耐鹽堿溶磷菌Y2R2的分離鑒定及溶磷特性

楊海霞 劉希旻 潘奕臣 趙香林 黃海東

（天津農學院 農學與資源環境學院，天津 300384）

土壤鹽漬化是影響農業產量的主要因素之一，全球鹽漬土壤面積已達9.5×108hm2，其中由于灌溉、施肥不當及城市融雪等人類活動造成的次生鹽漬化日益嚴重［1-3］。鹽漬土及堿性環境下，大量磷元素轉化為難溶性的磷酸鹽而被土壤固定，從而出現土壤鹽堿化和“遺傳學缺磷”并存的現象，新施入磷肥的當季作物利用率低，造成土壤的潛在磷庫雖很大，但有效磷含量卻很低，植物很難直接吸收利用［4-5］。前人研究發現，自然界中存在大量具有溶磷能力的微生物，這類溶磷微生物能分泌有機酸、磷酸酶或以其他方式將被土壤固定的難溶性磷轉化為植物可利用的有效磷［6］。將溶磷菌制成菌劑在農田中施用，能在不增加土壤磷庫的情況下，提供更多的磷元素供作物生長，溶磷菌還能改善土壤的鹽堿條件，增加土壤微生物群落多樣性，通過在作物根際的繁殖而抑制其他病原菌的生長，從而減輕作物病害［7］。目前篩選到溶磷能力較強的細菌包括芽孢桿菌屬（Bacillus）、節桿菌屬（Arthrobacter）、曲霉屬（Penicillium）和假單胞菌屬（Pseudomonas）的一些菌株［8］，這些溶磷菌大多從耕作土壤或植物根際中篩選得到［9-10］，對鹽堿土壤的適應能力較差。鹽堿土壤中有一些優勢的種群，如鹽單胞菌屬（Halomonas）。這種革蘭氏陰性無芽孢的細菌大多可以耐受12%以上的鹽度［11］，但目前鹽堿土壤中鹽單胞菌屬溶磷特性的研究還未見報道。

天津濱海新區屬于海積平原地貌，土壤長期受到海水和風暴潮的浸蝕，地下水位高，排水不暢，形成高鹽堿度的濱海鹽漬土［12-13］，是耐鹽堿微生物篩選的理想采樣地。本實驗從天津濱海新區鹽堿土中分離到一株耐鹽堿溶磷菌Y2R2，對該菌株進行了分類鑒定，并研究了其溶磷特性，旨為今后制作耐鹽堿溶磷菌劑提供菌種資源及濱海鹽堿地改良和解決鹽堿土壤固磷強度高的問題提供支持。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試劑 土樣采自于天津濱海新區鹽堿地土壤，北緯39°4'46''，東經117°41'37''。細菌基因組DNA提取試劑盒，Taq酶，質粒提取試劑盒，普通DNA產物純化試劑盒，pGM-T克隆試劑盒均等購自北京天根公司，鉬酸銨、丙酮酸鈉、抗壞血酸等均為分析純。

1.1.2 培養基 R2A培養基（g/L）：酵母膏0.5，蛋白胨0.5，酸水解酪素0.5，磷酸氫二鉀0.3，葡萄糖0.5，可溶性淀粉0.5，丙酮酸鈉0.3，硫酸鎂0.05，氯化鈉20，瓊脂15，pH 9.0±0.2。無機磷培養基（g/L）：葡萄糖10，硫酸銨0.5，酵母浸粉0.5，氯化鉀0.3，硫酸鎂0.3，硫酸亞鐵0.03，硫酸錳0.03，磷酸三鈣5，瓊脂15，氯化鈉20，pH 9.0±0.2。

1.2 方法

1.2.1 耐鹽堿溶磷菌的篩選 取10 g鹽堿地土樣，加入90 mL無菌水渦旋振蕩10 min，靜置5 min后將上層懸液進行倍比稀釋，取100 μL涂布于pH 9.0、鹽度4%的R2A培養基平板上，30℃培養72 h，篩選耐鹽堿細菌，分離純化的耐鹽堿菌再轉接到無機磷固體培養基上，篩選有溶磷圈的菌落，分離純化后保藏于-80℃冰箱中。

