法舒地爾減輕新生大鼠腦室周圍白質軟化的作用機制研究*

歐陽穎， 李 健， 董 紅， 張羚枚， 阮揚皓， 唐淑敏

（中山大學孫逸仙紀念醫院兒科，廣東廣州510120）

早 產 兒 腦 病（encephalopathy of prematurity，EOP）是造成極低出生體重兒遠期預后不良的決定因素之一，因此早產兒腦損傷近年來日益受到國內外圍產醫學和新生兒學研究領域的重視。早產兒的這種神經系統功能障礙主要由腦白質損傷及神經元破壞損傷所致［1］。腦室周圍白質軟化（periventricular leukomalacia，PVL）指腦室周圍深部腦白質缺血性凝固性壞死，是早產兒腦損傷的主要形式，發生率約為25%～75%，多發于胎齡為23～32 周的早產兒［2］，早產兒腦損傷的防治成為新生兒科最迫切需要解決的問題，然而目前早產兒腦損傷缺乏有效的治療手段和保護性藥物。因此尋找高效、副作用少的治療方法，是滿足早產兒一線臨床需求和減輕社會負擔的迫切要求，對于早產兒和社會都具有十分重要的意義。

近年來的研究發現，通過阻斷Rho/ROCK 信號通路可以改善多種成人腦血管疾病的預后。法舒地爾（fasudil）是目前臨床唯一可用的ROCK 選擇性抑制劑，其抑制 ROCK 作用較強［3-4］，具有良好的水溶性，且腦組織中含量較高。在急性缺血性腦卒中動物模型中，fasudil可以增加腦部血流，增強內皮型一氧化氮合酶（endothelial nitric oxide synthase，eNOS）活性，促進一氧化氮（nitric oxide，NO）生成，減少腦梗死體積，改善神經行為［5］，促進軸突生長［6］。除此之外，臨床研究發現fasudil 能明顯改善成人急性腦卒中患者的神經行為預后［7-8］。在新生兒科領域，國內外均有報道fasudil 通過促進神經軸突生長、下調神經髓鞘抑制因子的表達、抗炎等機制從而達到神經修復作用［9-10］，然而在早產兒腦損傷當中尚無相關研究。目前對于PVL 的損傷機制尚無統一定論，Rho/ROCK 通路是否同樣參與PVL 的發生也無相關的報道。因此本研究觀察法舒地爾是否具有減輕腦部病理損傷、改善遠期神經功能，探討其是否通過抑制 ROCK 通路、減少 NF-κB P65 活化、減輕炎癥損傷而起作用，以期為PVL的治療開辟一條新途徑。

材料和方法

1 動物

240 只新生3 日齡SD 大鼠，雌雄不限，購自中山大學（大學城）實驗動物中心［SCXK（粵）2011-0029］。大鼠正常進食、飲水。飼養環境為室溫、57%濕度、12 h光/暗循環。

2 主要試劑

鹽酸法舒地爾注射液購自天津紅日藥業；抗ROCK2 抗體購自 Abcam；抗 NF-κB P65 抗體購自CST；0.25% 胰蛋白酶-EDTA 購自 Gibco；Trizol 試劑、Taq DNA 多聚酶、dNTP 等 PCR 試劑購自 TaKa-Ra；BCA 蛋白定量試劑盒購自北京賽馳生物；二硫蘇糖醇、丙烯酰胺、N，N'-亞甲基丙烯酰胺、Tris 和吐溫20 購自Sigma；過硫酸銨、甲醇、4%多聚甲醛購自廣州化學試劑廠；甘氨酸購自鼎國生物；蘇木精-伊紅染液、二甲苯、DAB 顯色試劑盒和免疫組化封閉液（山羊血清）購自康為世紀；Lipofectamine 2000 轉染液購自Invirogen。

3 主要方法

3.1 PVL 模型的建立 將麻醉后的SD 乳鼠沿頸正中切開皮膚及皮下組織，分離結扎左側頸部頸總動脈，依次縫合皮下組織及皮膚，消毒切口。整個手術過程在電熱毯上進行，于15 min 內完成。空氣中恢復0.5～1 h，待乳鼠完全清醒后送回母鼠身邊，自由哺乳2～3 h后將乳鼠置入缺氧艙［寬30 cm×長40 cm×高20 cm，箱底平鋪氧化鈉以吸收水分和CO2，溫度維持在（30±2）℃］，輸入含8% O2+92% N2的混合氣體，流速為2 L/min，持續2.5 h。缺氧結束，在空氣中恢復10 min 后放回窩中。自此開始計時，連續3 d腹腔注射生理鹽水或fasudil。

