煙草NtbHLH112 基因的克隆、鑒定及表達模式分析

孫晉浩，牛文利，陳志華，余祥文，丁安明，楊興有，孫玉合*

（1.中國農業科學院煙草研究所，煙草行業煙草基因資源利用重點實驗室，青島 266101；2.四川省煙草科學研究所，成都 610000）

轉錄因子能與順式作用元件相互作用，特異性調控與環境應激相關的基因，以維系植物正常生命活動[1-2]。bHLH（basic helix loop helix）轉錄因子含有高度保守的bHLH 結構域，是植物體內第二大類轉錄因子[3]。其結構域由大約60 個氨基酸組成，包括堿性氨基酸區域和螺旋-環-螺旋區域（HLH）。堿性氨基酸區域位于bHLH 結構域的N-末端，包含15 個氨基酸，其功能主要是識別和特異性結合啟動子中的堿基序列[4]；螺旋-環-螺旋區位于bHLH 結構域的C 端，約含有45 個氨基酸，其主要功能是促進蛋白質與蛋白質的互相作用，并允許形成同源二聚體或異二聚體復合物來控制基因轉錄[5]。盡管該類轉錄因子含有高度保守的bHLH 結構域，但其他序列的保守性相對較低，存在較大差異性[6]。

bHLH 轉錄因子家族成員在植物抗逆應答過程中起到極其重要的調控作用[7-11]。已有研究表明在擬南芥以及水稻、苦蕎麥、山茶樹等重要的糧食作物和經濟作物中鑒定得到bHLH 轉錄因子[10,12-14]。例如，擬南芥中的bHLH92、bHLH112 和bHLH122轉錄因子響應干旱、鹽、滲透等多種脅迫[15-17]。水稻中的bHLH 轉錄因子OsbHLH068 和OsbHLH148參與干旱脅迫響應過程[18-19]。煙草同源作物辣椒和番茄中也鑒定到bHLH 轉錄因子CabHLH40 和SlICE1a 受干旱、鹽、ABA 非生物脅迫誘導[20-21]。

煙草的抗旱、抗冷和抗鹽性對煙草的產量和品質起到極為重要的作用[22]，深入研究煙草的抗旱和抗鹽的調控機理，能夠為煙草育種提供重要的理論依據[23-25]。但是在煙草中關于bHLH 轉錄因子家族的研究卻相對較少。目前，僅有一個煙草bHLH 類轉錄因子NtbHLH123 被研究。該轉錄因子可以直接作用于NtCBF基因啟動子并正向調節其表達，進而調控煙草的耐冷性；同時過表達NtbHLH123基因的煙草植株在冷脅迫下表現為較低的電解質滲透，較低含量丙二醛、H2O2和活性氧（ROS），從而減輕冷脅迫條件下的細胞膜氧化損傷[26]。本研究基于已經報道的擬南芥bHLH112基因序列和茄科基因組數據庫中的番茄SlbHLH112、辣椒CabHLH112的基因信息，在普通煙草中克隆NtbHLH112基因，并運用生物信息學分析和亞細胞定位等試驗手段對其保守結構域、進化關系、亞細胞定位、轉錄激活以及基因的表達模式進行分析，預測其生物學功能，為煙草抗逆育種提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

普通煙草品種K326。

1.2 試劑和儀器

菌株：大腸桿菌菌株（E.coli）DH5α、農桿菌菌株EHA105、酵母AH109 菌株由本實驗室保存。

載體：pYG51-GFP 和pBridge 由本實驗室保存或改造。

酶類：試驗所用限制性內切酶、Pfu 高保真酶、Easy Taq 酶、Infusion 連接酶購自寶生物工程有限公司（TaKaRa）。

其他試劑：RNA 提取試劑盒、cDNA 反轉錄試劑盒、DNA PCR 產物純化試劑盒、質粒小量提取試劑盒、pEASY-Blunt 載體、SYBR? Premix Ex TaqTM熒光定量試劑購于全式金生物技術有限公司；酵母基本培養基（SD Base）、色氨酸缺素培養基（-Trp）、X-Gal 等購于Takala 公司；Amp、β-巰基乙醇、Kan、EB、瓊脂粉、SDS、瓊脂糖等購自索萊寶生物公司；NaOH、鹽酸、LiCl、氯仿、NaCl、無水乙醇、異丙醇等為國產分析純試劑。

