內含子編碼蛋白Mg2+結合位點功能分析及驗證

崔古貞 陳相好 洪偉 張崢嶸 綦廷娜 陳崢宏

（1. 貴州醫科大學基礎醫學院，貴陽 550025；2. 遵義醫科大學第三附屬醫院（遵義市第一人民醫院），遵義 563002；3. 貴州省普通高等學

校病原生物學特色重點實驗室，貴陽 550025；4. 貴州省分子生物學重點實驗室，貴陽 550004）

II型內含子（Group II intron）是一類反轉錄轉座子（Retrotransposon），在細菌、古細菌以及真核生物葉綠體和線粒體基因組中廣泛存在，尤其以細菌中最為普遍［1-4］。目前，通過現代基因組測序已鑒定了數千種細菌II型內含子，在鑒定的細菌II型內含子中，研究最為詳細的主要包括兩類，第一類是來源于乳酸乳球菌（Lactococcus lactis，Ll.LtrB）的嗜中溫II型內含子［5-9］，另一類是來源于Thermosynechococcus elongatus及Geobacillus stearothermophilus的嗜高溫II型內含子［2，10-12］。以此兩類II型內含子為基礎，利用其“歸巢”機制，已開發出了高效基因打靶技術——Targetron技術（中溫型）和Thermotargetron技術（高溫型），并在多種微生物基因工程中獲得廣泛應用［13-19］。

II型內含子由內含子RNA和內含子編碼蛋白（Intron encoded protein，IEP）兩部分組成，其中內含子編碼蛋白IEP具有DNA聚合酶、反轉錄酶、核酸內切酶等多種酶活性，在II型內含子“歸巢”過程中發揮重要功能［20-21］。其“歸巢”過程主要包括：首先，內含子RNA與內含子編碼蛋白相互識別，組裝為有活性的核糖核蛋白復合體（Ribonucleoprotein）。然后，內含子RNA通過堿基互補配對原則識別雙鏈DNA靶位點。IEP蛋白在內含子RNA的輔助下，利用其自身的核酸內切酶活性反向剪切雙鏈DNA，形成雙鏈DNA缺口。然后，IEP蛋白的反轉錄酶活性，以切口處的3'-OH斷端為引物，以內含子RNA為模板，反轉錄合成互補cDNA，再以新合成的cDNA為模板，通過DNA聚合酶活性合成雙鏈DNA，最后通過DNA修復機制，實現內含子在靶位點的“歸巢”［9，19，21］（圖1）。

在整個內含子“歸巢”過程中，高濃度Mg2+是保證其功能的重要條件，這也是II型內含子在真核生物細胞內效率極低的主要原因（真核生物細胞核內Mg2+濃度較低）［7-8，22-23］。IEP蛋白反轉錄酶活性在II型內含子的“歸巢”過程中發揮重要功能，其Mg2+結合位點是影響其反轉錄功能的關鍵催化位點，如果能克服其依賴高濃度Mg2+的缺點，便有可能將II型內含子廣泛應用于真核細胞的遺傳改造。因此，為了研究Mg2+結合位點對II型內含子“歸巢”效率的影響，本研究利用生物信息學手段篩選影響IEP與Mg2+結合的關鍵氨基酸催化位點，并利用基因工程手段對其進行定點突變，最后，構建突變型Targetron載體，在大腸桿菌中驗證其功能，旨為深入研究II型內含子“歸巢”機理奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試劑 高保真DNA聚合酶、T4 DNA連接酶、

圖1 II型內含子“歸巢”示意圖

DNA Marker、DNA loading buffer購自北京全式金公司，DNA純化及回收試劑盒、質粒提取試劑盒、快速定點突變試劑盒購自天根生化科技有限公司，蛋白胨、酵母膏、氯化鈉，瓊脂糖、異丙基硫代半乳糖苷（IPTG）、5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷（X-gal）、氨芐青霉素購自北京索萊寶科技有限公司，限制性內切酶購自賽默飛公司，其他常用生化試劑均購自國藥集團化學試劑公司。

