CD4-CD8-雙陰性T 淋巴細(xì)胞在視神經(jīng)脊髓炎譜系疾病與多發(fā)性硬化中的表達(dá)差異

沙晶 楊麗娟 瑪依努爾·買買提 李紅燕

視神經(jīng)脊髓炎譜系疾病（NMOSDs）是一類主要由B 淋巴細(xì)胞（B 細(xì)胞）和抗體介導(dǎo)的中樞神經(jīng)系統(tǒng)自身免疫性疾病［1］，表現(xiàn)為視神經(jīng)和脊髓炎性脫髓鞘改變，以視神經(jīng)和脊髓同時或相繼受累為主要臨床特征，呈復(fù)發(fā)-緩解病程，在反復(fù)發(fā)作后可遺留嚴(yán)重的神經(jīng)功能缺損。多發(fā)性硬化亦是一類主要由細(xì)胞免疫介導(dǎo)的中樞神經(jīng)系統(tǒng)自身免疫性疾病，主要表現(xiàn)為白質(zhì)脫髓鞘改變［2］，因此NMOSDs 最初被認(rèn)為是多發(fā)性硬化（MS）的一種亞型［3］。然而，自2004 年Lennon 等［4］首次確認(rèn) 水 通道蛋白4（AQP4）抗體是NMOSDs 的特異性抗體以來，越來越多的學(xué)者意識到NMOSDs 的免疫學(xué)機(jī)制可能與多發(fā)性硬化并不一致。研究表明，淋巴細(xì)胞參與NMOSDs 發(fā)病與疾病演變的全過程，疾病早期T 淋巴細(xì)胞（T 細(xì)胞）浸潤靶器官和組織，隨著病情進(jìn)展至中晚期B 細(xì)胞介入并產(chǎn)生相應(yīng)抗體，誘導(dǎo)免疫炎癥反應(yīng)。CD4-CD8-雙陰性T 淋巴細(xì)胞（DNT）僅占外周血T 細(xì)胞的1%～2%［5］，主要由T 細(xì)胞受體αβ和γδ（TCRαβ和TCRγδ）等亞群組成，源自CD4+T 細(xì)胞和CD8+T 細(xì)胞或特殊細(xì)胞譜系［6］，可能參與不同自身免疫性疾病的發(fā)病機(jī)制［7］，迄今尚無有關(guān)DNT 在NMOSDs 和多發(fā)性硬化兩種疾病中表達(dá)差異的研究報(bào)道。鑒于此，本研究對新疆維吾爾自治區(qū)人民醫(yī)院近3 年診斷與治療的53 例NMOSDs 和20 例多發(fā)性硬化患者的臨床資料進(jìn)行回顧分析，通過分析CD4-CD8-DNT 細(xì)胞數(shù)目，探討CD4-CD8-DNT 在兩種疾病中的表達(dá)差異。

對象與方法

一、研究對象

1. 納入與排除標(biāo)準(zhǔn) （1）NMOSDs 診斷符合2015 年《NMOSDs 國際共識診斷標(biāo)準(zhǔn)》［8］，多發(fā)性硬化符合2017 年McDonald 診斷標(biāo)準(zhǔn)［9］。（2）患者入院至采集血液標(biāo)本時間<24 h，且在采集腦脊液和血液樣本之前均未曾接受過皮質(zhì)類固醇激素、免疫球蛋白或其他免疫抑制劑治療。（3）所有入組患者性別、年齡、誘因、臨床癥狀和基線數(shù)據(jù)等臨床資料完整。（4）新發(fā)神經(jīng)功能缺損癥狀持續(xù)時間≥24 h，且距前次發(fā)作≥30 d［10］。（5）凡存在以下情況者均非本研究納入對象：同時合并結(jié)締組織病和（或）其他自身免疫性疾病、腫瘤、感染、獲得性免疫缺陷綜合征及其他傳染性疾病，以及臨床和實(shí)驗(yàn)室數(shù)據(jù)不完整者。

