髓源性抑制細胞在靶向肝再生磷酸酶-3小鼠乳腺腫瘤基因免疫中的表達

呂娟 黃昊 趙燕田

[摘要] 目的 觀察髓源性抑制細胞（MDSC）在靶向肝再生磷酸酶-3（PRL-3）小鼠乳腺腫瘤基因免疫中的表達，探討MDSC的數量與腫瘤生長的關系。 方法 將40只雌性BALB/c小鼠分為5大組（8小組），空載對照組[pVAX1（-）組]、無佐劑組PRL-3組（K-PRL3組）、佐劑-PRL-3融合蛋白組（K-T-PRL3組和K-PRL3-MT組）及MDSC對照抗體刪除組（K-T-PRL3+Ab control組和K-PRL3-MT+Ab control組），MDSC特異性抗體刪除組（K-T-PRL3+Gr-1Ab組和K-PRL3-MT+Gr-1 Ab組），通過流式細胞術檢測免疫表型CD45、Gr-1及CD11b，分析MDSC在各免疫組外周血、腫瘤、脾臟中的表達水平，觀察MDSC與腫瘤生長的相關性。 結果 荷瘤后第28天K-PRL3組、K-T-PRL3組和K-PRL3-MT組腫瘤體積均小于pVAX1（-）組，差異均有統計學意義（均P < 0.05）;K-PRL3-MT組和K-T-PRL3組與K-PRL3組腫瘤體積比較，差異無統計學意義（P > 0.05）。佐劑-PRL-3融合蛋白組小鼠外周血或腫瘤組織中MDSC表達均高于K-PRL3組，差異有統計學意義（P < 0.05）。MDSC特異性抗體刪除組（K-T-PRL3+Gr-1 Ab組和K-PRL3-MT+Gr-1 Ab組）與MDSC對照抗體刪除組（K-T-PRL3 + Ab control組和K-PRL3-MT+Ab control組）腫瘤體積大小比較，差異無統計學意義（P > 0.05）;MDSC特異性抗體刪除組、MDSC對照抗體刪除組腫瘤體積均大于無佐劑組PRL-3組和佐劑-PRL-3融合蛋白組，差異有統計學意義（P < 0.01）;MDSC特異性抗體刪除組脾臟、外周血MDSC表達均低于對照抗體刪除組，而腫瘤組織中MDSC表達與MDSC對照抗體刪除組比較，差異無統計學意義（P > 0.05），且均大于佐劑-PRL-3融合蛋白組，差異有統計學意義（P < 0.01）。 結論 在靶向PRL-3的小鼠乳腺腫瘤基因免疫中佐劑-PRL-3融合蛋白組腫瘤組織中MDSC與腫瘤生長相關，為進一步優化靶向PRL-3的抗腫瘤免疫治療方案及MDSC相關作用研究提供理論依據。

