基于能量循環再生系統酶法生產谷胱甘肽

張 星， 崔向偉， 李宗霖， 李志敏

（華東理工大學生物反應器工程國家重點實驗室，上海 200237）

谷胱甘肽（Glutathione，GSH）是由L-谷氨酸（LGlu）、L-半胱氨酸（L-Cys）和甘氨酸（Gly）通過肽鍵連接而成的活性巰基化合物。GSH 在生物體內具有抗氧化、保護細胞和解毒等功能[1]。作為藥物、食品和化妝品添加劑，GSH 也廣泛應用于醫藥和輕工領域[2-3]。目前，GSH 的生產方法主要包括化學法和生物法。生物法合成GSH 具有反應條件溫和、成本低以及環境污染少等優點。生物法又可分為發酵法和酶法。發酵法生產GSH 存在著底物和產物降解，副產物競爭和下游分離困難等缺點，因而GSH 的生產效率不高[4]。相比于發酵法，酶法生產體系因為組分簡單，底物與酶更易接觸，具有周期短、易操作和得率高等優點[5]。

GSH 的生物合成途徑是通過兩步依賴腺苷三磷酸（ATP）的反應合成，首先，L-Glu 和L-Cys 由γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶催化，生成二肽γ-谷氨酰半胱氨酸，再經GSH 合成酶催化，在γ-谷氨酰半胱氨酸的C 端殘基加上甘氨酸形成GSH[6]。谷胱甘肽雙功能合成酶(GshF)是近年來發現的新型酶，在ATP 和Mg2+或Mn2+存在下，具有可以同時催化GSH 兩步反應的活性[7-8]，這極大地推進了GSH 生物合成的研究進展。酶法生產GSH，一般需要在體系中直接添加價格昂貴的ATP，使得生產成本大大增加，限制了酶法生產的大規模應用。多聚磷酸激酶（PPK）是可以用于ATP 再生的一種激酶，利用底物多聚磷酸（polyP）和腺苷二磷酸（ADP）可以催化合成ATP[9]。底物polyP 因為價格低廉，性質穩定，在ATP 依賴的反應中得到了廣泛應用[10-11]。

本文利用PPK 和GshF 純酶建立級聯反應，利用polyP 代替GSH 合成反應中需要添加的ATP，酶法合成了GSH；同時對酶的表達條件、系統反應條件包括底物濃度、溫度和酶比例等優化后，達到了酶法高效生產GSH 的目的。

1 材料和方法

1.1 菌株與試劑

來源于菌株Thermosynechococcus elongates 的PPK和Streptococcus sanguinis 的GshF 的重組質粒均由本實驗室之前工作構建，并保存于大腸桿菌Rosetta2（DE3）中[12]。ADP、GSH 和polyP 購自美國Sigma-Aldrich 公司，蛋白胨和酵母粉購自英國OXOID 公司，其他試劑均購自上海麥克林生化科技有限公司。試劑純度為分析純或更高純度。

1.2 蛋白表達條件優化

取含有表達質粒的菌株，按2%接種量接入3 mL含50 mg/L 卡那霉素的Luria-Bertani（LB）培養基中，在37 ℃、220 r/min 條件下培養7 h，然后轉接至50 mL LB 培養基中，在37 ℃培養至OD600達到0.6～0.8 之間，加入終濃度為0.2 mmol/L 異丙基-β-d-硫代半乳糖苷（IPTG）誘導，再轉入不同溫度（18 ℃和37 ℃）培養至OD600為3～4。取500 μL（OD600約為3）培養的菌體于12 000 r/min，4 ℃條件下離心10 min，用20 mmol/L Tris-HCl（pH 8.0，含250 mmol/L NaCl）洗滌1 次后，重懸于500 μL 上述緩沖液，冰水浴中超聲破碎（功率200 W，工作2 s 停4 s，90 個循環）。最后將破碎細胞液于12 000 r/min、4 ℃下離心20 min，取上清和沉淀進行聚丙烯酰氨凝膠電泳(SDS-PAGE)，分析蛋白表達情況。