1.1.2 儀器 WD-9413B成像儀、DYY-7C型電泳儀、Legend Micro 17R冷凍高速離心機、K960 PCR儀。

1.1.3 引物 本研究所用引物均由上海生物工程有限公司合成，引物序列見表1。

1.1.4 菌株及質粒 本研究所用菌株及質粒見表2。

1.2 方法

1.2.1 菌株的培養 本研究所用的大腸桿菌DH5α和BL21（DE3）均在37℃、LB液體或固體培養基中培養，氨芐青霉素使用濃度為100 μg/mL，藍白斑篩選時加入X-gal（40 μg/mL）和IPTG（0.1 mmol/L）進行篩選。

表1 本研究用到的引物

表2 本研究用到的菌株及質粒

1.2.2 生物信息學分析 利用NCBI中的保守結構域數據庫（Conserved Domain Databse，CDD），以來源于乳酸乳球菌Ll.LtrB的內含子編碼蛋白序列為基礎進行序列比對，分析保守的關鍵氨基酸位點，篩選與Mg2+結合的可能氨基酸殘基。

1.2.3 定點突變 以IEP-F/IEP-R為引物擴增野生型IEP獲得其DNA產物，并與pMD19T連接得到載體pMD19T-IEP，以載體pMD19T-IEP為模板，利用定點突變引物進行定點突變PCR，擴增體系為：模板pMD19T-IEP 1 μL，正向及反向突變引物均為2 μL，5×buffer 10 μL，DNA Polymerase 1.5 μL，加ddH2O至總體積為50 μL，PCR擴增條件為：95℃ 30 s，（95℃ 30 s，55℃ 20 s，72℃ 4 min）15個循環，72℃5 min。反應結束后加入1 μL的DpnI限制性內切酶，37℃條件下反應1 h去除模板質粒，隨后轉化大腸桿菌DH5α，菌落PCR結合測序進行驗證，最終獲得含有IEP突變位點的載體pMD19T-M-IEP（圖2）。

1.2.4 Targetron載體構建 利用NheI和BglII雙酶切質粒pMD19T-M-IEP，與經同樣酶切的載體pSY7-lacZ-635s、pSY7-lacZ-1063分別連接，連接體系為：載體1 μL，目的片段4.5 μL，T4 DNA ligase buffer 2 μL，T4 DNA ligase 0.5 μL，加ddH2O至總體積10 μL，25℃反應1 h后轉化感受態細胞E. coliDH5α，菌落PCR結合DNA測序驗證突變型Targetron載體pSY7-M-lacZ-635s/1063a（圖2）。下文所用到的突變型Targetron載 體pSY7-M3-lacZ-635s/1063a、pSY7-M4-lacZ-635s/1063a、pSY7-M5-lacZ-635s/1063a，其中M3表示IEP D308A單點突變，M4表示IEP D309A單點突變，M5表示IEP D308A/D309A雙點突變。

1.2.5 打靶效率檢測 將突變型Targetron載體pSY7-M-lacZ-635s/1063a與及野生型Targetron載體pSY7 -lacZ-635s/1063a分別轉化大腸桿菌BL21（DE3）感受態細胞，復蘇后加入5 mL的LB液體培養基（含100 μg/mL 氨芐青霉素），37℃、180 r/min培養12 h。取50 μL過夜培養的菌液加入5 mL含100 μg/mL 氨芐青霉素的LB液體培養基中，37℃、200 r/min條件下培養1 h，隨后加入IPTG使其終濃度為0.5 mmol/L，誘導45 min，以不同濃度的稀釋度涂布LB固體培養基（含氨芐青霉素100 μg/mL、X-gal 40 μg/mL、IPTG 0.1 mmol/L），37℃過夜培養，菌落PCR結合藍白斑篩選計數計算其“歸巢”效率（歸巢效率=白斑/白斑+藍斑×100%）。

1.2.6 菌落PCR驗證 以lacZ基因打靶位點外側引物進行菌落PCR驗證，分別檢測平板上的藍色菌落及白色菌落，進一步驗證IEP蛋白反轉錄結構域突變后對打靶效率的影響。

2 結果

2.1 IEP蛋白生物信息學分析

在NCBI數據庫中，以乳酸乳球菌Ll.ltrB的IEP蛋白序列（HQ263410.1）為模板進行序列比對及分析，發現細菌II型內含子反轉錄酶具有極其保守的YADD序列（圖3），結構預測表明其兩個毗鄰的天冬氨酸殘基（DD）與Mg2+結合，可能是負責反轉錄功能的關鍵催化位點。因此，本研究選擇這兩個天冬氨酸殘基為靶點，即D308和D309兩個位點，構建突變型IEP蛋白突變體。