[關鍵詞] 髓源性抑制細胞;肝再生磷酸酶-3;腫瘤免疫抑制微環境;流式細胞術

[中圖分類號] R735.9 ? ? ? ? ?[文獻標識碼] A ? ? ? ? ?[文章編號] 1673-7210（2020）09（b）-0079-08

[Abstract] Objective To observe the expression of myeloid suppressor cells （MDSC） in targeted phosphatase of regeneratiing liver-3 （PRL-3） mouse breast tumor gene immunity， and to explore the relationship between the number of MDSC and tumor growth. Methods Forty female BALB/c mice were divided into five groups （eight groups）： no-load control group （pVAX1 [-] group）， adjuvanted PRL-3 group （K-PRL3 group）， adjuvanted PRL-3 fusion protein group （K-T-PRL3 group and K-PRL3-MT group）， and MDSC control antibody deletion group （K-T-PRL3+Ab control group and K-PRL3-MT+Ab control group）. In the MDSC specific antibody deletion group （K-T-PRL3+ GR-1AB group and K-PRL3-MT+ GR-1 Ab group）， immunophenotypes CD45， GR-1 and CD11b were detected by flow cytometry to analyze the expression levels of MDSC in peripheral blood， tumor and spleen of each immune group， and the correlation between MDSC and tumor growth was observed. Results On the 28th day after tumor-bearing， the tumor volume of K-PRL3 group， K-T-PRL3 group and K-PRL3-MT group was all smaller than pVAX1 （-） group， with statistically significant differences （all P < 0.05）.There was no significant difference in tumor volume between the K-PRL3-mt group and K-T-PRL3 group and K-PRL3 group （P > 0.05）. The expression of MDSC in peripheral blood or tumor tissues of the adjuvant -PRL-3 fusion protein group was higher than that of the K-PRL3 group， and the difference was statistically significant （P < 0.05）. There was no significant difference in tumor volume between MDSC specific antibody deletion group （K-T-PRL3 + GR-1 Ab group and K-PRL3-mL + GR-1 Ab group） and MDSC Control group （K-T-PRL3 +Ab control group and K-PRL3-MT +Ab control group） （P > 0.05）. The tumor volume of the MDSC specific antibody deletion group and the MDSC control antibody deletion group were all larger than those of the adjuvant-free PRL-3 group and the adjuvant-PRL-3 fusion protein group， with statistically significant differences （P < 0.01）. The expression of MDSC in spleen and peripheral blood of the MDSC specific antibody deletion group was lower than that of the control antibody deletion group， while the difference between the expression of MDSC in tumor tissues and that of the MDSC control antibody deletion group was not statistically significant （P > 0.05）， and was greater than that of the adyuvanted-PRL-3 fusion protein group， with statistically significant difference （P < 0.01）. Conclusion MDSC in tumor tissues in the adjuvant-PRL-3 fusion protein group is correlated with tumor growth in breast tumor by DNA vaccination against PRL-3， providing a theoretical basis for further optimization of anti-tumor immunotherapy against PRL-3 and research on the related effects of MDSC.

[Key words] Myeloid-derived suppressor cells; Phosphatase of regenerating liver-3; Tumor immunosuppressive microenvironment; Flow cytometry

髓源性抑制細胞（myeloid-derived suppressor cells，MDSC）是一群具有負向免疫調節功能的異質性細胞群，與調節性T淋巴細胞（regulatory T cells，Treg）等細胞群體一起構成腫瘤細胞對抗免疫系統的屏障，并誘導機體產生腫瘤免疫逃逸，在腫瘤發生發展中起重要作用，在癌癥、慢性炎癥、感染、自身免疫病、哮喘等發病機制中起關鍵性作用[1-5]。研究顯示[6-8]腫瘤患者及荷瘤鼠中MDSC的表達與腫瘤的發展、轉歸密切相關，MDSC不僅能夠抑制免疫反應，也能促進腫瘤生長，在腫瘤微環境中發揮著重要作用。

肝再生磷酸酶-3（phosphatase of regenerating liver-3，PRL-3）是非跨膜型酪氨酸磷酸酶成員之一，在乳腺癌、胃癌、結直腸癌、肝癌、白血病等多種癌癥中高表達，促進腫瘤細胞的侵襲、轉移，且與預后呈明顯負相關[9-14]，已成為潛在的腫瘤治療靶點[15-18]。本研究前期工作首次從DNA免疫的角度闡述了以PRL-3為靶點的抑瘤效果，通過基因槍免疫方法介導PRL-3相關的DNA來發揮針對高表達PRL-3的小鼠D2F2/PRL-3乳腺腫瘤生長的預防或治療作用[19]。但是，其中佐劑-PRL-3融合基因DNA免疫（該處佐劑分子為“結核分枝桿菌熱休克蛋白TBhsp、結核分枝桿菌T細胞刺激表位MT”等）與無佐劑PRL-3DNA免疫組相比并未表現出明顯的抑瘤作用。這一結果提出機體是否在以PRL-3為靶點的不同配伍的DNA免疫反應中建立了腫瘤免疫抑制微環境促進腫瘤生長。

