梔子根莖枝不同部位藥效物質基礎研究*

蘇志堅 黃智鋒 楊成梓 陳 鳴 唐金模 陳雪梅 彭連共

梔子根為茜草科植物梔子GardeniajasminoidesEllis的干燥根，亦稱梔子花根，主產于湖南、浙江、福建、江西等省。民間別稱山里黃根、黃枝根、山枝根、三枝根等。《中華本草》載：“梔子根主治黃疸型肝炎、痢疾、膽囊炎、感冒高熱、吐血、衄血、尿路感染，尚可用于治療腎炎水腫、乳腺炎、風火牙痛、瘡癰腫毒、跌打損傷等”[1,2]。民間廣泛用于黃疸性肝炎、感冒高熱、出血吐血等病癥的治療。梔子根在我院使用較為廣泛，在我院肝病中心臨床診療中得到了較為充分的應用，是肝病中心的特色用藥，其療效得到了充分的肯定，同時有著較長的用藥歷史。目前藥材市場上供應的梔子根多混有部分莖、枝部位，時而出現混有較高比例莖、枝的藥材，且該現象較為普遍。本研究擬對梔子根、莖、枝不同部位的抗肝炎藥效物質基礎、藥理活性指標成分齊墩果酸開展研究，為規范梔子根的藥用部位，是否拓寬梔子根藥用部位，確保梔子根藥材質量提供一定的客觀依據。

1 儀器與試藥

1.1 儀器LC-20AT高效液相色譜分析儀(日本島津公司)； Platisil-C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)色譜柱；DFY-500型搖擺式高速中藥粉碎機(溫嶺市林大機械有限公司)；KQ-500DE數控超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)；電熱鼓風干燥箱(上海精宏實驗設備有限公司)；Milli-Q超純水系統(美國Millipore公司)； BSA224S電子分析天平(北京賽多利斯科學儀器有限公司)。

1.2 試藥對照品：齊墩果酸購自上海甄準生物科技有限公司(批號 ZZS18031601，質量分數≥98%)。試劑：甲醇(色譜級，國藥集團化學試劑有限公司)、乙腈(色譜級，國藥集團化學試劑有限公司)；磷酸(分析純，天津市福晨化學試劑廠)；水為超純水。藥材：梔子根樣品采集自福建廈門、泉州、漳州、寧德等地海拔約60～500 m的野生梔子，經福建中醫藥大學中藥鑒定教研室楊成梓教授鑒定為茜草科植物梔子GardeniajasminoidesEllis的干燥根，此外，還收集了梔子莖、梔子枝等梔子不同部位樣品，除去雜質，洗凈，切片后干燥，粉碎后過三號篩。以上樣品均保存于福建中醫藥大學藥學院生藥科研實驗室。梔子根、莖、枝樣品信息詳見表1。

表1 梔子根、莖、枝樣品信息表

2 實驗方法與結果

2.1 以齊墩果酸為參照指標的薄層色譜鑒別精密稱取過三號篩的各種樣品粉末1 g，放置帶塞錐形瓶中，準確加入4%的鹽酸甲醇溶液50 ml，稱定重量，加熱回流4 h，放置冷卻，濾過后，續取濾液25 ml，加水20 ml，蒸干甲醇至約20 ml，用三氯甲烷提取3次，每次20 ml，合并上述三氯甲烷液，揮干溶液，殘渣再加適量甲醇溶解，轉移至5 ml容量瓶中，加適量甲醇至刻度，搖勻后，即為供試品的溶液。另外，取齊墩果酸對照品，加入甲醇制備成每毫升中含0.5 mg的溶液，作為對照品備用。參照《中華人民共和國藥典》2015年版通則0502項下薄層色譜法，精密吸取上述兩種溶液各10 μl，分別點于同一塊硅膠G薄層板上，以環己烷-丙酮-乙酸乙酯(8∶1∶5)為展開劑，經展開后取出，晾干，再噴10%的硫酸乙醇溶液，薄層板在105 ℃溫度加熱至斑點清晰顯色。作為供試品的薄層色譜中，在相應的位置上，顯相同顏色的斑點。結果詳見圖1～圖3。

圖1 梔子根齊墩果酸薄層色譜鑒別圖

圖2 梔子莖齊墩果酸薄層色譜鑒別圖

圖3 梔子枝齊墩果酸薄層色譜鑒別圖

2.2 以齊墩果酸為參照指標的高效液相色譜定量評價

2.2.1 對照品溶液的制備精密稱取齊墩果酸對照品適量置5 ml量瓶中，加甲醇定容配置成對照品儲備液，再精密移取一定量對照品儲備液于量瓶中，加甲醇定容制成含齊墩果酸1428.00 μg/ml對照品溶液。對照品溶液置于4 ℃冰箱保存備用，臨用前經0.22 μm微孔濾膜濾過即得。

