植物Hsp90s與耐熱性關系的研究進展

湯佳樂 徐海 苑平 何科佳 王仁才 卜范文

（1. 湖南省農業科學院園藝研究所，長沙 410125；2. 湖南農業大學，長沙 410128；3. 國家農業農村部華中地區果樹科學觀測站，

長沙 410125）

由于全球變暖及不可避免的氣候變化，預計在不久的將來會使全球平均氣溫增加3-5℃［1］。隨著預測的氣溫上升，熱應激成為了培育氣候適應性作物的重要性狀。由于日氣溫和季節性氣溫的頻繁起伏而引起的長時間熱浪事件對世界范圍內的農業生產帶來了嚴重的挑戰，影響到植物的生長和產量，估計每年損失高達數十億美元［2］。因此，鑒于人口不斷增加，耕地和自然資源不斷減少，提高作物的耐熱性已成為一個緊迫的問題，而不僅僅是一個研究主題。

熱激蛋白（Heat shock proteins，Hsps）是一種具有高度保守的蛋白質家族，它廣泛分布于從原核生物到真核生物的各種生物體中［3］。在高溫脅迫條件下，熱激蛋白會在短時間大量表達積累，參與植物熱應激應答反應，在維持植物細胞的穩定中發揮著重要的作用。據報道，熱激蛋白具有伴侶活性［4］。這些熱激蛋白也被稱為分子伴侶蛋白，在其他幾種輔伴侶蛋白的幫助下，它們與部分折疊或變性的蛋白質結合，阻止其自我聚集或促進它們以ATP依賴和獨立的方式正確折疊。這些熱激蛋白大致分為兩大類，即低分子量和大分子量的熱激蛋白，根據相應蛋白質的大小分為5大類：Hsp100/Clp、Hsp90、Hsp70、Hsp60/chaperonin和sHsps［5］。在正常情況下，它們具有許多細胞功能，如（1）新合成的蛋白質折疊或協助折疊（Hsp70和Hsp60）；（2）引導蛋白跨細胞膜和細胞間室之間的轉運（Hsp70）；（3）阻止寡聚蛋白的聚集、分離和展開（Hsp70、Hsp100、Hsp90和sHsps）；（4）促進不穩定蛋白的降解（Hsp70和Hsp100）；（5）信號分子的形成、信號轉導和轉錄因子的轉錄激活（Hsp70和Hsp90）［6］。

研究已證明，Hsp90s在控制細胞周期、細胞生存、激素和其他信號通路等多個細胞過程中起著至關重要的作用。Hsp90s在細胞蛋白中是組成性表達，但在非生物脅迫下（主要是高溫脅迫），其表達進一步增加了幾倍［7-8］。在細胞對脅迫的反應中扮演重要的角色，是維持細胞內環境穩定的關鍵因素。因此，在熱脅迫條件下開展植物Hsp90s的鑒定與分析和功能研究，對正確認識熱應激反應的信號轉導，熱脅迫基因的表達調控和提高植物的耐熱性具有重要的意義。本文從Hsp90s的結構、Hsp90s與植物耐熱性兩個方面綜述近幾年Hsp90s分子機理的研究進展，旨為推動植物熱激蛋白的研究奠定一定的基礎。

1 Hsp90s的結構

Hsp90s是分子量大小約為90 kD的熱激蛋白家族，它具有高度的保守性和穩定性及分布廣泛的特點［9］。從不同植物中分離鑒定出的細胞器特異性Hsp90，酵母和動物的氨基酸同源性為63%-71%。在擬南芥中，4個AtHsp90位于細胞質上（AtHsp90-1到AtHsp90-4），而AtHsp90-5、AtHsp90-6和AtHsp90-7分別位于質體、線粒體和內質網上。