因此，本研究以腫瘤免疫抑制微環境中細胞群之一MDSC為著眼點，通過流式細胞術檢測其免疫表型Gr-1及CD11b[8]，分析MDSC在各組小鼠外周血、腫瘤、脾臟中的表達水平，并進一步采用注射Gr-1單克隆抗體特異性刪除小鼠MDSC細胞，觀察聯合免疫對腫瘤生長的影響，為MDSC作為腫瘤潛在的診斷、療效監測指標等提供一定的理論依據，為MDSC進一步的抑制功能試驗探索奠定基礎，從腫瘤免疫抑制微環境的角度闡述靶向PRL-3的抑瘤機制。

1 材料與方法

1.1 細胞系及實驗動物

過表達PRL-3的小鼠乳腺癌細胞系D2F2/PRL3及相關基因免疫所用質粒為北京大學臨床腫瘤學院生物化學與分子生物學實驗室惠贈。BALB/c小鼠，雌性，6～8周齡（合格證號1100112011003039）購自北京維通利華實驗動物技術有限公司，由北京大學臨床腫瘤學院動物室飼養，適應性喂養2～3 d。本研究動物實驗已獲首都醫科大學附屬北京朝陽醫院醫學倫理委員會科研課題倫理審批（編號13-科-50）。

1.2 動物分組

靶向PRL-3小鼠乳腺腫瘤基因免疫分為5大組（8小組，5只/組），共40只小鼠：空載對照組[pVAX1（-）組]，無佐劑PRL-3組（K-PRL3組），佐劑-PRL-3融合蛋白組（K-PRL3-MT組和K-T-PRL3組），MDSC對照抗體刪除組（K-T-PRL3+Ab Control組、K-PRL3-MT+Ab Control組），MDSC特異性抗體刪除組（K-T-PRL3+Gr-1 Ab組、K-PRL3-MT+Gr-1 Ab組）。

1.3 靶向PRL-3小鼠乳腺腫瘤基因免疫造模

基因槍免疫方法參照前期工作進行[19]。上述基因免疫各組別基因槍子彈制備包被質粒分別為：pVAX1（-）組包被質粒pVAX1，K-PRL3組包被質粒pVAX1-Igκ-PRL3，K-PRL3-MT組包被質粒pVAX1-Igκ-PRL3-MT，K-T-PRL3組包被質粒pVAX1-Igκ-TBhsp-PRL3。MDSC對照抗體刪除組及MDSC特異性抗體刪除組根據佐劑類型包被上述相對應的質粒。

BALB/c小鼠腹部備皮，基因槍免疫2次，間隔2周，各組別每只小鼠每次免疫2發包裹有相應分組質粒的子彈，每只小鼠每次免疫量為2.4 μg DNA，第2次免疫后2周，行D2F2/PRL3左側脂肪墊注射，每只小鼠細胞注射量2×105個細胞（100 μL PBS介質）。D2F2/PRL3細胞脂肪墊注射后14 d每隔3～6 d觀察瘤體生長狀況，游標卡尺測量腫瘤長短徑，按公式V=XY2/2計算腫瘤體積（mm3，X長徑，Y短徑），繪制腫瘤生長曲線;在荷瘤后第26～28天取外周血、脾細胞及腫瘤組織進行MDSC流式檢測。

1.4 免疫小鼠脾臟及腫瘤組織分離

參照小鼠脾消化試劑盒（德國美天旎，Lot：130-095-926）說明書提取脾細胞，參照小鼠腫瘤消化試劑盒（德國美天旎，Lot：130-096-730）說明書提取腫瘤細胞。按照說明書配置裂解酶混合液，脾臟或腫瘤組織剝離后剪碎放置混合液中碾磨，37℃溫浴 15 min或2～3 h，過濾30 μm或70 μm濾膜后收集至15 mL管中，300 g（半徑r = 18 cm），離心7～10 min，棄上清，流式緩沖液重懸細胞至適當體積待測