3.2 實驗分組 225 只SD 大鼠隨機分為3 組，每組75 只：（1）假手術（sham）組僅分離左側頸總動脈，未結扎及缺血缺氧；（2）PVL+生理鹽水組（PVL組）：建模成功后根據不同時點開始腹腔注射生理鹽水（10 mL·kg-1·d-1）；（3）PVL+fasudil組：建模成功后根據不同時點開始腹腔注射 fasudil（10 mg·kg-1·d-1）。以12 h、24 h、48 h、72 h和30 d為時點亞組，每個亞組樣本量為15 只。斷頭取全腦，4%多聚甲醛溶液固定，常規石蠟包埋以制作病理標本；于12 h、24 h、48 h和72 h，各組大鼠取15 只，麻醉后立即斷頭，分離左右腦，左腦用生理鹽水沖洗血跡后轉入-80℃凍存備用。

3.3 HE 染色 將石蠟包埋好的標本連續冠狀切片，厚約5 μm，常規二甲苯脫蠟，經各級乙醇至水化，置于蘇木素染色5min 后自來水沖洗，鹽酸乙醇分化30 s 后自來水浸泡15 min，用伊紅溶液染色2 min，常規脫水透明封片。

3.4 RT-qPCR 檢測 ROCK2 的 mRNA 水平 使用常規RNA 提取方法在-80℃的新鮮組織標本中提取RNA，提取結束后置于-80℃環境中保存備用。按逆轉錄說明書進行逆轉錄，得到的cDNA 用DEPC 水稀釋10 倍后備用。采用20 μL 反應體系，其中包括2 μL cDNA 模板、上下游引物（序列見表1）各2 μL、10 μL 2× All-in-One qPCR Mix和4 μL DEPC 水，混勻離心。96孔PCR板上加好樣，上機檢測。反應條件為：預變性95℃ 30 s；變性95℃ 5 s，退火60℃ 30 s，延伸72℃20 s，39 個循環。每個待測樣品及內參照基因均設置3個復孔。

表1 RT-qPCR引物序列Table 1.The sequences of the primers for RT-qPCR

3.5 Western blot 檢測 ROCK2和NF-κB P65 蛋白的表達 取新鮮腦組織標本并利用RIPA 裂解液萃取細胞蛋白，于-80℃冰箱保存備用，用BCA 蛋白定量試劑盒，根據試劑盒步驟說明檢測待測樣品蛋白含量，于562 nm 波長處測定吸光度（A）值。利用標準曲線計算出待測樣品的蛋白濃度。取樣品蛋白進行SDS-PAGE、轉膜和封閉。封閉完畢后用TBST 液洗膜5 次，加入Ⅰ抗，4℃孵育過夜。次日用TBST 再次洗膜5 次，加入Ⅱ抗，反應1 h，之后再此TBST 洗膜5次。最后利用化學發光成像儀顯影，根據系統指示要求對PVDF 膜進行曝光，保存曝光好的條帶電子圖像。

3.6 大鼠神經行為學檢測 （1）懸吊實驗：讓大鼠前腿抓住一水平的玻璃棒（直徑0.5 cm），離開桌面45 cm，記錄玻璃棒掉下的時間（min）。（2）斜坡實驗：大鼠頭向下倒置于45°斜面上，記錄大鼠轉頭向上＞135°所需的時間（s）。（3）圓桶實驗：裝置為一個直徑20 cm、高45 cm 左右的透明圓桶，寬度允許動物水平自由移動；測試前3 d 捆綁動物雙足10 min；測試時，將每只大鼠獨立放置于圓桶中，3 min之內觀察其主動站立時左右前肢觸壁次數，計算百分比。

4 統計學處理

采用SPSS 20.0 軟件進行統計學分析。計量資料均以均數±標準差（mean±SD）表示。兩組間均數比較采用t檢驗；多組間均數比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用Bonferroni 法。以P＜0.05 為差異有統計學意義。

結 果

1 一般情況

假手術組大鼠未出現死亡；PVL 組75 只，缺氧處理時死亡 4 只，12、24和48 h 分別死亡 1 只、2 只和 1 只，死亡率為 10.67%；PVL+fasudil 組 75 只，缺氧處理時死亡 4 只，12和24 h 分別死亡 2 只和 1 只，死亡率為9.33%。建模前，3 組乳鼠體重差異無統計學意義（P＞0.05）。PVL 組和PVL+fasudil 組大鼠的死亡率差異沒有統計學意義（P＞0.05）。造模后12、24、48 和72 h，PVL 組及PVL+fasudil 組大鼠體重明顯落后于假手術組（P＜0.05），72 h 后PVL+fasudil組大鼠體重較PVL 組出現明顯追趕，30 d 時PVL 組與PVL+fasudil 組相比差異有統計學意義（P＜0.05），見表2。