1.2.2 菌株的形態學及生理生化特征測定 使用JEM1230透射電子顯微鏡進行菌株的形態學觀察；接觸酶、脲酶、七葉苷水解、生長的溫度、pH和NaCl范圍等生理生化指標的測定參考文獻［14］進行；使用BioMérieux公司的API ZYM試劑條測定19種酶的活性。

1.2.3 菌株的16S rDNA基因序列測定及系統進化分析 利用細菌DNA提取試劑盒提取試驗菌株的基因組DNA，采用細菌16S rDNA擴增通用引物27F和1492R進行PCR擴增，程序為95℃預變性5 min；94℃變性45 s，59℃退火45 s，72℃延伸1 min，共30個循環；72℃延伸10 min。PCR產物進行瓊脂糖凝膠電泳檢測后，用DNA產物純化試劑盒純化PCR產物，與pGM-T載體連接后，轉化至TOP10感受態細胞中，在含 IPTG和X-Gal的LB平板上37℃過夜培養，挑取白色單菌落，驗證并送上海生工進行測序。將得到的16S rDNA序列與GenBank中的核酸數據進行BLAST比對，得到與其同源性較高的對照菌株及序列，采用軟件Clustal X1.83進行多序列比對分析［15］，得到序列之間的相似值；用軟件Mega 6計算出序列的系統進化距離，采用鄰位相連法構建進化樹［16］，Bootstrap值為1 000。

1.2.4 菌株Y2R2的全基因組測序及分析 提取菌株Y2R2的基因組DNA，在北京百邁客公司的Nanopore和Illumina平臺進行文庫構建和基因組測序，測得4 221 Mb的原始數據，通多過濾接頭、短片段及低質量數據后，共得到4 146 Mb的Clean Data，測序深度為847 X，拼接得到0 gap的菌株Y2R2基因組完成圖。參考文獻［17］的方法進行平均核苷酸一致性（Average Nucleotide Identity，ANI）和DNA-DNA雜交（DNA-DNA hybridization，DDH）分析。

1.2.5 全細胞脂肪酸分析 按照Sasser［18］的方法進行樣品的提取、皂化、甲基化和萃取，使用Agient 7890氣相色譜儀檢測脂肪酸組分，參考MIDI Sherlock細菌系統數據庫進行分析鑒定。

1.2.6 可溶性磷含量的測定 取1.0 mL發酵液，于4℃，8 000 r/min離心5 min，取上清液稀釋至合適倍數，用鉬藍比色法測定可溶性磷的含量［19］，計算公式如下：Y=m×15.91A，式中Y為發酵液中可溶磷含量（mg/L），m為稀釋倍數，A為660 nm處吸光度值。

1.2.7 數據處理 可溶磷含量的測定，每個處理3個重復，采用Excel 2016進行數據分析和作圖。

2 結果

2.1 耐鹽堿溶磷菌的篩選

在天津濱海新區鹽堿地土壤中分離得到多株耐鹽堿細菌，將這些菌種轉接到無機磷固體培養基上，篩選得到1株耐鹽堿溶磷菌（圖1），命名為Y2R2，進一步試驗表明該菌株可以耐受的最高pH為14，NaCl濃度為15%，具有較強的耐鹽堿性能。

圖1 菌株Y2R2產生的溶磷圈

2.2 菌株Y2R2的分類鑒定

2.2.1 菌株Y2R2的形態特征 在R2A培養基平板上30℃培養2 d，菌株Y2R2形成邊緣整齊的乳白色菌落，質地均勻、邊緣整齊，直徑1.5-2.3 mm。菌株Y2R2的細胞大小為0.4-0.7 μm × 1.7-2.6 μm，桿狀，無鞭毛（圖2），革蘭氏陰性。