1.5 外周血、脾臟、腫瘤組織內MDSC流式檢測

熒光標記流式抗體：CD45-FITC（mouse，clone：30-F11，BD，Lot：553079），CD11b-PE（human and mouse，clone：M1/70.15.11.5，德國美天旎，Lot：130-091-240），Gr-1-APC（mouse，clone：RB6-8C5，德國美天旎，Lot：130-102-385），Rat IgG2b-FITC（BD，Lot：553988），Rat IgG2b-PE（clone：ES26-5E12.4，德國美天旎，Lot：130-102-663），Rat IgG2b-APC（clone：ES26-5E12.4，德國美天旎，Lot：130-102-664）。流式染色緩沖液（Ebioscience，00-4222-26），10×紅細胞裂解液（BD 555899）。BD Accuri C6分析型流式細胞儀。

脾臟與腫瘤細胞調整濃度至1×107個/mL，流式管底加入5～10 μL MDSC相應抗體，與100 μL上述細胞懸液或100 μL EDTA-K2抗凝外周血混勻，室溫避光孵育20 min;每管中加入1×紅細胞裂解工作液（現用現配）2 mL，混勻后避光孵育10 min;1500 r/min離心5 min后棄上清;加入2 mL PBS緩沖液重懸細胞，1500 r/min離心5 min后棄上清;加500 μL PBS重懸，待流式分析。收集105個細胞，以CD45+設門，檢測CD11b+Gr-1+所占比例，進而得出MDSC表達量。

1.6 MDSC刪除實驗

MDSC刪除用抗體：Purified NA/LE Rat Anti-Mouse Ly-6G and Ly-6C（Anti Gr-1）（BD PMG 553122）;對照抗體：Purified NA/LE Rat IgG2b，κ isotype Control（BD PMG 553985）。按“1.3”項下靶向PRL-3小鼠乳腺腫瘤基因免疫流程及DNA用量，選取佐劑-PRL-3融合蛋白組K-PRL3-MT和K-T-PRL3（10只小鼠/組）進行MDSC刪除實驗，先分別行相應質粒包被的基因槍免疫2次，間隔2周，第2次免疫后2周，行D2F2/PRL3左側脂肪墊注射，從接種腫瘤細胞當天起，將每組10只小鼠進一步分成兩組（5只小鼠/組），腹腔注射特異性刪除抗體（Gr-1 Ab）或對照抗體（Ab Control），100 μg/只，后續間隔1～2 d，一共7次抗體注射。每隔3～6 d觀察瘤體生長狀況，繪制腫瘤生長曲線;在荷瘤后第26～28天取外周血、脾細胞及腫瘤組織進行MDSC流式分析。

1.7 統計學方法

采用軟件Graphpad Prism 5（Graphpad software Inc.，San Diego，CA，USA）進行統計分析。計量資料用均數±標準差（x±s）表示。組間腫瘤體積比較及MDSC細胞數用多因素方差分析（ANOVA）統計。以P < 0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 靶向PRL-3小鼠乳腺腫瘤基因免疫腫瘤生長及MDSC表達

2.1.1 靶向PRL-3小鼠乳腺腫瘤基因免疫腫瘤生長情況 ?pVAX1（-）組腫瘤生長最快，荷瘤后第28天 K-PRL3組、K-T-PRL3組和K-PRL3-MT組腫瘤體積均小于pVAX1（-）組，差異均有統計學意義（均P < 0.05）;K-PRL3-MT組和K-T-PRL3組與K-PRL3組腫瘤體積比較，差異無統計學意義（P > 0.05）。見圖1。

2.1.2 靶向PRL-3小鼠乳腺腫瘤基因免疫各組織中MDSC表達變化 ?各組脾臟組織中MDSC表達，pVAX1（-）組、K-PRL3組、K-T-PRL3和K-PRL3-MT組比較，差異均無統計學意義（均P > 0.05）（圖2A、D）。

各組外周血中MDSC表達，K-T-PRL3組及K-PRL3-MT組均大于pVAX1（-）組，差異有統計學意義（P < 0.05或P < 0.01）。K-T-PRL3組大于K-PRL3組和K-PRL3-MT組，差異有統計學意義（P < 0.05或P < 0.01）。其他組別之間外周血中MDSC表達差異無統計學意義（P > 0.05）（圖2B、D）。

