綜上，稻曲病除了能使水稻嚴重減產，降低水稻稻米的品質，也對糧食食品安全造成了嚴重的威脅。

真菌病毒（Mycovirus或Fungal viruses）是一類宿主為真菌的病毒，廣泛的存在于所有類群的真菌中。病毒基因組的核酸類型和病毒基因組的復制方式是真菌病毒分類的主要依據，目前所發現的絕大多數真菌病毒的基因組核酸是雙鏈RNA（doublestranded RNA，dsRNA）。dsRNA病毒主要屬于6個科，分別是：呼腸孤病毒科（Reoviridae）、全病毒科（Totiviridae）、雙分病毒科（Paritiviridae）、產黃青霉病毒科（Chrysoviridae）、四分體病毒科（Quadriviridae）和巨型雙節段病毒科（Megabirnaviridae）［9］。其中全病毒科具有無包膜結構的正二十面體球形顆粒的病毒粒體結構，直徑約為40 nm。病毒基因組不分段，僅由一段4.6-6.7 kb的線性dsRNA分子組成，包含了兩個開放閱讀框（Open Reading Frame，ORF）分別編碼衣殼蛋白（Capsid protein，CP）和依賴于RNA的RNA聚合酶（RNA-dependentRNA polymerase，RdRp）［9-10］。衣殼蛋白（CP）靠近5'端，而依賴于RNA的RNA聚合酶（RdRp）靠近3'端。全病毒科中一共有5個屬，分別是：全病毒屬（Totivirus），維多利亞屬（Victorivirus），梨形鞭毛蟲病毒屬（Giardiavirus），滴蟲病毒屬（Trichomonasvirus）和 利 什 曼 原 蟲 病 毒 屬（Leishmaniavirus）［10］。其中能夠侵染真菌的只有兩個屬，分別為：Totivirus和Victorivirus［11］。Totivirus主 要 侵 染Saccharomyces cerevisiae、Scheffersomyces segobiensis、Xanthophyllomyces dendrorhous等酵母和Ustilago maydis、Tuber aestivum等絲狀真菌［12-14］。Victorivirus只寄生于絲狀真菌中［15］，而且在Victorivirus屬的模式種維多利亞長螺孢190S病毒（Helminthosporimn victoriavirus 190S；HvV190S）基因組中，靠近5'端的衣殼蛋白（CP）和靠近3'端的依賴于RNA的RNA聚合酶（RdRp）之間存在一個AUGA的序列，能啟動一種被稱為翻譯終止后又重新啟動翻譯（Termination and reinitiation）的機制將衣殼蛋白（CP）和依賴于RNA的RNA聚合酶（RdRp）融合成一個大的開放閱讀框［16］。

2013年，首次報道了水稻稻曲病菌菌株中攜帶真菌病毒［17］。近幾年來，越來越多關于稻曲病菌中攜帶真菌病毒的報道［17-25］。本研究中，我們報道了一株從稻曲病菌菌株GZ-14-07中分離的真菌病毒，病毒命名為Ustilaginoidea virensRNA virus 6（UvRV6）。在對UvRV6的全基因組序列測序和分析中，發現UvRV6屬于全病毒科維多利亞屬病毒的新成員。

1 材料與方法

1.1 材料

稻曲病菌菌株GZ-14-07于2014年從貴州省稻曲病菌侵染的水稻稻曲球中分離出。

1.2 方法

1.2.1 稻曲病菌菌株GZ-14-07的分離 將稻曲球切分成小塊，用5%的次氯酸鈉將新鮮的稻曲球進行表面消毒1 min左右，用無菌蒸餾水浸泡3次，隨后用75%的酒精表面消毒l min左右，再用無菌蒸餾水浸泡3次，然后置于無菌離心管中震蕩制備成稻曲病菌的厚垣孢子的懸浮液，并用無菌蒸餾水將厚垣孢子懸浮液稀釋成10倍梯度的孢子液，用移液槍吸取l00 μL不同梯度的孢子液分別涂布在含有100 μg/mL頭孢霉素的土豆葡萄糖培養基（Potato dextrose agar，PDA）上置于28℃的恒溫培養箱中進行培養，逐日觀察分離結果，待菌落長出后，挑取單個菌落。對所有成功分離獲得的菌株進行編號，保存在-20℃冰箱中。