Hsp90s主要是以同型二聚體存在，具有3個結構域：高度保守的N端結構域（NTD，～25 kD）、中間結構域（MD，～40 kD）、C端結構域（CTD，～12

kD）［10］。N端結構域包含ATP結合位點，具有內源的ATP酶活性，該位點是Hsp90內源性ATP酶活性弱的原因。中間結構域是底物蛋白結合的主要位點，通過一段高電荷連接區連接到N-末端結構域。C端結構域是二聚化的結合位點，也是鈣調蛋白和其他底物蛋白結合位點。在真核生物細胞中，Hsp90s的C端有一個保守的MEEVD結構基序，該基序負責與含共伴侶的四肽重復結構域（Tetratricopeptide repeat domain，TPR）相互作用。在真核生物中，細胞質Hsp90存在兩種亞型，即誘導型α型和組成型β型，并且至少一種亞型在功能上對生物體生存至關重要［11］。由于其在不同的物種中相對分子質量的差異，這些Hsp90s同源基因有著不同的名稱（如Hsp80、Hsp81、Hsp82、Hsp83、Hsp84和Hsp90等）。通 過分析Hsp90s基因的氨基酸序列可以揭示其亞細胞定位。這可能是由于在N端或C端區域存在可區分的氨基酸特殊基序，即細胞溶質特異性Hsp90亞型的C端MEEVD基序和內質網特異性Hsp90亞型的C端HDEL基序，而葉綠體和線粒體特異性Hsp90亞型的N端信號肽序列特殊性延伸［12］。

2 Hsp90s與植物耐熱性

植物在高溫脅迫條件下，蛋白質的折疊過程受到很大的影響，從而導致錯誤折疊蛋白的繁殖和蛋白質功能障礙。為了緩解蛋白質的錯誤折疊反應，自然界開發了高效的植物分子伴侶機制，通過增加已有的分子伴侶水平和通過信號機制表達額外的伴侶來維持細胞內的高質量蛋白質［13］。植物在熱激逆境條件下能夠誘導Hsps基因的表達，其中許多Hsps基因作為分子伴侶防止蛋白質變性和維持體內蛋白平衡，如果沒有這些分子伴侶的幫助，活細胞中的許多蛋白質不能正常折疊［14］。然而，Hsp90s是一類在熱應激條件下對維持細胞功能起重要作用的分子伴侶［15］。它們在植物的營養和生殖生長過程中起著重要的作用，調節著植物對各種生物和非生物脅迫的反應。在熱脅迫條件下，Hsp90s在行使分子伴侶的功能、表達調節模式、生長發育過程及參與耐熱性方面發揮重要作用。

2.1 Hsp90s分子伴侶功能

當植物體處在有害或極端的環境條件下，它們的細胞會激活并大量產生一類熱激蛋白，這類熱激蛋白也稱為分子伴侶蛋白。它們是蛋白質穩定網絡的重要組成部分，保護和保捍衛細胞蛋白質免受傷害。研究表明，Hsp90s是具有分子伴侶功能的一類蛋白質家族［16］。Hsp90s作為分子伴侶與其他輔助蛋白協同工作，共同構成了伴侶蛋白復合物的重要組成部分。它們和輔助蛋白與錯誤折疊的蛋白相結合，防止分子蛋白的聚集和后續的再折疊、協助新合成蛋白的正確折疊、維持蛋白質功能穩定及促進異常蛋白的降解，在規避惡劣的生長環境條件下發揮著重要的作用。Song等［17］通過分析5個AtHsp90基因在酵母菌中的表達發現，細胞溶質AtHsp90-1和AtHsp90-2具有與酵母相似的伴侶功能，在適宜和不適宜溫度下都能支持酵母突變體的生長。在熱脅迫條件下，細胞溶質AtHsp90s能穩定溫度敏感的Hsp90突變株的生物膜。該研究結果揭示了細胞溶質AtHsp90s作為分子伴侶具有在熱應激條件下穩定植物細胞穩定的功能。Kravats等［18］研究發現酵母中純化的Hsp90突變體蛋白在與Hsp70和輔伴侶蛋白（Hop）的協同作用下，在蛋白重塑方面存在缺陷。該研究證實，Hsp90與Hsp70和其他蛋白協同作用，在蛋白質折疊中起關鍵性作用，使蛋白質受體能自行折疊。Cha等［19］研究發現Hsp90與輔伴侶分子Dgp23與相互作用，通過抑制蘋果酸脫氫酶的熱聚集，在植物的耐熱性方面起重要作用。此外，Hsp90還能與其他蛋白協同作用，如Hip（Hsp70相互作用蛋白）和Hsp40等，它們在其他細胞重塑反應中相互協作，在熱脅迫條件下蛋白的修復和細胞的存活均發揮積極的作用［20］。

2.2 熱脅迫條件下Hsp90s表達調節模式

高溫脅迫擾亂細胞的穩定性，造成細胞正常代謝受阻，導致植物生長遲緩或者細胞死亡，嚴重影響植物的生長發育，如果發生在開花期間，則更容易受到傷害。高等植物無法適應長期遭受超過45℃的高溫［21］。在高溫脅迫條件下，植物細胞中蛋白質失去生物活性可能歸因于蛋白質聚集或蛋白質錯誤折疊或兩者都有［22］。應激誘導的聚集和錯誤折疊蛋白的積累過程是不可逆的，而且對細胞功能造成傷害。為了平衡熱脅迫下細胞中蛋白質穩定，植物細胞上調了幾個熱誘導基因，通常稱為“熱激基因”（Heat shock genes，HSGs），這些熱激基因的表達和積累，使植物在高溫下存活［23-24］。