圖2 菌株Y2R2的細胞形態（5000×）

2.2.2 菌株Y2R2的16S rDNA序列測定及系統進化分析 擴增得到菌株Y2R2的16S rDNA序列，長度為1 460 bp，在GenBank/EMBL/DDBJ中的序列登記號為MK660018。將該序列在GenBank數據庫中進行BLAST比對，得到與其同源性高的序列信息，進而進行Clustal X1.83比對，并利用軟件MEGA 6的鄰位相連法構建系統進化樹（圖3），結果表明菌株Y2R2屬于鹽單胞菌屬（Halomonas），與Halomonas huangheensisBJGMM-B45劃分在同一個簇內，與該菌株的同源性也最高，為98.1%。

2.2.3 菌株Y2R2的全基因組測序及分析 菌株Y2R2的基因組長度為4 895 267 bp，在GenBank/EMBL/DDBJ中的登記號為CP038437，基因組數據分析表明菌株Y2R2的G+C含量為57.02 mol%，基因組中非編碼RNA中有rRNA 15個，tRNA 65個；基因組中編碼基因為4 286個，總長度4 327 563 bp，編碼基因的平均長度為1 010 bp；有33個磷酸酶相關的編碼基因，其中有2個堿性磷酸酶編碼基因。利用ANI分析，可以從全基因組水平評估菌株Y2R2與同屬中相似菌株的親緣關系，將菌株Y2R2與16S rDNA序列最接近菌株H. huangheensisBJGMM-B45的基因組數據（CP013106）進行ANI分析，按照BLAST（ANIb），MUMmer（ANIm）和OrthoANIu三種算法，ANI數值分別為74.9%，84.7%和75.1%，均小于95%的新菌判定閾值。按照基因組間距離計算（Genome-to-genome distance calculator，GGDC）方法，進一步將菌種Y2R2與H.huangheensisBJGMM-B45的基因組進行digital DDH分析，數值為22.2%。

圖3 菌株Y2R2的16S rDNA序列系統進化樹

2.2.4 菌株Y2R2的全細胞脂肪酸分析 全細胞脂肪酸分析是細菌化學分類鑒定的重要指標，菌株Y2R2的細胞脂肪酸分析結果如圖4所示，經MIDI Sherlock全自動細菌鑒定系統分析，菌株Y2R2所含脂肪酸主要有C16：0（29.4%），C19：0 cyclo w8c（18.4%），C18：1 w7c/C18：1 w6c（17.8%），C16：1w7c/C16：1w6c（8.3%）；而與Y2R2同源性最高的菌株H. huangheensisBJGMM-B45的細胞脂肪酸組成主要為：C18：1w7c（32.4%），C16：0（24.6%），C19：0 cyclo w8c（12.6%），C16：1w7c/C16：1w6c（11.1%），C12：0 3-OH（7.8%），C12：0（5.2%）。二者在占比最高的脂肪酸組分上不同，分別為C16：0和C18：1w7c，在其他細胞脂肪酸比例和組成上也有明顯差別，說明Y2R2與菌株H. huangheensisBJGMM-B45在化學分類指標上不同。

圖4 菌株Y2R2的全細胞脂肪酸分析

2.2.5 菌株Y2R2的生理生化特征 菌株Y2R2的生長溫度范圍為10-45℃，生長的NaCl范圍為0-15%，生長的pH范圍是5-14。該菌株的其他生理生化指標如表1所示，可以看出菌株Y2R2的脲酶為陽性；酯酶（C14）為弱陽性；酪蛋白水解、酪氨酸利用、胰凝乳蛋白酶、β-半乳糖苷酶、α-甘露糖苷酶、α-葡萄糖苷酶、α-半乳糖苷酶和β-葡萄糖苷酶為陰性；菌株Y2R2的這些生理生化指標與H. huangheensis均不同。結合形態學、生理生化、基于16S rDNA系統進化、全基因組數據和細胞脂肪酸分析，確定菌株Y2R2為鹽單胞菌屬的一個新種。

