臨床孤立綜合征患者外周血T 細胞受體β鏈可變區多態性研究

吳巖 張紀紅 董會卿 李大偉 劉崢 萬歲桂

臨床孤立綜合征（CIS）是一種十分常見的中樞神經系統炎性脫髓鞘疾病，為中樞神經系統首次發作的單病灶或多病灶脫髓鞘事件，亦是復發-緩解型多發性硬化（RRMS）的早期階段［1-2］；常見損害部位包括視神經、腦干、腦室旁和脊髓等［2］。免疫系統尤其是T 淋巴細胞（包括CD4+T 細胞、CD8+T 細胞）在脫髓鞘疾病的致病過程中發揮重要作用，可以直接或通過分子模擬機制對髓鞘自身抗原發生反應而致病［3］。T 淋巴細胞的免疫活動基本通過T 細胞受體（TCR）實現，TCR 由αβ或γδ兩條肽鏈構成，TCR β鏈可變區（TCRVβ）具有高度特異性，可反映TCR 表達變化。在目前已公布的研究結果中，較少關注臨床孤立綜合征患者TCRVβ多態性，而且至今在TCR基因位點與臨床孤立綜合征之間亦未發現明確的遺傳與致病相關性［4］。本研究以首都醫科大學宣武醫院神經內科近年收治的30 例臨床孤立綜合征患者為觀察對象，分析其CD4+TCRVβ和CD8+TCRVβ多態性，初步預測特異性TCRVβ片段表達水平，并討論其對臨床孤立綜合征的診斷價值。

對象與方法

一、研究對象

1.納入與排除標準 （1）CIS 的診斷符合國際多發性硬化國際學會聯合會（IFMSS）2010 年診斷標準（McDonald 標準）中有關CIS 診斷標準。（2）入院前6 周內未曾使用過糖皮質激素，以及入院前3 個月未曾使用免疫抑制劑。（3）排除血常規、紅細胞沉降率檢查結果正常的急性或慢性感染性疾病、惡性腫瘤性疾病或其他自身免疫性疾病。（4）入組患者及其家屬對研究項目知情同意并簽署知情同意書。

2.一般資料 （1）CIS 組：2012 年9 月至2014 年3 月在首都醫科大學宣武醫院院神經內科住院治療且診斷明確的CIS 患者30 例，男性16 例，女性14 例；年齡11 ～66 歲，平均（37.17±16.07）歲。（2）正常對照組：同期在我院行健康體檢的30 例受試者為對照，年齡21 ～40 歲，平均（31.23±5.98）歲。兩組受試者性別（χ2= 0.067，P= 0.796）和年齡（t= 1.350，P=0.182）差異無統計學意義，具有可比性。

二、研究方法

1.材料與儀器 TCRVβ單克隆抗體試劑盒（貨號：IM3497，規格：25TEST，含TCRVβA～H 共8 支試劑）中Ⅰ抗工作液包括異硫氰酸熒光素（FITC）、藻紅蛋白（PE）或藻紅蛋白藍蛋白5.1（PECY5）標記的小 鼠 抗 人CD4、CD8 和TCR α β 單 克 隆 抗 體，以 及CD3 PerCP、CD8 APC、紅細胞裂解液和磷酸鹽緩沖液（PBS）均購自美國BD 公司。BY-600c 離心機由北京白洋醫用離心機有限責任公司提供，FACS Calibur 四色雙激光流式細胞儀購自美國BD 公司。