2.2.2 供試品溶液的制備齊墩果酸供試品溶液的制備：取梔子根樣品粉末(過三號篩)約1 g，精密稱定，放置帶塞錐形瓶中，準確加入4%的鹽酸甲醇溶液50 ml，稱定重量，加熱回流4 h，放冷，再稱定重量，用4%的鹽酸甲醇溶液補足減失的重量，搖勻，濾過，續取濾液25 ml，加水20 ml，蒸干甲醇至約20 ml，用三氯甲烷提取3次，每次20 ml，合并三氯甲烷液，溶液揮干，殘渣加適量甲醇溶解，轉移至5 ml量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，用0.22 μm微孔濾膜過濾即得。

2.2.3 色譜條件色譜柱：Platisil-C18柱(250 mm×4.6 mm,5 μm)；流動相：甲醇(A)-0.4%乙酸(B)，比例為97%A-3%B；流速為1 ml/min，等度洗脫15 min；柱溫30 ℃；進樣量為10 μl；檢測波長210 nm。該色譜條件下，齊墩果酸與其他相鄰峰的分離度大于1.5，理論板數不低于4000，對照品及樣品的色譜圖見圖4。

注：1.齊墩果酸圖4 齊墩果酸對照品(a)與梔子根樣品(b)HPLC圖

2.2.4 指標成分方法學考察

2.2.4.1 線性關系考察精密吸取“2.2.1”項下對照品溶液適量，用甲醇依次稀釋配制成11.16、22.31、44.63、89.25、178.50、357.00、714.00、1428.00 μg/ml的8個系列質量濃度的對照品溶液，按“2.2.3”項下相應色譜條件進樣測定。以對照品濃度(X，μg/ml)為橫坐標，以峰面積(Y)為縱坐標，進行回歸分析，得回歸方程Y=2110.6X-3358.7，r=0.9999。結果表明，在11.16～1428.00 μg/ml濃度范圍內，進樣量與峰面積值呈良好的線性關系。

2.2.4.2 精密度試驗準確吸取齊墩果酸對照品溶液，按上文“2.2.3”項下相應的色譜條件測定，連續進樣6次，計算各成分峰面積的RSD值。結果齊墩果酸的RSD為0.17%，表明儀器精密度良好。

2.2.4.3 重復性試驗精密稱取梔子根藥材粉末約1 g，按上文方法平行制備6份供試品溶液，并按上述色譜條件測定，測定各種成分含量，計算含量的RSD值。結果齊墩果酸的RSD為2.17%，表明該方法重復性良好。

2.2.4.4 穩定性試驗取同一供試品溶液，在0、2、4、8、16、24 h分別按上文中色譜條件進樣，記錄各種成分的峰面積，計算峰面積的RSD，結果齊墩果酸的RSD為0.45%，表明供試品溶液中齊墩果酸成分在 24 h 內穩定性良好。

2.2.4.5 加樣回收率試驗精密稱取已知含量的藥材粉末0.5 g，平行制備6份溶液，分別加入一定量的對照品溶液，按上文方法制備供試品溶液，按上文色譜條件測定，計算回收率及RSD。結果見表2。

表2 梔子根中齊墩果酸的加樣回收率試驗結果

2.2.5 含量測定精密稱取梔子根樣品、梔子莖樣品、梔子枝樣品粉末(樣品采自漳州龍海港尾)約1 g，按上文方法制備供試品溶液，按上文色譜條件進行測定，每個樣品平行3份，計算樣品中齊墩果酸的含量。結果見表3。

表3 梔子不同部位的含量測定結果

3 討論

梔子根在急性及傳染性肝炎的治療方面療效顯著，其作為福建地方常用傳統中藥，我院肝病中心于上世紀五六十年代即開始廣泛應用梔子根，歷史悠久。據不完全統計，2007—2014年我院門診藥房調劑使用梔子根每年800～1500 kg(不包含醫院制劑、中藥免煎顆粒)。肝病中心特色醫院制劑茵梔顆粒、復方梔子根顆粒、康氏抗纖方、康氏系列方等在廣大患者中享有較高的信譽，其處方均以梔子根為君藥配伍應用[3]。臨床用于治療慢性丙型肝炎的中成藥制劑松梔丸，其組方以梔子根為君藥配伍組成。梔子根用藥部位為梔子植株根部，不利于生態環境保護和可持續發展，且對藥材來源范圍局限性顯著；目前藥材市場上供應的梔子根常混有莖、枝等部位，時而出現混有較高比例莖枝的藥材。本實驗對梔子根、莖、枝等部位進行較為系統、全面的研究，以期為臨床提供品質良好、質量穩定的梔子根藥材提供實驗依據。