表2 3組大鼠不同時點體重的比較Table 2.Comparison of the rat body weight at different time poinits in the 3 groups（g.Mean±SD. n=15）

2 病理組織學觀察

在各個時點亞組中，乳鼠的腦組織均可見到不同程度的腦組織水腫，細胞壞死缺失，選擇72 h來具體觀察腦組織的變化。光鏡下假手術組左右腦室等大，細胞層次分明，排列緊密，腦白質結構正常，染色清晰（圖1A、D）；PVL 組（圖1B、E）和PVL+fasudil 組（圖1C、F）可見雙側腦室不等大，左側腦室明顯擴大，腦白質細胞排列明顯稀疏紊亂，細胞水腫樣變，細胞間間質松散甚至缺失，小膠質細胞浸潤。PVL組可見明顯軟化灶，提示PVL+fasudil 組相對于PVL組病理改變較輕。

Figure 1.Pathological changes of brain tissues in neonatal rats of the 3 groups at 72 h（HE staining）.A，D：sham group；B，E：PVL group；C，F：PVL+fasudil group.A～C：×40；D～F：×200.圖1 72 h時點3組乳鼠腦組織病理變化

3 Western blot 檢測 ROCK2和NF-κB P65 蛋白表達水平的變化

PVL 組乳鼠腦組織中ROCK2 表達較PVL+fasudil 組明顯上調，12、24和48 h 時點兩組比較，差異均有統計學意義（P＜0.05），見圖2；在24和48 h時點檢測NF-κB P65 的表達情況，結果顯示PVL 組相對PVL+fasudil 組和假手術組表達上調（P＜0.05），見圖3。

Figure 2.The protein expression level of ROCK2.p：PVL；pf：PVL+fasudil.Mean±SD. n=15. *P＜0.05 vs pf group.圖2 ROCK2蛋白表達水平的比較

4 RT-qPCR法檢測ROCK2的mRNA表達水平

PVL 組和PVL+fasudil 組 ROCK2 的 mRNA 表 達相對假手術組上調，在24和48 h時點PVL組和PVL+fasudil 組間的差異有統計學意義（P＜0.05）；同組ROCK2 mRNA表達隨時間的延長呈先升高后降低的趨勢，在早期差異有統計學意義（P＜0.05）且PVL+fasudil組升高較PVL組滯后，見表3。

5 神經行為學評價

在連續30 d 的觀察期，PVL 組乳鼠出現不同程度的行動遲緩，左右肢體運動不協調，左眼睜眼時間較假手術組延長，生長遲緩甚至偏癱等表現；PVL+fasudil 組同樣出現左右肢體運動不協調，但未見明顯偏癱，左眼睜眼時間延長，體重增加相對PVL 組快。懸吊實驗中假手術組大鼠懸吊于玻璃棒的時間長于 PVL 組及 PVL+fasudil 組，PVL+fasudil 組大鼠懸吊于玻璃棒的時間比PVL 組長，差異有統計學意義（P＜0.05）；斜坡實驗中，PVL 組及PVL+fasudil 組轉頭所需時間均長于假手術組，但兩組相比差異無統計學顯著性（P＞0.05）；圓桶實驗中，假手術組大鼠左右肢體觸碰圓桶壁次數的差異無統計學顯著性，而PVL 組及PVL+fasudil 組大鼠左右肢體出現不協調，左腿觸及桶壁次數多于右腿，見表4。

Figure 3.The protein expression level of P65.p：PVL；pf：PVL+fasudil.Mean±SD. n=15. *P＜0.05 vs pf group；#P＜0.05 vs sham group.圖3 P65蛋白表達水平的比較

表3 RT-qPCR檢測ROCK2的mRNA表達水平Table 3.The mRNA expression of ROCK2 detected by RT-qPCR（Mean±SD. n=15）

表4 3組大鼠圓桶實驗分析比較和神經行為學評估Table 4.The comparison of rats in 3 groups with drums experiments and assess of neuroethology（Mean±SD. n=15）

討 論

1 模型可行性

基于早產兒的發育特點，Back 等［11］用出生后2日齡大鼠，通過左側頸總動脈結扎，置于6% O2和94%N2混合氣體的低氧艙內4 h，制作了缺血缺氧PVL 模型，經大量研究證實該模型具有早產兒PVL的特征性改變。近幾年來國內外學者通過對該模型進行不同程度的改良，制作了各有利弊的PVL 模型，盡管如此，目前也尚無早產兒PVL 模型的金標準。本研究基于目前國內外的PVL模型［12-13］，選擇日齡與早產兒PVL 的發病胎齡相對應的大鼠，行左側頸總動脈結扎，然后再缺氧2.5 h，通過相對減少乳鼠腦血供、適當縮短缺氧時間、加強造模過程中對乳鼠的保溫措施及縮短結扎頸總動脈時間，從一定程度上降低了乳鼠死亡率，為成功建立PVL 模型奠定了基礎。該模型病理生理改變與文獻報道［12-13］相符，表明本實驗模型制作成功。