2.3 培養時間對菌株Y2R2溶磷量的影響

將菌種Y2R2接種于無機磷液體培養基中，每12 h取樣1次，檢測發酵液pH、細胞濃度和上清液中的可溶磷含量，結果如圖5所示，菌株Y2R2在發酵培養48 h達到最高菌量，細胞濃度為2.6×109CFU/mL，隨著培養時間的增加，Y2R2培養液的pH也隨之逐漸降低，36 h的pH為5.0，此后發酵液的pH穩定在5.0左右，隨著發酵液pH的降低，溶磷量隨之增高，在36 h出現溶磷量降低的現象，是由于此時菌株Y2R2處于對數生長期，快速繁殖的細胞需磷增加，將發酵液中的可溶磷重新攝入胞內。在48 h培養液中的可溶磷含量達到最高167.9 mg/L，48 h后由于細胞代謝活力的降低，菌株Y2R2的溶磷量開始下降。

表1 菌株Y2R2與H. huangheensis的生理生化特征比較

圖5 培養時間對菌株Y2R2溶磷量的影響

2.4 NaCl濃度對菌株Y2R2溶磷量的影響

在NaCl濃度0-18%的培養條件下，檢測培養48 h的發酵液，可以看出菌株Y2R2可以耐受較高的鹽濃度（圖6），當培養基中含有9%的NaCl時，細胞濃度為不含NaCl對照的91.3%，說明該菌株具有良好的耐鹽性能。當NaCl濃度在12%以下時，發酵終點的pH均在5.8以下，且具有較好的溶磷效果，在9%的NaCl濃度時可溶磷含量最高，為239.2 mg/L。當鹽濃度達到15%，菌株Y2R2的生長被抑制，可溶磷含量為9%鹽度時的13.4%。

2.5 初始pH對菌株Y2R2溶磷量的影響

為研究菌株Y2R2在鹽堿條件下的溶磷能力，在NaCl濃度9%，初始pH為7-14的無機磷液體培養基中進行發酵培養，結果如圖7所示，可以看出菌株Y2R2的最適生長pH為8，在pH 9時細胞濃度為中性條件下的100.8%，pH 13時細胞濃度為中性條件下的70.6%。

圖6 NaCl對菌株Y2R2溶磷量的影響

在初始pH 7-9的范圍內，發酵終點pH為5.1-5.4，具有較高的溶磷量，最高為pH 8時的247.6 mg/L；在初始pH 13時的溶磷量為115.4 mg/L，說明菌株Y2R2在鹽堿條件下具有較強的溶磷能力。

3 討論

圖7 初始pH對菌株Y2R2溶磷量的影響

本研究從天津濱海新區鹽堿土中分離得到菌株Y2R2，基于16S rDNA的分子分類標準［20］及基因組、生理生化和全細胞脂肪酸的多相分類鑒定結果，試驗菌株與H. huangheensis等［21］鹽單胞菌屬的模式菌種都存在明顯不同，鑒定該菌株是鹽單胞菌屬的一個新種。鹽單胞菌屬是Vreeland等［11］根據從太陽能海水制鹽廠分離到的菌株Halomonas elongata提出的，屬于變形菌門（Proteobacteria），γ-變形菌綱（Gammaproteobacteria），海洋螺菌目（Oceanospirillales），鹽單胞菌科（Halomonadaceae）的一個屬，革蘭氏陰性桿菌，能在0.1%-20%的NaCl濃度下生長，常在鹽堿土、工業鹵水和深海等高鹽環境中分離得到［22-23］。王永妍等［24］研究表明在養殖海水中，鹽單胞菌屬在細菌種群中占比11.4%，是主要的優勢菌屬，汪輝等［25］從連云港贛榆附近海泥中分離到鹽單胞菌GY1，任世英等［26］從黃海海域分離到鹽單胞菌YSR-3。鹽單胞菌屬的一些菌株在降解芳香族污染物，生物脫氮和多糖合成方面均有潛在的應用價值，但在溶磷方面的應用尚未見報道。本研究分離得到的鹽單胞菌Y2R2具有耐鹽堿和溶磷能力，為該菌屬提供了新的微生物資源。