植物在受到高溫脅迫時，細胞內的蛋白質不能維持正常的折疊結構，產生大量的解折疊結構的蛋白質。植物為了減輕解折疊結構蛋白質的反應，Hsp90s等熱激蛋白信號通路在細胞環境中被激活。在正常情況下，Hsp70（或Hsp90及多伴侶復合體）與熱激轉錄因子（Heat shock factor，Hsf）相互作用而使Hsf處于鈍化的單體狀態。Hsf是植物體內細胞調節熱激反應的一類主要轉錄因子。在熱激反應時，植物細胞內熱激蛋白（Hsps）與解折疊的蛋白相結合，使Hsf形成三聚體并轉移到細胞核，并與熱激元件（Heat-shock element，HSE）結合啟動Hsps基因的轉錄，產生并積累Hsps。在熱激反應減弱時，高濃度的Hsps能降低Hsf與細胞DNA結合的活性，促進Hsf三聚體的解聚，于是Hsps又與Hsf相結合，使其恢復為鈍化的單體狀態，關閉Hsf的活性，抑制Hsps的過度合成（圖1）［25］。張海［26］對水稻中的9個Hsp90基因進行了表達量分析，OsHsp90-2和OsHsp90-4在熱激脅迫的表達上調，并將它們轉化大腸桿菌發現均能夠提高轉化菌株的細胞活性和增強高溫逆境條件下的耐受力。因此，Hsp90s參與了植物的熱脅迫條件下的表達的調節，并通過產生和積累Hsps增強了植物的耐熱性，從何使植物細胞維持正常的生理行為。

2.3 Hsp90s與植物的生長發育

圖1 熱激條件下Hsp90s表達調節模式圖

目前，Hsp90s在植物生長發育方面的作用早已被公認。在正常情況下，Hsp90s在細胞內含量豐富，約占細胞總蛋白的 1%-2%，在細胞中呈高組成性表達［27］。在沒有脅迫的條件下，甘藍型油菜種子在發育和萌發過程中，Hsp90具有很高的表達量，表明了Hsp90在種子發育和萌發過程中起到了重要的作用［28］。Sable等［29］對5個陸地棉基因型的微陣列數據分析顯示，在纖維發育的不同階段，GhHsp90基因的轉錄水平較高，進一步的研究表明Hsp90在棉纖維的分化和發育中起著至關重要的作用。Wang等［30］對小麥中細胞質Hsp90基因進行了系統測定，并通過病毒誘導的基因沉默（Virus induced gene silencing，VIGS）降低TaHsp90.1基因的表達發現，對小麥幼苗生長有明顯的抑制作用，該研究證實了細胞質Hsp90基因參與了幼苗的生長發育。此外，在熱激和其他應激條件，Hsp90s可以進一步誘導其表達。在正常條件下，經抗生素處理的擬南芥種子在12日齡幼苗的時候可以激活Hsp90的合成［31］。AtHsp90-1是擬南芥中唯一可以被誘導的Hsp90成員，該基因在生長活躍期組成性表達水平較低，但在成熟的種子的胚胎中強烈地表達［32］。與組成型Hsp90突變體相比，AtHsp90-1系中不能存活種子和有缺陷胚的比例更大，且部分幼苗早死或生長發育遲緩［33］。這表明，可誘導的AtHsp90-1是植物穩定生長和形態正常所必需的，尤其在胚的形成和種子成熟的時期。同樣，敲除AtHsp90-3的突變體導致擬南芥開花推遲［34］，敲除AtHsp90-5的突變體導致擬南芥的胚發育受損和種子活力喪失［35］，AtHsp90-7的缺失導致擬南芥的莖、花和根分生組織紊亂，花器官增多，花粉管加厚伸長［36］。研究發現，Hsp90還具有調控氣孔發育的功能。擬南芥Hsp90的相關突變體，通過熱激處理可以抑制氣孔的發育，并且Hsp90可以通過MAPK信號通路調節正常和高溫條件下氣孔的起始和形成，調控氣孔的發育［37］。