1.3 蛋白純化

將最優誘導表達條件下的細胞收集破碎后，在8 000 r/min、4 ℃離心30 min，得到含有重組蛋白的上清液，利用Ni-NTA 柱對蛋白進行親和層析純化。用含有10～300 mmol/L 咪唑的緩沖液梯度洗脫吸附在柱上的蛋白，SDS-PAGE 檢測各個梯度的蛋白洗脫純度，收集純度較高的蛋白洗脫液，離心濃縮后加入0.20～0.25 g/mL 的甘油置于?80 ℃保存。

1.4 GSH 合成體系的反應條件優化

利用純酶PPK 和GshF 構建GSH 合成體系。標準體系組成（500 μL）：200 mmol/L Tris-HCl (pH 8.5)，50 mmol/L L-Glu，50 mmol/L Gly，50 mmol/L L-Cys，40 mmol/L MgCl2，1 g/L PPK，1 g/L SS（Somatostatin），2 mmol/L DTT (D, L-Dithiothreitol)，2 mmol/L ADP，20 mmol/L polyP，45 ℃反應。按不同時間間隔取樣50 μL，加入三氯乙酸（終質量濃度0.1 g/mL）終止反應，離心取上清利用HPLC 測定GSH 濃度。反應條件優化如下：在反應體系中加入不同濃度比（20∶40，20∶60，30∶60，30∶45，30∶90）的polyP 與MgCl2；在反應體系中添加不同濃度（0.5～4 mmol/L）的ADP；初始pH 8.0 時，考察不同溫度（30～50 ℃）對反應的影響；當氨基酸底物濃度為120 mmol/L，SS 質量濃度為1 g/L 時，考察不同PPK 質量濃度（2～4 g/L）對反應的影響。

1.5 分析方法

細胞密度采用紫外-可見分光光度計在600 nm下檢測樣品吸光度值。蛋白濃度利用購自北京天根生化科技有限公司的BCA 試劑盒測定。GSH 利用高效液相色譜檢測：色譜柱為日本島津公司的Wondasil C18 柱(4.6 mm × 150 mm)，流動相A 為50 mmol/L KH2PO4與10 mmol/L 1-庚烷磺酸鈉混合液(磷酸調節pH 3.0)，流動相B 為純甲醇，流動相A 和流動相B 的體積比為95∶5，柱溫30 ℃，紫外檢測波長210 nm，流速0.6 mL/min。

2 結果與討論

2.1 溫度對蛋白誘導表達的影響

誘導溫度對蛋白表達有著重要的影響，溫度過高會使蛋白翻譯較快，錯誤折疊率加大，容易生成包涵體，導致蛋白失活。GshF 在不同溫度下誘導表達的SDS-PAGE 分析如圖1（a）所示，在37 ℃和18 ℃的細胞破碎上清液中都可看到GshF 的可溶表達，但在37 ℃的裂解液沉淀中可以明顯觀察到有部分不可溶蛋白，說明GshF 在高溫誘導時會形成少量包涵體。PPK 在不同溫度下的誘導如圖1（b）所示，在37 ℃和18 ℃誘導時都會形成較多的沉淀，但37 ℃表達時蛋白大部分都在沉淀中，上清液中幾乎觀察不到可溶蛋白，而在18 ℃表達條件下的上清液中可以觀察到有可溶表達。說明PPK 在低溫條件下也容易產生可溶表達，因為低溫表達時，蛋白翻譯折疊較慢，易于可溶蛋白的生成。

圖 1 誘導溫度對（a）GshF 和（b）PPK 表達的影響Fig. 1 Effect of induced temperatures on the expression of(a) GshF and (b) PPK

2.2 蛋白純化

由于表達的GshF 和PPK 都帶有組氨酸標簽，因此可以通過鎳離子柱親和層析純化。將18 ℃誘導后破碎的細胞上清液過柱洗脫后，得到GshF 和PPK 的純酶液。利用SDS-PAGE 檢測，電泳條帶如圖2 所示。得到的蛋白條帶均一，大小都在90 ku 左右，與根據氨基酸序列推算的理論值一致。