各組腫瘤組織中MDSC表達，K-T-PRL3組大于K-PRL3組，差異有統計學意義（P < 0.05）。其他組別之間腫瘤中MDSC表達差異無統計學意義（P > 0.05）（圖2C、D）。

2.2 K-T-PRL3組和K-PRL3-MT組MDSC刪除實驗腫瘤生長及MDSC表達變化

2.2.1 K-T-PRL3組和K-PRL3-MT組MDSC刪除實驗腫瘤生長 ?荷瘤后21 d及23 d，K-T-PRL3+Ab control組及K-T-PRL3+Gr-1 Ab組腫瘤體積均大于K-PRL3組和K-T-PRL3組，差異有統計學意義（P < 0.05）;荷瘤后23～28 d，K-T-PRL3+Gr-1 Ab組小鼠由于體外實驗及自然死亡缺失統計，K-T-PRL3+Ab control組腫瘤體積大于K-PRL3組和K-T-PRL3組，差異有統計學意義（P < 0.05）。K-T-PRL3+Ab control組和K-T-PRL3+Gr-1 Ab組間，K-PRL3和K-T-PRL3組間比較，荷瘤后不同時間點腫瘤大小差異均無統計學意義（均P > 0.05）。（圖3A）。

荷瘤后23 d，K-PRL3-MT+Ab control組和K-PRL3-MT+Gr-1Ab組腫瘤體積均大于K-PRL3-MT組，差異有統計學意義（P < 0.05）;荷瘤后28 d，K-PRL3-MT+Ab control組腫瘤體積大于K-PRL3組和K- PRL3-MT組，差異有統計學意義（P < 0.05）。K-PRL3-MT+Ab control組和K-PRL3-MT+Gr-1 Ab組間、K-PRL3和K- PRL3-MT組間比較，荷瘤后不同時間點腫瘤大小差異均無統計學意義（均P > 0.05）（圖3B）。

2.2.2 K-T-PRL3組和K-PRL3-MT組MDSC刪除實驗中MDSC表達變化 ?各組脾臟組織中MDSC表達，K-PRL3-MT+Ab control組大于K-PRL3組、K-PRL3-MT組、K-PRL3-MT+Gr-1 Ab組，差異均有高度統計學意義（均P < 0.01）。其余不同組別間MDSC表達，差異無統計學意義（P > 0.05）（圖4）。

各組外周血中MDSC表達，K-T-PRL3組大于K-T-PRL3+Ab control組、K-T-PRL3+Gr-1 Ab組，差異均有高度統計學意義（均P < 0.01）。K-PRL3-MT大于K-PRL3-MT+Gr-1 Ab，差異有高度統計學意義（P < 0.01）。其余不同組別間MDSC表達，差異無統計學意義（P > 0.05）（圖4）。

各組腫瘤組織中MDSC表達，K-T-PRL3+Gr-1 Ab組大于K-PRL3組，差異有高度統計學意義（P < 0.01）。K-PRL3-MT+Gr-1 Ab大于K-PRL3組及K-PRL3-MT組，差異均有高度統計學意義（均P < 0.01）。其余不同組別間MDSC表達，差異無統計學意義（P > 0.05）（圖4）。

組間兩兩比較，K-T-PRL3組與K-PRL3-MT組經Gr-1特異性抗體刪除后（K-T-PRL3+Gr-1Ab與K-PRL3-MT+Gr-1Ab），脾臟、外周血MDSC表達均低于刪除抗體對照組（K-T-PRL3+Ab Control、K-PRL3-MT+Ab control），而腫瘤組織中MDSC與對照組比較，差異無統計學意義（P > 0.05），且均大于K-PRL3組（P < 0.01）（圖4B）。