2.一般資料 選擇2017 年1 月至2019 年12 月在我院神經(jīng)內(nèi)科住院治療的53 例NMOSDs 和20 例多發(fā)性硬化急性期患者。（1）NMOSDs 組：53 例，男性19 例，女性34 例；發(fā)病年齡16 ～66 歲，平均（36.72±17.04）歲；病 程 為1 ～8 年，中 位 病 程1.50（1.00，4.00）年。（2）MS 組：20 例，男性4 例，女性16 例；發(fā)病年齡為25 ～42 歲，平均（33.18±5.46）歲；病程為1 ～14 年，中位病程7.00（1.50，11.00）年。（3）正常對照組：選擇同期在我院進(jìn)行體格檢查的健康志愿者共27 例，男性13 例，女性14 例；年齡18 ～45 歲，平均（35.25±15.05）歲。3 組受試者性別（χ2=3.952，P=0.139）和年齡（F=5.799，P=0.571）差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，NMOSDs 組與MS 組患者病程差異亦無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（Z=21.000，P=0.081），具有可比性。

二、研究方法

1.常規(guī)實(shí)驗(yàn)室指標(biāo)檢測 患者入院24 h 內(nèi)采集外周靜脈血3 ～5 ml，排除腰椎穿刺禁忌證后留取腦脊液3 ～5 ml，儀器分析法測定紅細(xì)胞計(jì)數(shù)［（4.00 ～5.50）×1012/L］、白細(xì)胞計(jì)數(shù)［（3.50 ～9.50）×109/L］、中性粒細(xì)胞計(jì)數(shù)［（1.80 ～6.30）×109/L］；免疫層析法測定C-反應(yīng)蛋白（0 ～8 mg/L）；酶耦聯(lián)法測定丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶（7 ～45 U/L）、天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶（13 ～40 U/L）；反應(yīng)速率法測定血尿素氮（2.50 ～7.50 mmol/L）、肌酐（41 ～73 μmol/L）；免疫比濁法測定補(bǔ)體C3（0.80 ～1.20 g/L）、C4（0.10 ～0.40 g/L），間接免疫熒光法測定抗核抗體、抗雙鏈DNA 抗體；蛋白定量分析法測定血清和腦脊液寡克隆區(qū)帶（OCB），細(xì)胞免疫熒光法（CBA）測定血清和腦脊液髓鞘少突膠質(zhì)細(xì)胞糖蛋白（MOG）抗體、髓鞘堿性蛋白（MBP）抗體以及AQP4抗體。

2.流式細(xì)胞術(shù)測定DNT 細(xì)胞數(shù)目 （1）主要試劑與儀器：免疫試劑Ⅰ抗工作液［含多甲藻黃素葉綠素蛋白（PerCP）標(biāo)記的小鼠抗人CD3 單克隆抗體（CD3-PerCP）、異硫氰酸熒光素（FITC）標(biāo)記的小鼠抗人CD4 單克隆抗體（CD4-FITC）和藻紅蛋白（PE）標(biāo)記的小鼠抗人CD8 單克隆抗體（CD8-PE）］，溶血素均購自美國BD 公司。BY-80C 型離心機(jī)由北京白洋醫(yī)療器械有限公司提供，F(xiàn)ACS Canto Plus 流式細(xì)胞儀為美國BD 公司產(chǎn)品。（2）檢測方法：將采集的外周靜脈血標(biāo)本置于含有乙二胺四乙酸（EDTA）抗凝劑的EP 管，6 h 內(nèi)分別滴加CD3-PerCP（20 μl）、CD4-FITC（20 μl）和CD8-PE（20 μl），混勻、室溫避光孵育15 min，加入溶血素（2 ml）10 min 后于離心半徑5 cm、轉(zhuǎn)速1500 r/min 離心5 min，去上清液，磷酸鹽緩沖液2 ml 洗滌，再于離心半徑5 cm、轉(zhuǎn)速1500 r/min 離心5 min，去上清液、加入磷酸鹽緩沖液（500 μl）重懸細(xì)胞，流式細(xì)胞術(shù)測定CD4-CD8-DNT細(xì)胞數(shù)目，F(xiàn)lowJo v10.0 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