圖 2 GshF 和PPK 的純化Fig. 2 Purification of GshF and PPK

2.3 GSH 合成反應條件優化

GshF 和PPK 合成GSH 的原理如圖3 所示，GshF可以利用L-Glu，L-Cys 和Gly 合成GshF，這是一個耗能反應，需要ATP 參與供能。傳統的酶法催化需要直接加入ATP，極大地增加了生產成本，不利于大規模的生產。polyP 作為能量供體，可以由PPK 催化斷裂磷酸酐鍵，降解的磷酸基團結合ADP 生成ATP。當引入PPK 催化的反應時，在體系中初始加入一定量的polyP 和少量的ADP，即可達到代替GSH 合成反應中需要添加的ATP 的目的，讓ATP 和ADP 在體系中循環再生、高效合成GSH。

圖 3 GshF 和PPK 偶聯合成GSHFig. 3 GSH synthesis by coupling GshF and PPK

2.3.1 PolyP 和MgCl2的濃度比例的優化 PolyP 作為能量供體，在體系內不斷地被消耗，因此polyP 的供給會直接影響到ATP 的生成量，從而影響GSH 的合成效率。但是高濃度的polyP 會和MgCl2發生螯合反應，從而導致polyP 的損失，同時GshF 和PPK為MgCl2依賴的酶，Mg2+濃度的降低也會影響GshF和PPK 的活性，因此合適比例的polyP 和MgCl2對反應效率有著重要影響。如圖4 所示，當polyP濃度為20 mmol/L，MgCl2濃度分別為40 mmol/L 和60 mmol/L 時，60 mmol/L 的MgCl2對體系產生了抑制作用。當polyP 濃度提高到30 mmol/L，MgCl2濃度分別為45、60 和90 mmol/L 時，MgCl2濃度越高，GSH 生產效率也越低。可以看出，當polyP 濃度一定時，MgCl2濃度越高，對反應的抑制效果越明顯。實驗中也發現，高濃度的polyP 和MgCl2會形成白色沉淀。這些結果說明，過高的MgCl2濃度會引起MgCl2與polyP 的螯合反應，降低GSH 的生產效率。當MgCl2濃度都為60 mmol/L 時，加入30 mmol/L polyP的體系生產效率比20 mmol/L polyP 的體系提高約50%，因為30 mmol/L polyP 時，增加了螯合后剩余的polyP 的有效濃度。當polyP 和MgCl2的濃度比為30 : 45 時，反應效率最高。這些結果說明了合適的polyP 和MgCl2的濃度比確實會對催化效率起重要作用。

圖 4 不同polyP/MgCl2 濃度比對GSH 合成的影響Fig. 4 Effect of the concentration ratio of polyP to MgCl2 on the synthesis of GSH

2.3.2 初始ADP 濃度優化 ADP 是雙酶反應體系中的關鍵輔因子，在兩個反應之間起到橋梁作用。因此ADP 濃度可能會對反應體系的催化效率產生較大影響。ADP 也是反應底物中成本較高的底物之一，過多的ADP 會增加系統的成本，不利于GSH 反應的大規模應用。因此，ADP 的初始濃度直接關系到GSH 合成的催化效率和生產成本。對初始的ADP 濃度進行優化，不同ADP 濃度對GSH合成的影響結果如圖5 所示。初始ADP 濃度從0.5 mmol/L 增加到4.0 mmol/L，GSH 的濃度逐漸下降，2.0 h 時GSH 的濃度從15.4 mmol/L 降到4.3 mmol/L，說明在此范圍內，當ADP 濃度為0.5 mmol/L 時，反應的催化效率最高。底物ADP 濃度增加，GSH 生產效率反而降低，說明過高的ADP 濃度對GshF 和PPK 兩酶偶聯催化起到抑制作用，原因可能是ADP 和polyP 的催化通道在PPK 結構上較近，因為ADP 比長鏈的polyP 柔性較強，過多的ADP 會聚集在polyP 的催化通道入口，從而降低了polyP 被催化的活性[13]。