2.流式細胞術檢測 采集患者空腹時肘正中靜脈或貴要靜脈血2 ml 至EDTA 抗凝管，取1 支試管分 別 滴 加CD3-PerCP（20 μ l）、CD8-APC（5 μ l）和TCRVβ（5 μl，A ～H），加入經充分混勻的100 μl 抗凝血，搖勻、室溫避光20 min。加入2 ml 紅細胞裂解液，搖勻、室溫避光10 min，2600×g離心5 min，去上清、PBS 沖洗（×2），加入質量分數1%多聚甲醛溶液1 ml，搖勻、4 ～8 ℃冰箱保存，24 h 內上機檢測。流式細胞儀上機操作，發射激光采用氬離子激光器，功率15 mW，激發光波長488 nm，測定前以標準校正熒光微球校正儀器，每檢測管共收集10×103個細胞，其中FITC、PE、PECY5 熒光分別設定在1、2、3通道上。應用CELL Quest Pro 5.1 多功能數據獲取分析軟件獲得以下各項指標。（1）常規免疫學指標：包括淋巴細胞比例、T 淋巴細胞占淋巴細胞比例、CD4+T 細 胞 占T 淋 巴 細 胞 比 例、CD8+T 細 胞 占T 淋 巴細胞比例、CD4+T 細胞/CD8+T 細胞比值。（2）TCRVβ亞家族表達變化：檢測CD4+TCRVβ和CD8+TCRVβ所含24 個亞家族成員表達水平，分別為Vβ1、Vβ2、V β 3、V β 4、V β 5.1、V β 5.2、V β 5.3、V β 7.1、V β 7.2、Vβ8、Vβ9、Vβ11、Vβ12、Vβ13.1、Vβ13.2、Vβ13.6、Vβ14、Vβ16、Vβ17、Vβ18、Vβ20、Vβ21.3、Vβ22 以及Vβ23。以TCRVβ每個片段的表達水平≥10%為存在擴增，TCRVβ擴增程度分別以擴增個數（TCRVβ表達水平≥10%的片段個數）及擴增分數（TCRVβ擴增的各個片段表達水平之和）表示。

3.統計分析方法 采用SPSS 20.0 統計軟件進行數據處理與分析。計數資料以相對數構成比（%）或率（%）表示，行χ2檢驗。通過Kolmogorov-Smirnov法進行正態性檢驗，呈正態分布的計量資料以均數±標準差（x±s）表示，采用兩獨立樣本的t檢驗；呈非正態分布的計量資料以中位數和四分位數間距［M（P25，P75）］表示，采用Mann-WhitneyU檢驗。繪制受試者工作特征（ROC）曲線并計算曲線下面積（AUC）以 評 價TCRV β 片 段 對CIS 的 診斷價值，AUC>0.70 具有中等診斷價值、≤0.70 則具有低等診斷價值；計算TCRVβ片段診斷CIS 的靈敏度、特異度、陽性預測值、陰性預測值、Youden 指數（YI）。以P≤0.05 為差異具有統計學意義。

表1 CIS 組與正常對照組受試者外周血常規免疫學指標的比較（x±s，%）Table 1. Comparison of general immune index in peripheral blood between CIS group and normal control group (x±s, %)

結 果

流式細胞術檢測結果顯示，CIS 組與正常對照組受試者外周血淋巴細胞比例、T 淋巴細胞占淋巴細胞比例、CD4+T 細胞占T 淋巴細胞比例、CD8+T 細胞占T 淋巴細胞比例、CD4+T 細胞/CD8+T 細胞比值差異均無統計學意義（P>0.05，表1）。

在TCRVβ家族的24 個亞家族中，CIS 組患者外周血CD4+TCRVβ2、4、5.2、5.3、7.1、8、11、14、17、20、21.3 片段，以及CD8+TCRVβ4、9、11、14 片段表達水平與正常對照組之間差異均有統計學意義（P<0.05 或P< 0.01）；其 中 僅CD4+TCRV β 11 和CD8+TCRVβ9、11 片段表達水平低于正常對照組，其余亞家族片段表達水平均高于正常對照組（表2，3）。

在TCRVβ家族的24 個亞家族中，CIS 組患者CD4+TCRV β 2（P= 0.002）和CD8+TCRV β 14（P=0.010）兩個亞家族片段擴增者比例高于正常對照組且差異有統計學意義；兩組其余亞家族擴增者比例差異無統計學意義（均P>0.05；表4，5）。

兩組受試者總TCRVβ擴增者比例差異無統計學意義（P= 0.052），其中CIS 組患者外周血CD4+TCRVβ擴增者比例高于正常對照組（P=0.000），而CD8+TCRVβ擴增者比例與正常對照組差異無統計學意義（P=0.796，表6）。