3.神經(jīng)功能缺損程度評價(jià) 入院后24 h 采用擴(kuò)展殘疾狀態(tài)量表（EDSS）［11］進(jìn)行殘疾程度評價(jià)，包括視覺功能（6 分）、腦干功能（5 分）、錐體功能（6 分）、小腦功能（5 分）、感覺功能（6 分）、膀胱和直腸功能（6 分）、大腦功能（5 分）及行動（6.50 分）共8 項(xiàng)內(nèi)容，每項(xiàng)評分經(jīng)轉(zhuǎn)化后計(jì)為總評分，總評分10 分，評分越高、殘疾程度越嚴(yán)重。

4. 統(tǒng)計(jì)分析方法 本研究采用SPSS 22.0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理與分析。計(jì)數(shù)資料以相對數(shù)構(gòu)成比（%）或率（%）表示，采用χ2檢驗(yàn)。呈正態(tài)分布的計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，采用兩獨(dú)立樣本的t檢驗(yàn)或單因素方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)；呈非正態(tài)分布的計(jì)量資料以中位數(shù)和四分位數(shù)間距［M（P25，P75）］表示，行Mann-WhitneyU檢驗(yàn)或Kruskal-Wallis 檢驗(yàn)（H檢驗(yàn)），兩兩比較行Mann-WhitneyU檢驗(yàn)。以P≤0.05 為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

表1 各組受試者常規(guī)實(shí)驗(yàn)室指標(biāo)的比較Table 1. Comparison of the laboratory indicators of the 3 groups

結(jié) 果

對各組受試者實(shí)驗(yàn)室指標(biāo)比較，血清C-反應(yīng)蛋白差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.033）,其中NMOSDs 組高于正常對照組（Z=1.456，P=0.029），但與多發(fā)性硬化組之間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（Z= 0.312，P=1.000）；多發(fā)性硬化組血清寡克隆區(qū)帶陽性率高于NMOSDs 組（P=0.000）；NMOSDs 組血清AQP4 抗體陽性率高于多發(fā)性硬化組（P=0.000）；其余各項(xiàng)指標(biāo)組間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P> 0.05，表1）。NMOSDs 組EDSS 評分為1 ～8 分、中位評分2.50（2.00，6.50）分，多發(fā)性硬化組EDSS 評分2 ～6 分、中位評分4.50（2.75，5.25）分，組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（Z=45.000，P=0.700）。

各組受試者外周血DNT 細(xì)胞數(shù)目差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.015），其中NMOSDs 組DNT 細(xì)胞數(shù)目分別高于正常對照組（P= 0.018）和MS 組（P=0.023），而MS 組與正常對照組DNT 細(xì)胞數(shù)目差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.881；表2，3）。

討 論

AQP4 抗體的發(fā)現(xiàn)讓人們逐漸認(rèn)識到，由B 細(xì)胞介導(dǎo)的體液免疫在NMOSDs 的發(fā)病機(jī)制中發(fā)揮至關(guān)重要的作用［11］，但是目前針對外周血B 細(xì)胞的治療藥物如利妥昔單抗等尚無法完全阻止NMOSDs 的進(jìn)展［12］，表明B 細(xì)胞介導(dǎo)的體液免疫并非唯一致病因素，T 細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞免疫或其他免疫因素也參與其中且發(fā)揮重要作用。本研究結(jié)果顯示，NMOSDs患者外周血DNT 細(xì)胞數(shù)目高于正常對照者和多發(fā)性硬化患者，據(jù)此推測外周血DNT 細(xì)胞數(shù)目增加可能提示NMOSDs 處于疾病的急性期。