圖 5 不同ADP 濃度對GSH 合成的影響Fig. 5 Effect of the concentration of ADP on the synthesis of GSH

圖 6 溫度對GSH 合成的影響Fig. 6 Effect of temperature on the synthesis of GSH

2.3.3 溫度優化 溫度對酶反應催化有著重要影響，一定范圍內，溫度升高可以提高酶活性，從而增加催化速率。對游離酶體系的溫度進行優化，結果如圖6 所示，在0.5 h 內，50 ℃溫度下GSH 合成速率最快，GSH 濃度達到23 mmol/L。PPK 是來源于嗜熱菌的酶，溫度升高，可以加快ATP 的生成速率，從而提高GSH 的合成速率。在30 ℃條件下，GSH 的合成速率最慢。因為PPK 在低溫下酶活性相對較低，同時根據本課題組研究，30 ℃時GshF 酶活也會下降[12]。在37～45 ℃范圍內，GSH 的生產效率隨著溫度升高而升高。其中，在45 ℃條件下，2 h 反應即達到最高點，相比于其他條件，此條件下的反應速率和GSH 濃度都最高，分別達到了(19.5 ± 0.3)mmol/(L·h)和(39 ± 0.5)mmol/L，得率達到了78%，因此45 ℃為GSH 催化的最適溫度。偶聯體系的最適反應溫度偏高，與GshF 和PPK 的催化性質一致，因為二者的催化活性都隨著溫度的升高而提高[12]。

2.3.4 酶比的優化 在多酶催化體系中，不同的酶比可以影響反應體系中的各個級聯反應速率，從而影響總反應速率和生產效率，因此，在GSH 生產系統中，通過酶比的優化，可以平衡ATP 的生成和消耗，從而提高反應效率。在體系中考察了PPK 與GshF 質量濃度比分別為4∶1，3∶1 和2∶1 時酶比對反應的影響，為了防止底物氨基酸對反應的限制，在體系中將前體的濃度提高至120 mmol/L，如圖7 所示，當PPK 質量濃度從2 g/L 增加到4 g/L 時，GSH 的催化效率也在不斷增加，GSH 的濃度從 (45 ± 0.2)mmol/L 增加到(58 ± 3.3)mmol/L，反應速率從(15 ± 0.03)mmol/(L·h)增加到(19.3 ± 1.1)mmol/(L·h)。因為在雙酶反應中，PPK 為ATP 合成反應，因此，增加PPK 的濃度，可以使得ATP 的再生速率增大，從而增加了總反應速率，提高GSH 濃度。這也說明體系中ATP 的再生速率對總催化速率的限制作用。隨著反應進行，GSH 合成速率逐漸降低，導致半胱氨酸沒有被進一步利用，可能是體系中polyP 降解和GSH 生成導致的pH 的下降，使得PPK 和GshF 酶活降低，無法高效生產GSH[12]。

圖 7 PPK/GshF 酶比對GSH 合成的影響Fig. 7 Effect of ratio of PPK to GshF on the synthesis of GSH

3 結束語

本文通過構建雙酶級聯反應，利用GshF 偶聯PPK 酶法合成GSH。對GshF 和PPK 誘導表達條件進行優化，兩者均在18 ℃下可溶表達量最高。對GshF 和PPK 純化后，建立純酶反應系統，優化反應條件，認為polyP 與MgCl2濃度比在30∶45 下，ADP濃度為0.5 mmol/L，反應溫度為45 ℃時，反應速率最快。當PPK 質量濃度為4 g/L，GshF 質量濃度為1 g/L 時，3 h 內GSH 濃度達到了(58 ± 3.3)mmol/L。Yu 等報道了利用乙酸激酶再生ATP 的系統生產GSH，3 h 時濃度達到了59 mmol/L，是目前報道的GSH 的最高濃度[14]，但此系統所用的高能磷酸化合物為乙酰磷酸，價格昂貴，且不穩定。本研究中的底物polyP 來源廣泛，價格低廉，化學性質穩定，因此，建立的低成本、高效的酶法合成體系為GSH 大規模生產應用提供了參考依據。