儀器：熒光定量PCR 儀ABI-Q3（美國ABI 公司生產），激光共聚焦顯微鏡TCS-SP8（德國Leica公司生產）。

1.3 試驗方法

1.3.1 煙草材料種植和處理 （1）正常生長的煙草材料。煙草品種K326 種子點播于花盆中，種植于中國農業科學院煙草研究所氣候室。在煙株盛花期，收集植株根、莖、葉、花、花蕾、腋芽等組織，液氮速凍后放置于-80 ℃封存備用。收集根部組織時，將煙草根系部位營養土用水輕輕沖洗干凈，剪取側根，迅速置于液氮中；葉組織分別收集上部葉、中部葉、下部葉。（2）不同逆境脅迫下的煙草材料。用MS 固體培養基萌發幼苗，待長至6 片真葉期，進行鹽、干旱、溫度、激素處理。鹽處理：將6 片真葉期苗轉移至含有60 mmol/L NaCl 溶液處理1、3、6 h，取整株，以MS 鹽溶液處理作為對照。干旱處理：將6 片真葉期苗轉移至吸水濾紙表面進行干旱處理1、3、6 h[25]，取整株，用未處理的煙苗作為對照。溫度處理：將6 片真葉期苗轉移至4 ℃和37 ℃培養箱中進行處理1、3、6 h，取整株，以25 ℃處理作為對照。激素處理：將6 片真葉期苗轉移至含有10 μmol/L ABA 的MS 鹽溶液處理1、3、6 h，取整株，以MS 鹽溶液處理作為對照。處理完成后，每組選取3 株煙苗，液氮速凍后放置于-80 ℃封存備用。

1.3.2 RNA 提取及反轉錄PCR 將備用樣品在含有液氮的研缽中研成粉末，依試劑盒說明書步驟，提取總RNA，-80 ℃保存備用；依反轉錄試劑盒說明書反轉錄為cDNA，稀釋至10 ng/μL，-20 ℃封存，備用。

1.3.3 基因NtbHLH112的克隆 以擬南芥AtHLH112 蛋白序列作為query 序列，在茄科基因組數據庫（http://solgenomics.net/）中進行BLAST 比對，在該數據庫（Database）中選擇N.tabacumK326 protein sequences，獲得候選基因（Ntab0435090），依據候選基因的CDS 序列，設計特異性PCR 擴增引物。上游引物： 5'-ATGGCTGATGAATTTC AAGCAGG-3'，下游引物：5'-TTATCTGAATGTA CCACCAAAATTTGG-3'，以普通煙草 K326 總cDNA 為模板，使用Pfu 高保真酶擴增目的基因，然后用純化試劑盒回收目的片段。取5 μL 純化基因片段連接于pEASY-Blunt 載體并轉入大腸桿菌感受態中，用含100 μg/mL 卡那霉素的LB 平板篩選，將陽性克隆送至上海生工生物科技有限公司進行測序，保存測序正確的菌種，并命名為Blunt-NtbHLH112。

1.3.4 NtbHLH112 的生物信息學分析 利用ProtParam 程序（https://web.expasy.org/protparam/）預測NtbHLH112基因編碼的蛋白氨基酸序列的分子量、等電點、蛋白親水值；在擬南芥數據庫TAIR（www.arabidopsis.org）中下載 AtbHLH112 和AtbHLH122，在茄科基因組數據庫（http://solgenomics.net/）中下載番茄SlHLH112、辣椒CaHLH112，在NCBI 數據庫（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/）中下載玉米 ZmbHLH112、水稻OsbHLH112、大豆GmbHLH112、葡萄VitbHLH112，利用DNAMAN 進行多序列比對，使用WebLogo（http://weblogo.berkeley.edu/logo.cgi）將結果可視化，分析NtbHLH112 的保守結構域；利用MEME（http://meme-suite.org/）在線軟件分析保守基序（motif），使用MGEA7 建立進化樹圖譜（Neighbor-Joining，NJ tree）。

1.3.5 NtbHLH112 的亞細胞定位分析 以 Blunt-NtbHLH112亞克隆載體質粒作為模板利用Pfu 高保真酶PCR 擴增。將NtbHLH112基因CDS 序列使用Infusion 重組酶連接到pYG51-GFP 亞細胞定位的載體上，轉化至大腸桿菌感受態，置于含150 μg/mL壯觀霉素的LB 平板篩選，獲得陽性克隆測序，將正確的重組載體轉入農桿菌感受態EHA105，置于含150 μg/mL 壯觀霉素和60 μg/mL 利福平的LB 平板篩選，PCR 陽性鑒定。根據李曉旭等[26]方法注射本氏煙葉，獲取注射材料后置于激光共聚焦顯微鏡觀察GFP 熒光信號。