表2 各組受試者外周血DNT 細(xì)胞數(shù)目的比較（x±s，×106/L）Table 2. Comparison of the number of DNT cells in NMOSDs group, MS group and control group (x±s, ×106/L)

表3 各組受試者外周血DNT 細(xì)胞數(shù)目的兩兩比較Table 3. Pairewise comparison of the number of DNT cells in NMOSDs group, MS group and control group

目前，對于DNT 細(xì)胞的起源及其在免疫機(jī)制中的作用尚未完全闡明。DNT 細(xì)胞因表面分子不同而表達(dá)多樣，可分泌大量細(xì)胞因子，提示其不同來源或分化途徑［13］。有文獻(xiàn)報(bào)道，外周血DNT 細(xì)胞主要來源于胸腺和脾［14］，較少來源于不依賴胸腺的途徑，如活化的外周血CD4+和（或）CD8+T 細(xì)胞［15］。Priatel 等［16］研究顯示，T 細(xì)胞受體（TCR）信號強(qiáng)度是DNT 細(xì)胞發(fā)育的重要因素，較低強(qiáng)度的TCR 信號可誘導(dǎo)生成成熟的CD4+和（或）CD8+T 細(xì)胞，而較高強(qiáng)度的TCR 信號則對胸腺DNT 細(xì)胞的存活或逃逸具有促進(jìn)作用。正常人外周血中亦可以檢出DNT 細(xì)胞，通常少于總淋巴細(xì)胞的2.5%［13］，但是這一小部分DNT 細(xì)胞具有同源異質(zhì)性，分別表達(dá)TCRγδ和TCRαβ［13，17］。目前對于DNT 細(xì)胞的病理生理學(xué)機(jī)制尚不完全清楚，有證據(jù)顯示其可以識別寄生蟲、細(xì)菌（尤其是分枝桿菌）或應(yīng)激的哺乳動物細(xì)胞表達(dá)的應(yīng)激蛋白和熱休克蛋白（HSP）［6］。2019 年來自德國的一項(xiàng)研究顯示，DNT 很可能通過作用于T 細(xì)胞的哺乳動物雷帕霉素靶蛋白（mTOR）以影響其代謝和功能［18］。因此，DNT 細(xì)胞可能通過識別自身應(yīng)激反應(yīng)所誘導(dǎo)的分子在自身免疫性疾病中發(fā)揮重要作用［19］。