2 fasudil對PVL大鼠的神經保護作用

在新生兒領域，國內學者［9，14-15］研究發現 fasudil通過抗炎、下調髓鞘抑制因子表達等作用對新生大鼠缺血缺氧性腦損傷起到神經修復作用，但尚未見fasudil 在早產兒PVL 中的相關研究報道。結合在早產兒PVL 中，少突膠質前體細胞（oligodendrocyte precursor cells，OPCs）為主要靶細胞，在各種病理性因素下，OPCs 增殖分化障礙，最終導致髓鞘形成障礙［16-17］，因此 fasudil 很有可能通過抑制 Rho/ROCK 通路的活化而逆轉其介導的病理過程，從而促進OPCs的增殖分化，起到神經保護作用。為明確這一推測，本實驗采取建立PVL 大鼠模型后進行30d 的神經行為學檢測，從功能上研究其神經保護作用。結果發現PVL+fasudil 組相對于PVL 組腦組織水腫壞死改變相對要輕，表明fasudil 具有減輕缺血缺氧導致的腦損傷的作用；經過30 d 的動態觀察，發現PVL+fasudil 組大鼠相對PVL 組大鼠精神狀態較好，飲食和活動較多，但睜眼時間相對假手術組仍出現延遲。參照石晶［18］的方法于術后30d 對3 組大鼠進行神經行為學檢測。懸吊實驗及斜坡實驗可檢查大鼠隨意運動功能，圓桶試驗可檢查動物肢體運動的對稱性［19］。本研究結果提示，PVL+fasudil 組大鼠神經行為學評分高于PVL 組，表明fasudil 很大程度上能改善大鼠PVL的遠期神經行為。

3 Rho/ROCK和NF-КB P65通路與PVL的關系

Rho/ROCK 信號通路受多種外界信號刺激活化后，可與細胞內的鈣離子通道偶聯，最終使胞漿內肌球蛋白輕鏈（myosin light chain，MLC）磷酸化水平上升，細胞骨架蛋白活化［20-21］。NF-κB 是細胞內介導信號傳遞的快反應轉錄因子，常以P65-P50二聚體的形式存在，與抑制物IκB（inhibitor of NF-κB）結合而呈非活化性狀態。研究發現Rho/ROCK 通路活化后通過介導P38 MAPK 通路，使肌動蛋白磷酸化，最終介導P65-P50 二聚體從細胞漿轉移到細胞核［22-23］，與相應基因上的NF-κB 位點特異性結合，從而啟動相關基因轉錄，發揮生物效應，參與炎性反應的病理生理過程，NF-κB是Rho/ROCK下游的重要效應分子。

在缺氧缺血所致的腦白質軟化模型中，缺氧缺血后機體啟動防御機制，激活Rho及Rho/ROCK 信號通路，并依次激活其下游分子NF-κB P65，NF-κB P65 作為Rho/ROCK 的重要效應分子，被活化后迅速轉移入細胞核內，從而啟動相關基因轉錄，誘發神經炎癥風暴，進而加劇腦損傷［24］。本研究結果顯示，fasudil 干預組ROCK2 的表達較PVL 組明顯下調，且差異有統計學意義（P＜0.05），因此我們認為PVL 新生大鼠在缺氧缺血后進行fasudil 干預，可有效抑制ROCK2 的表達。同時基于PVL 新生大鼠腦組織中ROCK2 于 24和48 h 表達明顯上調，重點討論 24 和48 h 時點P65 的表達情況。結果顯示PVL 組中P65在24和48 h較假手術組表達上調，PVL+fasudil組中P65在24 h表達較假手術組上調，差異均有統計學意義（P＜0.05）。這些結果提示 ROCK2和NF-κB P65作為Rho/ROCK 信號通路中的關鍵分子參與了新生大鼠腦白質損傷的病理生理過程，fasudil 通過抑制這一通路而起作用。

綜上所述，大鼠PVL 中Rho/ROCK 通路過度活化，fasudil 具有神經保護作用，這種保護作用可能是通過阻斷Rho/ROCK 信號通路活化，抑制NF-κB P65通路，抑制缺氧缺血后啟動的炎癥損傷，從而減輕PVL新生大鼠腦損傷，改善遠期神經功能。