施用微生物菌肥是鹽堿土壤生物改良的重要措施，鄭曉梅等［27］將分離得到的黑曲霉制成菌劑，施加到實驗室的鹽堿土壤中，56 d后土壤的pH值降低0.86-1.60，含鹽量也下降；楊美英等［28］將含腸桿菌屬NDW1和沙雷氏菌屬NDW3的外源溶磷菌液施用在鹽堿土中，盆栽試驗表明水稻的凈光合速率提高，產量增加。目前微生物菌劑種類繁多，在不同類型土壤上的應用效果相差較大，施入外來菌劑后，菌劑中的微生物在土壤中能否存活及繁殖數量受很多因素影響，如土壤環境變化的干擾、與土壤中其他土著微生物的生態位競爭等［29］，外來菌株在鹽堿土壤中的定殖就更為困難。天津鹽堿地有4.9×105hm2，其中濱海新區鹽堿程度最重，鹽分主要以氯化物為主，土壤物理性狀差，植物生長受到不同程度的影響［30］。本研究篩選到的菌株Y2R2是濱海新區鹽堿土中的土著微生物，能較好地適應當地土壤和氣候環境，后續將研究其菌劑對土壤和植物生長的影響，探索一種改良濱海鹽堿土壤，增加土壤養分，并促進作物生長的方法。

本研究發現，鹽單胞菌Y2R2可以在鹽堿條件下將難溶性無機磷化物轉變為植物可吸收利用的可溶性有效磷。細菌對難溶性無機磷的解磷機制，普遍認為是細胞向胞外分泌的各種有機酸降低了外界環境的pH，從而產生酸解效應［31］。本實驗中，在發酵液初始pH 10以下時，接入菌種培養48 h后，發酵液的pH均在5.7以下；在NaCl濃度12%以下時，發酵48 h后的pH均在5.6以下，說明試驗菌株在鹽堿條件下可產酸，從而造成難溶磷酸鹽的酸解。由于鹽單胞菌Y2R2的全基因組測序已經完成，從基因組功能注釋和代謝分析可以找到與丙酮酸合成相關的基因5個，順烏頭酸酶編碼基因5個，檸檬酸合成酶編碼基因3個，蘋果酸脫氫酶編碼基因2個，葡萄糖醛酸合成所需的葡萄糖脫氫酶編碼基因2個。鑒于鹽單胞菌屬菌株產生有機酸的種類和溶磷機制還未見報道，菌株Y2R2與溶磷相關的有機酸合成種類和含量，還需要進一步的試驗測定，特別是鹽堿對這些有機酸合成的調控機制需要進行深入研究。本研究篩選到的的菌株具有較高的耐鹽堿和溶磷能力，為濱海鹽堿地的土著微生物新種，能夠更好地適應本地土壤和氣候環境，有望用于溶磷菌劑的制備，為濱海鹽堿地改良和解決鹽堿土壤固磷強度高的問題提供了優良菌種。

4 結論

菌株Y2R2為革蘭氏陰性桿菌，其16S rDNA序列與鹽單胞菌屬其他菌株的最高同源性為98.1%，基因組ANI和DDH值均小于新菌判定的閾值，結合生理生化和全細胞脂肪酸數據分析，鑒定菌株Y2R2是鹽單胞菌屬的一個新種。菌株Y2R2的生長溫度范圍為10-45℃，具有一定的耐鹽堿能力，在0-15%的NaCl范圍，5-14的pH范圍內均可生長。菌株Y2R2在pH 8和NaCl濃度9%的無機磷培養基中，發酵48 h溶磷能力最高，達到247.6 mg/L。