CIS 組患者外周血TCRVβ擴增個數（P=0.001）和擴增分數（P=0.006）均高于正常對照組且差異有統計學意義。其中，CIS 組CD4+TCRVβ 擴增個數（P=0.000）和擴增分數（P=0.000）均高于正常對照組，而CD8+TCRVβ擴增個數和擴增分數與正常對照組間差異無統計學意義（均P>0.05；表7，8）。

表2 CIS 組與正常對照組受試者外周血CD4+TCRVβ 24 個亞家族表達水平的比較［M（P25，P75）］Table 2. Comparison of the quantitative expression of 24 subfamilies of CD4+TCRV β in peripheral blood between CIS group and normal control group [M (P25, P75)]

表3 CIS 組與正常對照組受試者外周血CD8+TCRVβ 24 個亞家族表達水平的比較［M（P25，P75）］Table 3. Comparison of the quantitative expression of 24 subfamilies of CD8+TCRV β in peripheral blood between CIS group and normal control group [M (P25, P75)]

表4 CIS 組與正常對照組受試者外周血CD4+TCRVβ 24 個亞家族擴增者比例的比較［例（%）］Table 4. Comparison of the frequency of amplification in 24 subfamilies of CD4+TCRVβ in peripheral blood between CIS group and normal control group [case(%)]

表5 CIS 組與正常對照組受試者外周血CD8+TCRVβ 24 個亞家族擴增者比例的比較［例（%）］Table 5. Comparison of the frequency of amplification in 24 subfamilies of CD8+TCRVβ in peripheral blood between CIS group and normal control group [case(%)]

將兩組受試者亞家族表達水平或存在擴增者比例具有統計學差異的片段，根據該片段表達水平，假設不同臨界點，獲得一系列診斷靈敏度和特異度：以靈敏度為縱坐標，1-特異度為橫坐標，繪制ROC 曲線。AUC 反映的范圍即為診斷準確性，AUC>0.70 則該片段診斷CIS 具有中等診斷價值，AUC ≤0.70 則具有低等診斷價值。結果顯示，CD4+TCRV β4 診斷CIS 的AUC 為0.719（95%CI：0.592 ～0.851，P= 0.003；圖1），靈敏度83.33%、特 異 度56.67%；CD4+TCRV β 14 診斷CIS 的AUC 為0.713（95%CI：0.581 ～0.845，P= 0.005；圖2），靈敏度70%、特異度56.23%；CD8+TCRVβ4 診斷CIS 的AUC為0.727（95%CI：0.600 ～0.854，P=0.002；圖3），靈敏度93.33%、特異度50%；以上3 個片段對CIS 均具有中等診斷價值。CD4+TCRVβ2 和CD8+TCRVβ14 這兩組亞家族表達水平及擴增者比例差異均有統計學 意 義，其 診 斷CIS 的AUC 分 別 為0.681（95%CI：0.543 ～0.819，P=0.016；圖4）、0.652（95%CI：0.512 ～0.792，P= 0.043；圖5），靈 敏度 分 別 為33.33%和43.37%，特異度為88.89%和54.55%，其對CIS 的診斷價值較低（表9）。

討 論

2005 年由國際臨床孤立綜合征研討會撰寫的《提示轉歸為多發性硬化的臨床孤立綜合征》將該綜合征大致分為3 種類型，即時間和空間均為孤立；時間孤立，空間多發；病變在同一部位反復出現，空間上是孤立的，時間上可為多次的［2］。其常見損害部位有：視神經、腦干、腦室旁以及脊髓等［5］，被認為是多發性硬化的早期階段。臨床孤立綜合征患者是否會進展為多發性硬化目前尚缺乏臨床證據證實［6-7］。有些研究通過對腦脊液或MRI 病灶等輔助檢查指標的觀察分析，預測疾病進展情況。Schwenkenbecher 等［1］對120 例臨床孤立綜合征患者進行為期24 ～87 個月的隨訪（中位隨訪時間47 個月），其中50 例（41.67%）后續進展為多發性硬化；腦脊液寡克隆區帶（OCB）陽性者73 例、陰性47 例，陽性者中40 例（54.79%）、陰性者中10 例（21.28%）進展為多發性硬化，OCB 陽性患者進展為多發性硬化的比例明顯高于陰性者，提示腦脊液OCB 檢測對臨床孤立綜合征的進展可能具有一定預測作用。研究顯示，MRI 異常的臨床孤立綜合征患者進展為多發性硬化的比例高達80%［8-9］。而且，在多發性硬化的早期階段TCRVβ擴增針對新抗原短暫性存在，當抗原刺激減弱后，相應細胞群凋亡繼而數目下降，致病主要抗原或反復出現的抗原使TCRVβ持續存在且擴增，隨著脫髓鞘疾病的進展，導致TCRVβ擴增比例可能增高［10-11］。故監測臨床孤立綜合征患者外周血TCRVβ擴增表達水平可能對其是否會進展為多發性硬化做出初步判斷。