1.3.6 NtbHLH112 的轉錄激活試驗 以Blunt-NtbHLH112亞克隆載體質粒作為模板利用Pfu 高保真酶PCR 擴增，將NtbHLH112基因CDS 序列使用Infusion 重組酶連接到pBridge 載體上，測序獲得陽性克隆，并構建NtbHLH112與GAL4-BD 的融合表達載體。將融合載體與pBridge 空白載體分別轉化酵母AH109菌株，在SD/-Trp缺陷培養基上培養3 d，將陽性克隆轉移至SD/-Trp/X-gal 顯色培養基上避光培養至顯色。

1.3.7NtbHLH112表達模式分析 使用qRT-PCR反應分析NtbHLH112基因的表達模式。利用NCBI設計特異性擴增qRT-PCR 引物，上游引物：5'-CACCCTTGTTGAAACCTTCT-3'，下游引物：5'-TCAACATCCGACTTGGCAGA-3'，以煙草 26S rRNA 基因作為內參對照，上游引物：5'-CAAGGAAATCACCGCTTTGG-3'，下游引物：5'-CAAGGAAATCACCGCTTTGG-3'。經脅迫、激素處理的所有樣品提取RNA，反轉錄成為cDNA，然后進行qRT-PCR，依據2-ΔΔCt算法處理數據。

2 結果

2.1 NtbHLH112 基因CDS 序列克隆及分析

根據基因組數據庫BLASTP 比對結果，進行候選基因的特異性擴增引物設計，以K326 植株的全cDNA 作為模板擴增，目的片段約1300 bp（圖1）。然后將片段純化回收，連接至Peasy-Blunt 載體，挑取單克隆測序，結果表明，NtbHLH112基因CDS 序列全長1368 bp，共編碼455 個氨基酸。ProtParam分析顯示該蛋白相對分子量為50.46 kDa，理論等電點為6.39，蛋白親水值（Protein GRAVY）為-0.72。

圖1 NtbHLH112 基因PCR 擴增產物電泳圖Fig.1 Electrophoretogram of NtbHLH112 PCR amplification

依據NtbHLH112 的蛋白序列，將其與擬南芥、番茄和玉米等物種中的bHLH112 蛋白進行多序列比對（圖2），高度保守的氨基酸用深藍標記，其他相對保守的氨基酸用紅色以及淺藍色標注，發現NtbHLH112在N端具有高度保守的bHLH結構域。

2.2 NtbHLH112 轉錄因子進化分析及保守基序分析

以擬南芥、番茄和玉米等物種中的bHLH112 轉錄因子作為參考序列進行比對，運用MEGA 7.0 建立進化樹（圖3）?；谶M化樹分析，煙草NtbHLH112與番茄SlbHLH112、辣椒CabHLH112 聚在一起，表明三者是直系同源。利用保守序列識別工具MEME 分析，結果顯示同一支的bHLH112 轉錄因子成員具有較強的一致性。并且，NtbHLH112 與番茄SlbHLH112、辣椒CabHLH112 保守基序的種類以及組織形式高度一致，暗示NtbHLH112 與番茄SlbHLH112、辣椒CabHLH112 可能具有功能相似性。

圖2 NtbHLH112 轉錄因子與其他植物 bHLH 蛋白的氨基酸序列比較Fig.2 Multiple sequence alignment of NtbHLH112 and bHLH proteins of other plant species

圖3 NtbHLH112 轉錄因子系統進化及保守基序分析Fig.3 Phylogenetic and conserved motifs analysis of NtbHLH112 transcription factor

2.3 NtbHLH112 轉錄因子亞細胞定位

構建35s::NtbHLH112::GFP融合載體，利用農桿菌注射本氏煙葉片，瞬時表達NtbHLH112，以檢測NtbHLH112 轉錄因子的亞細胞定位（圖4），試驗發現，融合GFP 的NtbHLH112 只在細胞核中被觀察到，并且能夠與DAPI 染色信號重疊，這個結果表明NtbHLH112 是一個核定位蛋白。

2.4 NtbHLH112 轉錄因子轉錄激活分析

根據轉錄因子轉錄激活原理[26-27]，將NtbHLH112-pBridge 載體轉入AH109 酵母感受態，pBridge 空載作對照，在SD/-Trp 缺素平板培養基上培養3 d 篩選陽性酵母單克隆并轉移至顯色培養基（SD/-Trp/X-gal）上避光培養直至顯色。試驗結果表明，含有NtbHLH112-pBridge 載體酵母表達菌株在顯色培養基上能夠啟動報告基因的表達進而顯藍色（圖5）。而只含有pBridge 空載的對照不能激活報告基因表達，說明NtbHLH112 具有轉錄激活活性。