1.2.2 dsRNA的提取和純化 挑取目標菌株GZ-14-07，在PDA培養基上培養7-10 d。將菌株GZ-14-07的菌絲體在液氮冷凍條件下用碾缽研磨成粉末狀，裝入無菌離心管中。每0.4 g樣品中依次加入600 μL 2×GPS、600 μL苯酚（Tris-HCl 飽和，pH 8.0）、600 μL氯仿-異戊醇（24∶1）和138 μL 10% SDS，劇烈振蕩。使之充分混勻，12 000 r/min 4℃離心10 min。然后取上清液約600 μL，加入0.04 g CF-11纖維素粉末和114 μL無水乙醇，混勻后4℃冰浴過夜。然后離心機12 000 r/min離心5 min后棄上清液，倒扣濾紙上吸干殘液，移液器加入600 μL清洗緩沖液，混勻后靜置1 min；重復洗脫3次后，加入640 μL 1× STE，混合搖勻，12 000 r/min離心8 min并吸取600 μL上清液至新的無菌離心管中，加入1/10體積的3 mol/L NaAc，加入1倍體積的異丙醇，充分混勻后于-20℃冰箱中靜置2 h，12 000 r/min 4℃離心30 min，去除上清液，加入500 μL 75%乙醇，振蕩無菌離心管，將沉淀彈起，清洗沉淀，12 000 r/min 4℃離心5 min后棄去上清液，用移液槍吸去管底的多余液體，風干沉淀10 min，加入20 μL DEPC-H2O，沉淀溶解完全得到菌株GZ-14-07中的真菌病毒。用DNase I（RNase free，TaKaRa，Dalian，China）和S1核酸酶（TaKaRa，Dalian，China）處理樣品，去除樣品中的DNA和單鏈RNA（single-stranded RNA，ssRNA）污染。樣品在1%瓊脂糖凝膠中電泳，用0.1 μg/mL溴化乙錠染色，紫外下觀察UvRV6的條帶特征。

1.2.3 cDNA合成和分子克隆 將純化的dsRNA樣品作為模板，采用隨機引物擴增法獲得了UvRV6的隨機序列［26］。病毒末端克隆的方法參考Potgieter等采用的方法［27］，首先在dsRNA的兩末端加上一段已知序列的接頭片段，然后將加上接頭的dsRNA進行反轉錄合成cDNA第一條鏈，最后用與該序列互補的一段寡核苷酸作為引物，另一引物根據已測定序列設計，進行逆轉錄-聚合酶鏈反應（Reverse transcription-polymerase chain reaction，RT-PCR）獲取dsRNA末端的序列。將擴增的cDNA產物與pMD18-T載體（TaKaRa，Dalian，China）進行連接，并熱激轉化大腸桿菌DH5α，鑒定陽性克隆，進行測序分析。

1.2.4 序列拼接和系統進化分析 得到的序列被組裝并上傳GenBank數據庫中，獲取的登錄號為KX171636。序列拼接、分析和比對使用DNAMAN 7.0和COBALT web 服務器（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/cobalt/cobalt.cgi?link_loc=BlastHomeLink）；序列同源性搜索使用NCBI網站的在線BLAST程序（https：//blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi）。系統進化樹的構建使用的是鄰接法（Neighbor-Joining，NJ）。NJ樹的計算使用MEGA6.0軟件［28］，采用默認參數設置，重復抽樣次數為1 000。用DotKnot程序預測RNA假結［29］。

2 結果

2.1 UvRV6的條帶類型

水稻稻曲病菌株GZ-14-07中提取的真菌病毒，經DNase I和S1核酸酶處理，在1%瓊脂糖凝膠電泳檢測可見到在6 kb附近有一條單一的明顯的dsRNA條帶（圖1），命名為Ustilaginoidea virensRNA virus 6（UvRV6）。

2.2 UvRV6序列分析

UvRV6全長5 043個堿基（圖2），G+C含量為48.8%。通過隨機引物擴增法得到UvRV6的隨機片段（圖2中1-15），經過DNAMAN 7.0軟件進行序列拼接，發現并不能完全拼接出一條完整的全基因組序列。隨后，根據已獲取的基因組序列設計特異性的搭橋引物A-F，通過PCR克隆出未獲得的基因組序列，最后通過DNAMAN 7.0軟件拼接得到一條完整的UvRV6基因組序列。