《福建省中藥飲片炮制規范》(2012年版)[4]梔子根鑒別項下，其薄層色譜鑒別法采用的對照品為梔子根對照藥材，在本實驗研究過程中無法采購到其對照藥材，故本實驗研究未選用梔子根對照藥材作為對照品。目前，《浙江省中藥炮制規范 》(2015年版)[5]、《湖南省中藥飲片炮制規范 》(2010年版)[6]等多省份《炮制規范》和藥材標準、或飲片標準中采用了齊墩果酸作為梔子根薄層色譜鑒別的參照指標，故本實驗研究采用齊墩果酸作為薄層色譜鑒別的參照指標。目前各省標準以齊墩果酸作為薄層色譜鑒別指標的方法步驟中，梔子根樣品需水解回流提取，操作復雜耗時長，且萃取過程中需要用到大量三氯甲烷，毒性較大，該方法尚需進一步優化。本研究顯示在以齊墩果酸為參照指標的薄層色譜中，在與對照品色譜相應位置上，梔子根、莖、枝均顯示相同顏色的斑點，表明梔子根、莖、枝均含有齊墩果酸成分。

HPLC法測定梔子根中齊墩果酸含量，樣品處理方法簡單、易于操作，重現性及穩定性良好，故可將齊墩果酸作為梔子根質量評價的依據。梔子根的主要藥效物質基礎研究目前還處于起步階段，目前研究文獻多以齊墩果酸醋酸酯對其質量進行控制，且由于齊墩果酸醋酸酯對照品的局限性，現有標準以及實驗研究中多通過將其水解為齊墩果酸，以齊墩果酸總含量對山里黃根質量進行評價。《湖南省中藥材標準 2009年版》[7]中以齊墩果酸為指標，通過薄層色譜法對山里黃根進行鑒別，并增加HPLC高效液相色譜法對其質量進行評價；伍城穎等[8]在《湖南省中藥材標準》HPLC法基礎上，對齊墩果酸醋酸酯提取水解方法進行改進，建立了更為簡單、易于操作的提取方法。本實驗方法中，選用齊墩果酸含量作為對梔子根質量評價依據，齊墩果酸對照品在210 nm 處有強吸收峰。色譜條件經遴選設定流動相為甲醇(A)-0.4%乙酸(B)，比例為97%A-3%B，等度洗脫15 min。流速為1 ml/min；柱溫30 ℃；進樣量為10 μl；檢測波長210 nm。該色譜條件下，齊墩果酸與其他相鄰峰的分離度均大于1.5，理論板數均不低于4000。課題組選擇齊墩果酸用于梔子根的質量評價的主要指標成分。

本研究在進行梔子根、莖、枝等不同部位中藥指紋圖譜質量控制模式實驗中，選用的對照品為齊墩果酸、山梔苷、去乙酰車葉草酸甲酯、雞矢藤次苷甲酯、綠原酸、隱綠原酸、羥異梔子苷，分析實驗結果提示，梔子的莖、枝與根樣品相似度在0.9以上，葉、果實、花與根的化學成分數量及含量相差較大，相似度均低于0.9，與梔子味苦，性寒，功效瀉火除煩、清熱利濕、涼血解毒；梔子根味甘、苦，性寒，功效清熱利濕、涼血止血，兩者主要功效有較明顯的差別相一致。肖日傳等[9]基于多波長HPLC-DAD比較梔子不同部位化學成分差異，結果也表明，梔子不同部位各成分含量差異較大，梔子根、莖與果實、葉差異明顯。

本實驗研究中齊墩果酸作為評價梔子根質量的指標性成分，為梔子不同部位的質量評價控制和梔子藥材資源的綜合開發利用提供實驗依據。實驗研究表明，梔子根、莖、枝3個部位中齊墩果酸均具有顯著差異，齊墩果酸含量順序為根>莖>枝，梔子根齊墩果酸含量較梔子莖相對接近。肖日傳等[9]研究提示，竹節參皂苷Ⅳa為梔子根中的主要化學成分之一，表現有一定的抗炎、鎮痛、抗腫瘤作用，同時可抗心律失常，對Ⅱ型糖尿病合并腦缺血/再灌注有保護作用等。在對梔子根指標成分齊墩果酸研究的基礎上，下一步須對梔子根的其他指標組分竹節參皂苷Ⅳa等進行研究，同時對梔子根、莖、枝不同部位進行藥效學實驗研究和臨床應用情況的調研及臨床使用病例的收集、整理、分析。中藥多為多組分協同作用發揮功效，梔子莖能否作為梔子根的來源，能否替代梔子根，擴大梔子根用藥部位，保護生態環境和資源可持續發展，尚有待下一步藥效學等多方面的探索和研究。