2.2 Mg2+結合位點突變對Ⅱ型內含子“歸巢”效率的影響

圖2 突變型IEP蛋白構建及打靶效率檢測

圖3 IEP蛋白生物信息學分析

為了驗證D308A、D309A、D308A/D309A突變對II型內含子“歸巢”效率的影響，將突變型IEP蛋白取代Targetron載體上的野生型IEP蛋白，構建Mg2+結合位點突變的Targetron載體，同時以野生型Targetron載體作為對照，分別轉化大腸桿菌BL21（DE3），IPTG誘導后涂布含有Xgal和IPTG的平板，過夜培養后通過菌落PCR（圖4）及藍白斑篩選（圖5-A），分析IEP蛋白Mg2+結合位點突變對Ⅱ型內含子“歸巢”效率的影響。研究結果表明，野生型Ⅱ型內含子在大腸桿菌中針對lacZ-635s位點的“歸巢”效率為90.845%±6.792%，針對lacZ-1063a位點的“歸巢”效率為92.582%±2.898%［24］；然而，將IEP蛋白反轉錄結構域Mg2+結合位點（D308A、D309A、D308A/D309A）突變后，平板均為藍斑，菌落PCR驗證其靶位點也沒有任何內含子插入，其“歸巢”效率均降低為0%（圖4-5）。此結果表明，IEP蛋白反轉錄結構域Mg2+結合位點突變，失活了IEP蛋白的反轉錄功能，使Ⅱ型內含子不能以內含子RNA為模板合成cDNA而插入到DNA靶位點，即II型內含子完全失去其“歸巢”功能。

3 討論

細菌Ⅱ型內含子因其極高的“歸巢”效率，目前已被設計為高效基因打靶工具，在革蘭陰性細菌、陽性細菌中獲得廣泛應用。盡管在真核生物甚至人類細胞中也能夠實現基因打靶功能［26-28］，但由于真核生物細胞核中Mg2+濃度較低，極大影響了其打靶效率，限制了其廣泛應用。

內含子編碼蛋白IEP在內含子“歸巢 ”過程中發揮著重要的功能。IEP蛋白是由4個相對獨立的結構域組成，包括：反轉錄結構域（RT）、成熟酶結構域（X）、DNA結構域（D）、核酸酶結構域（EN），此4個結構在功能上和空間上相對獨立［1，8，29］。因此，突變其中一個結構域對其他結構域的影響相對較小。本研究通過突變RT結構域的Mg2+結合位點，獲得了失活反轉錄功能的IEP蛋白，理論上對其他結構域的功能影響可能不大，這為深入研究II型內含子的功能提供了前提。

圖4 突變型II型內含子功能驗證

圖5 藍白斑篩選及“歸巢”效率比較突變

此外，在以前工作中，我們已篩選到C164和Y208兩個位點也是影響II型內含子“歸巢”的核心催化位點，該位點突變后其“歸巢”功能也完全喪失［24］，與本研究篩選的D308和D309位點具有相似的功能。然而，在IEP反轉錄過程中，C164和Y208兩個位點分別與底物NTP和模板DNA結合，而D308和D309位點是與Mg2+結合，因此，D308和D309位點突變對其他結構域功能的影響可能比C164和Y208位點小。在后續研究中，我們以構建的Mg2+結合位點突變體為基礎，發現該位點不但能失活II型內含子的“歸巢”功能，而且還能在靶位點引入DNA損傷（數據尚未發表），表明D308和D309位點突變對II型內含子識別、切割DNA靶位點的影響較小，與C164和Y208位點突變相比，可能更有利用于II型內含子結構的穩定［29］。眾所周知，靶向DNA損傷恰是基因編輯的前提［30］，預示本實驗構建的突變型II型內含子可能具有基因編輯的潛能，因此，本實驗構建的Mg2+結合位點突變體將為深入研究Ⅱ型內含子的功能及應用奠定良好的基礎。

4 結論

本實驗利用生物信息方法及定點突變技術，篩選并構建了IEP蛋白反轉錄結構域Mg2+結合位點突變體（D308A和D309A單點突變，D308A/D309A雙點突變），并以大腸桿菌為基礎，體內分析了IEP蛋白Mg2+結合位點突變對II型內含子“歸巢”效率的影響，結果表明，Mg2+結合位點突變完全失活了II型內含子的“歸巢”功能。