2.5 NtbHLH112 表達模式分析

RT-qPCR 結果表明，NtbHLH112在根（R）、莖（ST）、幼葉（YL）、成熟葉（NS）、衰老葉（SL）、全花（F）、花蕾（FB）、腋芽（LB）組織中都有表達，在葉中相對表達量較高，特別是在衰老葉片中表達量最高（圖6）。

圖4 NtbHLH112 的亞細胞定位Fig.4 Subcellular localization of NtbHLH112

圖5 NtbHLH112 酵母轉錄激活試驗Fig.5 Transactivation analysis of NtbHLH112 in yeast

圖6 NtbHLH112 在煙草不同組織的表達量Fig.6 Expression of NtbHLH112 in different tissues of tobacco

表達模式分析結果表明（圖7），NtbHLH112基因表達響應多種脅迫以及ABA 處理，其中響應干旱脅迫最為明顯。在干旱脅迫處理條件下，NtbHLH112基因表達量在干旱處理1 h 時最高，是0 h 的5 倍，隨著時間推移表達量開始降低，即使在處理6 h 后，表達量仍然為0 h 的2 倍。在鹽脅迫處理條件下，處理1 h，該基因表達量顯著增高，是未處理的2 倍，隨著時間的推移，表達量急劇降低，在3 h 時，表達量已經低于0 h。冷處理后該基因隨著時間的推移表達量有增高，但低于兩倍。在熱脅迫中，表達量基本不變。此外，ABA 處理中，隨著時間的推移，該基因的表達量顯著降低，在處理6 h 后，表達量降低了一半多。說明，NtbHLH112基因主要受干旱和鹽脅迫誘導，同時在ABA 調控途徑的非生物逆境應答過程中發揮作用。

圖7 NtbHLH112 在非生物脅迫下的表達分析Fig.7 Analysis of expression of NtbHLH112 gene under abiotic stresses

3 討 論

bHLH 轉錄因子在植物的生長發育、生理代謝及脅迫過程中起著重要的調控作用。bHLH 轉錄因子都具有一個高度保守的典型bHLH 結構域。本試驗從普通煙草中克隆獲得NtbHLH112基因，通過生物信息學分析發現其確實具有高度保守的bHLH 結構域。轉錄因子必備的特性是其亞細胞定位應在細胞核且具有轉錄激活活性[26-27]，NtbHLH112 亦符合以上特性。因此NtbHLH112 屬于bHLH 轉錄因子家族。不同物種中很多bHLH 轉錄因子都受干旱誘導[15-17,28-29]，表達量升高從而提高植株的耐旱性。本試驗中在干旱脅迫處理條件下，NtbHLH112基因表達顯著增高，說明NtbHLH112也受干旱誘導。有試驗表明胡楊PebHLH35 轉錄因子能夠調節植株葉片的氣孔密度，使其開度顯著降低，蒸騰速率下降，以提高植物的干旱耐受性[29]，而基因表達模式分析表明，NtbHLH112基因主要在葉片中表達，特別是在成熟葉片中的表達量明顯上升，這表明NtbHLH112基因可能參與一些葉片感知的干旱脅迫。作為NtbHLH112的同源基因，擬南芥AtbHLH112和AtbHLH122，水稻OsbHLH068基因均響應鹽脅迫，并且在植物不同組織的不同部位均有表達，特別是葉片[17-18]。在鹽脅迫處理條件下，NtbHLH112基因表達增高，說明NtbHLH112基因在響應植物的抗鹽脅迫過程的模式與擬南芥和水稻相似。ABA 作為一個重要的信號分子參與植物的脅迫響應，GhbHLH1和AtMYC2經ABA 處理后表達量升高，以提高植物抗性[11,28]；而NtbHLH112基因與以上兩個基因不同，經ABA 處理后，隨著時間的推移表達量顯著降低，即ABA 能夠負調控NtbHLH112的表達。

4 結 論

本研究初步驗證煙草NtbHLH112 屬于典型的bHLH 轉錄因子，在煙草葉片中高量表達，并受到干旱脅迫、鹽脅迫的誘導，同時在ABA 調控途徑的非生物逆境應答方面發揮重要作用。本研究為煙草抗逆育種提供了重要的理論依據。