圖1 菌株GZ-14-07的1%瓊脂糖凝膠電泳檢測圖

2.3 UvRV6的全基因組序列

UvRV6含有兩個開放閱讀框（ORF1和ORF2）（圖3）。ORF1起始于第222位堿基，終止于第2 505位的UGA密碼子，全長2 280個堿基，編碼760個氨基酸（79.6 kD）。ORF2起始于第2 502位的AUG密碼子，終止于第4 991位堿基，全長2 385個堿基，編碼830個氨基酸（91.5 kD）。5'和3'末端非翻譯區分別長222個堿基和52 個堿基。通過BlastP比對分析顯示ORF1與全病毒科維多利亞屬病毒的衣殼蛋白（CP）有很高的相似性，尤其是與Ustilaginoidea virensRNA virus 3（UvRv3）的衣殼蛋白（CP）的同源性達到73%；ORF2與全病毒科維多利亞屬病毒的依賴于RNA的RNA聚合酶（RdRp）有顯著的相似性，跟UvRV3的依賴于RNA的RNA聚合酶（RdRp）同源性高達75%。因此，UvRV6的ORF1編碼病毒的衣殼蛋白（CP），ORF2編碼病毒的依賴于RNA的RNA聚合酶（RdRp），UvRV6是全病毒科維多利亞屬中的一員。四核苷酸（AUGA）將ORF1和ORF2連接起來，它包含ORF1的終止密碼子（UGA）和ORF2的起始密碼子（AUG），在全病毒科維多利亞屬中這4個核苷酸（AUGA），能啟動一種叫翻譯終止后又重新啟動翻譯（Termination and reinitiation）的機制使ORF1和ORF2被融合成一個大的開放閱讀框（ORF）（圖3）。

圖2 UvRV6的克隆策略示意圖

圖3 UvRV6的翻譯終止后又重新啟動翻譯機制

2.4 系統進化樹構建

為了構建UvRV6的系統進化樹，我們選擇了21株全病毒科成員，包括4株Totivirus、9株Victorivirus、3株Leishmaniavirus、3株Trichomonasvirus和2株Giardiavirus。基于選擇的21株全病毒科成員 和UvRV6的RdRp區 域，運 用MEGA6.0軟 件中的鄰接法構建系統進化樹。從系統進化樹得知，UvRV6跟其他的全病毒科（Totiviridae）維多利亞屬（Victorivirus）的病毒成員匯集在一起，屬于全病毒科維多利亞屬的新成員。尤其跟Ustilaginoidea virensRNA virus 3（UvRV3）的親緣關系最近（圖4）。

2.5 UvRV6和相關病毒在病毒大小及其他結構方面的比較分析

圖4 UvRV6的系統進化樹

表1 UvRV6和相關病毒在病毒大小和其他結構方面的比較分析

選擇6個已報道的從U.virens中分離的全病毒科維多利亞屬的真菌病毒，在大小及其他結構方面的一些特征與UvRV6進行比較（表1）。與其他6個真菌病毒相比，UvRV6顯示出一些異同點。由表1可知UvRV6的基因組全長5 043個堿基，其他成員的基因組都在5 000 個堿基左右，基因組的長度相差不大；UvRV6的兩個ORF框的重疊區域是四核苷酸（AUGA），而其他成員的ORF框重疊區域是五核苷酸（UAAUG），顯示出UvRV6和這6個全病毒科維多利亞屬的真菌病毒中都存在翻譯終止后又重新啟動翻譯（Termination and reinitiation）的機制，但是它們的重疊區域不同；通過對UvRV6和維多利亞屬的這6個真菌病毒分析，發現這些真菌病毒的5'末端和3'末端分別有5個核苷酸是較保守的序列，其中UvRV6的5'末端是GGGCU，U. virensRNA virus 5、U. virensRNA virus 1 strain Uv0901和U.virensRNA virus 1 strain JYH-ZT是UGAAA，U. virensRNA virus L和U. virensRNA virus 3是CGAAA，U.virensRNA virus 1 strain HNHS-1是UAAUG，UvRV6的5'末端與這幾個病毒相比都是不同的；UvRV6的3'末端是CAUCG，U. virensRNA virus 5是UCAAA，U. virensRNA virus L是UUUUU，U. virensRNA virus 3是GCCAA，U. virensRNA virus 1 strain Uv0901和U. virensRNA virus 1 strain JYH-ZT是GGCAA，U.virensRNA virus 1 strain HNHS-1是ACAAA，UvRV6的3'末端與這幾個病毒相比都是不同的，從UvRV6的ORF框重疊區域和5'末端，3'末端與其他病毒相比沒有相同的地方，顯示了UvRV6在基因組結構上的獨特性。BlastP分析表明，UvRV6的衣殼蛋白（CP）與U. virensRNA virus 3的同源性最高為73%，與其他病毒的同源性為38%-39%；UvRV6的依賴于RNA的RNA聚合酶（RdRp）與U. virensRNA virus 3的同源性最高為75%，與其他病毒的同源性分別為31%-38%。另外，UvRV6和其他6個病毒都有合成H型假結或莖環的結構。