在本研究中，NMOSDs 急性期患者外周血DNT細(xì)胞數(shù)目增加，而多發(fā)性硬化患者則無明顯改變，提示DNT 細(xì)胞可能參與NMOSDs 的發(fā)病機(jī)制。臨床上NMOSDs 患者表現(xiàn)出的更高的復(fù)發(fā)率和更快的疾病進(jìn)展速度，亦不能完全排除與DNT 細(xì)胞相關(guān)。目前，國內(nèi)外尚無關(guān)于DNT 細(xì)胞在NMOSDs 中表達(dá)變化的研究，但有些學(xué)者已經(jīng)開始關(guān)注DNT 細(xì)胞在自身免疫性疾病中的作用機(jī)制。Reinhardt 和Melms［20］在重癥肌無力（MG）患者的外周血中檢測到DNT 細(xì)胞，并發(fā)現(xiàn)切除胸腺瘤后DNT 細(xì)胞數(shù)目可隨乙酰膽堿受體（AChR）抗體滴度的下降和臨床癥狀的好轉(zhuǎn)而逐漸恢復(fù)正常，高度提示DNT 細(xì)胞參與免疫調(diào)節(jié)機(jī)制。Crispín 和Tsokos［21］發(fā)現(xiàn)，系統(tǒng)性紅斑狼瘡患者外周血DNT 細(xì)胞數(shù)目顯著增加，同時可促進(jìn)白細(xì)胞介素-17（IL-17）的分泌。而最新研究顯示，系統(tǒng)性紅斑狼瘡發(fā)病后紊亂的細(xì)胞因子和凋亡碎片可以導(dǎo)致CD8 細(xì)胞向DNT 細(xì)胞轉(zhuǎn)變，同時促進(jìn)IL-17 的生成［22］。一項(xiàng)針對自身免疫性淋巴細(xì)胞增生綜合征（ALPS）的研究顯示，外周血DNT 細(xì)胞比例從1%增至40%［17］。上述研究均表明，DNT 細(xì)胞具有通過調(diào)節(jié)免疫和炎癥穩(wěn)態(tài)的多種功能在系統(tǒng)性自身免疫性疾病的發(fā)病中發(fā)揮作用。然而，DNT 細(xì)胞在中樞神經(jīng)系統(tǒng)的作用仍未知。Matsumoto 等［23］于1996 年最早描述了自身免疫性腦脊髓膜炎動物模型DNT 細(xì)胞的特點(diǎn)，提出蛛網(wǎng)膜下腔DNT 細(xì)胞是脊髓病變的T 細(xì)胞前體，并在T 細(xì)胞浸潤中樞神經(jīng)系統(tǒng)實(shí)質(zhì)的過程中發(fā)生表型轉(zhuǎn)換。此后，關(guān)于DNT細(xì)胞在神經(jīng)系統(tǒng)疾病中的描述較少。2019 年，南京大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬鼓樓醫(yī)院徐運(yùn)教授團(tuán)隊(duì)的研究顯示，腦卒中患者腦組織和外周血DNT 細(xì)胞數(shù)目顯著增加，浸潤的DNT 細(xì)胞通過調(diào)節(jié)FasL/PTPN2/腫瘤壞死因子-α（TNF-α）信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路以增強(qiáng)腦組織免疫炎癥反應(yīng)，進(jìn)而加重缺血性腦損傷［24］。Gagliani等［25］在神經(jīng)炎癥的再溶解過程中發(fā)現(xiàn)，某些獨(dú)特的T 細(xì)胞亞群如輔助性T 細(xì)胞17（Th17）可在腦組織中轉(zhuǎn)變?yōu)榱硪籘 細(xì)胞亞群——調(diào)節(jié)性T 細(xì)胞（Treg），但并不知曉缺血性卒中期間是否可從其他T 細(xì)胞亞群轉(zhuǎn)變?yōu)镈NT 細(xì)胞。此外，在中樞神經(jīng)系統(tǒng)炎癥中表達(dá)上調(diào)的諸如自身抗原的刺激物也可以導(dǎo)致T 細(xì)胞原位增殖和擴(kuò)增［26］，這也可能是DNT 細(xì)胞在缺血性卒中增多的原因之一。在一些疾病中，DNT 細(xì)胞可在周圍神經(jīng)系統(tǒng)生成TNF-α，進(jìn)一步加劇炎癥反應(yīng)，促進(jìn)疾病進(jìn)展［26］。DNT 細(xì)胞參與免疫炎癥反應(yīng)的機(jī)制還可能與其分泌炎性因子IL-17 有關(guān)［22］。本研究未進(jìn)一步探討TCR 信號和細(xì)胞因子與DNT 細(xì)胞間的關(guān)系，推測TCR 信號和部分細(xì)胞因子表達(dá)變化可能引起NMOSDs 患者DNT 細(xì)胞數(shù)目變化，尚待今后擴(kuò)大樣本量進(jìn)一步深入研究。

綜上所述，NMOSDs 患者外周血DNT 細(xì)胞數(shù)目顯著增加，可能與免疫功能紊亂有關(guān)。進(jìn)一步研究NMOSDs 患者外周血DNT 細(xì)胞生物表型和功能特征將對了解其發(fā)病機(jī)制，以及探索免疫治療潛在靶標(biāo)和途徑具有重要意義。