表6 CIS 組與正常對照組受試者外周血TCRVβ擴增者比例的比較［例（%）］Table 6. Comparison of the amplification rate of TCRVβ in peripheral blood between CIS group and normal control group [case (%)]

表7 CIS 組與正常對照組受試者外周血TCRVβ擴增個數的比較［M（P25，P75）］Table 7.Comparison of the amplification number of TCRVβ in peripheral blood between CIS group and normal control group [M (P25, P75)]

表8 CIS 組與正常對照組受試者外周血TCRVβ擴增分數的比較［M（P25，P75）］Table 8. Comparison of the amplification percentage of TCRVβ in peripheral blood between CIS group and normal control group [M (P25, P75)]

TCR 是一種結構復雜的異二聚體，其將抗原片段識別為多肽，并與主要組織相容性復合物（MHC）結合［12］。T 淋巴細胞在發育過程中，表達TCRVβ的基因隨機重排，健康人TCRVβ一般呈現多樣性［13］，部分健康人會有1 個或以上TCRVβ克隆性擴增，并且與年齡存在一定關聯性，年齡越大，擴增片段數目越多，20 ～30 歲人群無克隆性擴增，40 ～50 歲有1 ～2 個克隆性擴增［2］；脫髓鞘患者至少存在1 個主要克隆性TCRVβ（占所有受體>10%）［14］。本研究結果顯示，正常對照組有17 例（56.67%）受試者出現TCRVβ擴增，CIS 組有24 例（80%）患者存在TCRVβ擴增，兩組TCRVβ擴增者比例雖無明顯差異，但正常對照組擴增者均為CD4+TCRVβ或CD8+TCRVβ單一片段擴增，而CIS 組則為CD4+TCRVβ和（或）CD8+TCRVβ多片段擴增；另外，CIS 組CD4+TCRVβ擴增者比例高于正常對照組，與Slansky 和Nakayama［15］研究所得出的T 淋巴細胞在脫髓鞘疾病自身免疫反應中CD4+TCRVβ擴增的結論相符。與此同時，CIS組擴增個數和擴增分數均顯著高于正常對照組，提示中樞性或周圍性免疫調節異常可導致髓鞘特異性T 淋巴細胞數目擴增至致病程度，產生更劇烈的免疫反應，進而導致炎性脫髓鞘疾病［16］。有研究表明，參與脫髓鞘疾病的T 淋巴細胞亞群主要為CD4+T 細胞［17］，T 淋巴細胞被認為是多發性硬化病理過程中的關鍵細胞，但是T 淋巴細胞在臨床孤立綜合征發生發展過程中的功能和抗原特異性尚不十分清楚［18］。