3 討論

在很多病毒的基因表達過程中存在一種叫程序性核糖體移碼（Programmed Ribosomal Frameshifting，PRF）的蛋白質翻譯調節機制，常見的類型包括，-1程序性核糖體移碼機制（-1PRF）和+1程序性核糖體移碼機制（+1PRF）。-1PRF機制的產生需要兩個主要的信號元件，一個是七聚體核糖體移碼序列（XXX_YYY_Z，XXX=（AAA，TTT，CCC，GGG），YYY=（AAA，UUU），Z=（A，U，C））；另一個是能刺激程序性-1PRF的RNA二級結構序列，即一個“莖環”或“假結”結構；目前研究表明，+1PRF機制的產生只需要一個六聚體核糖體移碼序列元件（UUU_CGN，N=A，U，G，C）［32］。然而，在真菌病毒的全病毒科（Totiviridae）維多利亞屬（Victorivirus）成員中，由連續的終止密碼子和起始密碼子序列（如AUGA，UAAUG）和上游一個“莖環”或“假結”結構構成的-1程序性核糖體移碼機制，這種機制也被稱為內部起始機制［9，33］。

在UvRV6的ORF1和ORF2之 間，我 們 發 現AUGA移碼序列和上游莖環結構序列（小寫字母表示形成莖的堿基對）：（GAUGCggccAcagcCACUgcugg gccUGCGCCGCAAGUAUGA）的存在。另外，UvRV6的BlastP比對結果，表明UvRV6中ORF1與全病毒科維多利亞屬病毒的衣殼蛋白（CP）非常相似，其中，跟Ustilaginoidea virensRNA virus 3（UvRv3）的衣殼蛋白（CP）有73% 的同源性。Phomopsis vexansRNA virus（PvRV）的衣殼蛋白（CP）有66%的同源性。ORF2也與全病毒科的依賴于RNA的RNA聚合酶（RdRp）有顯著的相似性，包括跟UvRV3的依賴于RNA的RNA聚合酶（RdRp）同源性為75%。Phomopsis vexansRNA virus（PvRV）的依賴于RNA的RNA聚合酶（RdRp）同源性為51%和Nigrospora oryzaevictorivirus 1（NoV1）的依賴于RNA的RNA聚合酶（RdRp）同源性為50%。從UvRV6的ORF1和ORF2跟全病毒科維多利亞屬的衣殼蛋白（CP）和依賴于RNA的RNA聚合酶（RdRp）的相似性來看，可以推測出UvRV6屬于全病毒科維多利亞屬中的新成員。新的真菌病毒的發現，以及獲取真菌病毒的全基因組序列并對其進行分類學研究，能豐富真菌病毒資源庫，并提升對真菌病毒分類和進化方面的認識。

4 結論

UvRV6屬于全病毒科維多利亞屬的新成員，全長5，043個堿基，含有兩個開放閱讀框（ORF1和ORF2）。ORF1 長2，280個堿基，760個氨基酸（79.6 kD），編碼衣殼蛋白（CP）；ORF2 長2 385個堿基，830個氨基酸（91.5 kD），編碼依賴于RNA的RNA聚合酶（RdRp）。UvRV6的ORF1和ORF2之間存在由AUGA移碼序列和上游莖環結構序列構成的-1程序性核糖體移碼信號元件。