Hsp90s也被認為是形態學進化的標志［38］。這表明，Hsp90s具有管家蛋白的功能［39］。Neuwald等［40］研究發現Hsp90在熱脅迫下參與了植物的不同功能，如生物量的增加、結莢、減少脂質過氧化和葉綠素的損失。Sangster等［41］對模式植物擬南芥Hsp90的抑制發現擬南芥表型結構發生了改變，Hsp90的降低影響了開花時間和總結實率等生長發育過程中的多種數量性狀，增加了形態多樣性，降低了重復性狀的發育穩定性。總之，我們認為在許多不同刺激的環境條件下，Hsp90對植物生長發育反應性具有全面性的影響。

2.4 Hsp90s參與植物耐熱性

不斷升高的溫度對地球生態環境產生了深遠的影響，任何溫度的升高都會對植物的生長和產量產生負面影響。在過去的10年里，組學研究顯示，在高溫脅迫條件下熱激蛋白受到了不同的調節。Song等［42］在ABA、PEG、NaCl、低溫和高溫脅迫條件下，對煙草Hsp90s的表達模式進行了分析發現，高溫脅迫對煙草Hsp90s的誘導作用最強。Agarwal等［43］通過對比耐熱和熱敏基因型鷹嘴豆的根、葉、花器官中的Hsp90基因表達量，發現耐熱型鷹嘴豆的各個組織中Hsp90基因的表達量比熱敏型鷹嘴豆均有上調，并且在熱敏基因型鷹嘴豆中也能誘導Hsp90基因表達。這表明Hsp90s基因參與熱脅迫的響應過程。同樣，許多模式植物和農作物（擬南芥、煙草、水稻、大豆、葡萄、番茄和香蕉等）中，Hsp90s基因在熱脅迫條件的響應已被鑒定，并已被證實參與調節耐熱性［44-45］。

此外，研究表明，Hsp90s的成員常被發現熱脅迫反應中上調［46］。在高溫脅迫條件下，OsHsp90.1和AtHsp90的誘導量最大［47-48］。在大腸桿菌中，水稻OsHsp90-2過表達能夠提高細胞活力，顯著提高植株的在熱脅迫條件下的耐熱性［49］。同樣，12個大豆的GmHsp90基因在高溫脅迫下均能被強烈誘導，其中5個GmHsp9基因的過表達增加了擬南芥對熱脅迫的耐受性［39］。Huang等［50］利用轉基因大豆中GmHsp90A2過表達的穩定系和CRISPR/Cas9系統產生的突變系研究發現，過表達GmHsp90A2的T3轉基因大豆植株通過提高葉綠素含量和降低丙二醛（Malondialdehyde，MDA）含量，表現出更高的耐熱性。相反，T2純合敲除GmHsp90A2突變體葉綠素含量降低，MDA含量增加，耐熱性下降，進一步證明GmHsp90A2是正向調節植株的耐熱性。同樣，在擬南芥中敲除AtHsp90-1突變體使植株的耐熱性降低［51］。但是，也有證據表明，Hsp90的過表達可以降低植物細胞的耐熱性。在擬南芥中，AtHsp90.3的過表達降低了植物對熱脅迫的耐受性，表明Hsp90的穩態性在植物的細胞應激反應和熱脅迫耐受性方面至關重要［52］。這可能是Hsp90的過量表達誘導Hsf的下調，導致細胞的耐熱性降低的原因［53］；也可能是植物耐熱機理是受多個基因的協調調控，不是受到單個Hsp90基因的影響。Hsp90s基因與其他熱激蛋白基因家族協同作用，使植物細胞適應高溫脅迫的作用，維持細胞內環境穩定。

3 展望

高溫脅迫是影響植物生長發育，降低作物產量的主要非生物脅迫之一。因此，提高作物的耐熱性等抗逆性已成為一個緊迫的問題。Hsp90s是參與植物熱應激條件下應答響應的一類重要的基因家族。目前，隨著測序技術的不斷發展和廣泛使用，在理解植物耐熱性這一復雜性狀方面取得的一個重要進展是越來越多的植物基因組序列信息的完成。但是對于不同植物基因組中的Hsp90s基因家族的鑒定、基因結構、系統發育關系、染色體定位等尚需要進一步深入研究和分析。因此，利用功能基因組學的方法，對植物Hsp90s基因家族進行分析，并對其功能進行精確的描述將成為新的重要研究方向。此外，大量可用的基因組數據的也使我們能夠識別參與熱脅迫應答潛在的順式調控元件和反式因子。同時，利用轉錄組數據分析植物Hsp90s基因在熱激條件下表達的差異，為進一步闡明植物Hsp90s的誘導產生與積累的分子機制奠定了重要的研究基礎，并為Hsp90s基因功能分析和植物耐熱抗性品種的栽培選育提供廣闊的應用前景。