目前有關臨床孤立綜合征患者TCRVβ多態性的研究較為少見，相關研究的樣本量較小，且研究對象大多為白種人群。Démoulins 等［19］曾對1 例臨床孤立綜合征患者進行腦脊液檢測，其結果顯示，該患者存在TCRVβ13、TCRVβ15、TCRVβ20 ～23 克隆性擴增。Mandel 等［14］于12 例臨床孤立綜合征患者癥狀出現3 個月內采集外周血，并以片段表達數量占總片段數量的10%～50%作為克隆性擴增診斷標準，經檢測發現TCRVβ6 ～9 存在克隆性擴增，擴增率與健康對照組比較差異有統計學意義。然而，上述國外研究均未對CD4+TCRVβ和CD8+TCRVβ的克隆性擴增類型進行區分。本研究CIS 組患者CD4+TCRVβ2、4、5.2、5.3、7.1、8、11、14、17、20、21.3 片段，以及CD8+TCRVβ4、9、11、14 片段表達水平高于正常對照組，CD4+TCRVβ2、CD8+TCRVβ14 擴增者比例高于正常對照組，提示臨床孤立綜合征患者在TCRVβ擴增上具有特異性片段。Planas 等［20］對3 例多發性硬化患者進行外周血基因測序，結果顯示，CD8+TCRVβ4、CD4+TCRVβ5 序列存在顯著擴增，其中CD8+TCRVβ4 片段存在擴增與本研究結果相同，提示該片段可能對脫髓鞘疾病的診斷具有一定特異性；本研究CIS 組患者未檢出CD4+TCRVβ5 序列存在擴增，可能與診斷標準和檢測方法存在差異有關。另外，本研究CIS 組患者CD4+TCRVβ11 和CD8+TCRVβ9、11 片段表達水平均低于正常對照組，目前尚未在文獻中檢索到與本研究相類似的結果，其具體臨床意義有待進一步探究。

圖1 ROC 曲線顯示，CD4+TCRVβ4 診斷CIS 的AUC為0.719（95%CI：0.592 ～0.851，P=0.003）Figure 1. ROC curve showed that the AUC of CD4+TCRV β 4 in the diagnosis of CIS was 0.719 (95%CI:0.592-0.851, P=0.003).

圖2 ROC 曲線顯示，CD4+TCRVβ14 診斷CIS 的AUC為0.713（95%CI：0.581 ～0.845，P=0.005）Figure 2. ROC curve showed that the AUC of CD4+TCRV β 14 in the diagnosis of CIS was 0.713 (95%CI:0.581-0.845, P=0.005).

圖3 ROC 曲線顯示，CD8+TCRVβ4 診斷CIS 的AUC為0.727（95%CI：0.600 ～0.854，P=0.002）Figure 3. ROC curve showed that the AUC of CD8+TCRV β 4 in the diagnosis of CIS was 0.727 (95%CI:0.600-0.854, P=0.002).

圖4 ROC 曲線顯示，CD4+TCRVβ2 診斷CIS 的AUC為0.681（95%CI：0.543 ～0.819，P=0.016）Figure 4. ROC curve showed that the AUC of CD4+TCRV β 2 in the diagnosis of CIS was 0.681 (95%CI:0.543-0.819, P=0.016).

本研究所繪制的ROC 曲線提示，CD4+TCRVβ4、CD4+TCRVβ14、CD8+TCRVβ4 對臨床孤立綜合征具有中等診斷價值（AUC>0.70），表明通過外周血檢測對TCRVβ進行分型可能對臨床孤立綜合征的早期診斷具有重要價值，但這些片段的敏感性相對較高、特異性相對較低，而且這些片段表達水平的臨界值均未達到擴增水平，臨床應用價值有限。本研究CIS 組患者CD4+TCRVβ2 和CD8+TCRVβ14 這兩組亞家族表達水平及擴增者比例差異均有統計學意義，但其診斷臨床孤立綜合征的AUC ≤0.70，且敏感性較低，對于臨床孤立綜合征的早期診斷價值亦十分有限。然而，由于本研究樣本量較小，且未進行腦脊液和MRI 等相關輔助檢查，無法比較相關指標的關聯性，相關研究結論尚待進一步研究加以驗證。

圖5 ROC 曲線顯示，CD8+TCRVβ14 診斷CIS 的AUC為0.652（95%CI：0.512 ～0.792，P=0.043）Figure 5. ROC curve showed that the AUC of CD8+TCRV β 14 in the diagnosis of CIS was 0.652 (95%CI:0.512-0.792, P=0.043).

表9 TCRVβ亞家族對CIS 診斷效能的分析Table 9. Analysis of diagnostic efficiency of TCRV β subfamilies in CIS