3 討論

腫瘤免疫抑制微環境是腫瘤細胞利用機體免疫系統自身的負調控機制，在腫瘤微環境中建立的全方位免疫抑制網絡，對促進腫瘤發展和抵抗腫瘤治療效應起到關鍵作用[20-22]。該微環境誘導免疫抑制細胞分化、增殖并向腫瘤部位聚集，包括CD4+CD25+ Treg、Gr-1+CD11b+ MDSC、M2 型腫瘤相關巨噬細胞（TAM）等[8，23-24]。MDSC是近二十年來的腫瘤免疫研究領域的熱點。MDSC是一群異質性細胞，來源于骨髓祖細胞。在正常個體，骨髓祖細胞迅速分化為成熟的粒細胞、巨噬細胞和樹突細胞。相反在病理條件下，如癌癥、敗血癥、創傷、移植等，分化為成熟髓樣細胞受阻，導致MDSC大量產生[4]。

本研究在前期工作中將相關病原體源性小肽——TBhsp和MT分別與PRL-3結合構建融合表達基因，以期機體的免疫系統假借識別病原體來對目的蛋白產生反應，從而產生“1+1≥2”的抑瘤增強效應。但是，機體免疫系統的復雜性使得對自身抗原產生免疫力的同時也伴隨著對自身免疫的調節作用，佐劑增強機體對自身抗原免疫反應能力越強，限制Ⅰ型免疫反應的自身免疫耐受發生的可能性就越大，佐劑產生的這種免疫抑制效應可限制疫苗的效力[25]。已有研究顯示[26]，腫瘤自身產生的免疫抑制微環境及免疫抑制分子調控網絡的激活成為腫瘤免疫治療潛藏的最大障礙。如手術后的復發腫瘤和引流淋巴結中有大量M2型巨噬細胞TAM（CD11b+F4/80hiCD206hi和CD11b+F4/80hiCD124hi）和 CD4+Foxp3+Treg 浸潤，導致腫瘤免疫抑制微環境的改變解釋了術后常規免疫治療與術前相比失敗的原因[24]。又如由于腫瘤組織內浸潤有大量免疫抑制類細胞，這一腫瘤免疫抑制微環境的存在抑制了CD8+T細胞反應增強劑IL-15R/IL-15融合蛋白與 HER2/neu單抗的聯合治療的抑瘤免疫效應[27]。

本研究中TBhsp和MT佐劑分子的加入，與單純PRL-3免疫組相比并未表現出明顯的抑瘤優勢，其中MDSC在K-T-PRL3組和K-PRL3-MT組小鼠外周血或腫瘤組織中的表達均高于無佐劑的K-PRL3組，差異有統計學意義，而脾臟中的表達差異無統計學意義，這一結果初步提示MDSC在靶向PRL-3的抗腫瘤免疫中發揮抑制作用。腫瘤免疫抑制微環境具有顯著的異質性和動態變化的特征，對同一腫瘤的不同干預，腫瘤免疫抑制微環境也會隨之發生變化。

腫瘤免疫治療的主要目標是誘發和增強機體有效的抗腫瘤免疫反應，包括促進腫瘤抗原特異的CTL反應、產生腫瘤特異的抗體、促進CD4+ Th細胞反應、自然殺傷細胞的非抗原特異性反應，引起Treg或MDSC等抑制性細胞的減少，或者產生一些促免疫反應細胞因子等[28]。增強抗腫瘤免疫的同時，需要改善或解除腫瘤免疫抑制反應方有望取得良好的治療效果[20]。因此，基于上述結果，本研究用Gr-1單抗以期將K-T-PRL3和K-PRL3-MT組中MDSC特異性刪除，脾臟、外周血MDSC表達均低于刪除抗體對照組，差異有統計學意義，而腫瘤組織中MDSC與對照組比較差異無統計學意義，提示腹腔注射抗體的方式對刪除腫瘤內的MDSC作用不明顯。特異性抗體刪除組與對照抗體刪除組、未刪除組相比均無明顯抑瘤優勢，反而有加速腫瘤生長趨勢。進一步提示腫瘤組織中的MDSC在靶向PRL-3的抗腫瘤基因免疫中對腫瘤免疫抑制微環境的形成有一定作用，也提示我們下一步在腫瘤局部抑制MDSC的生成來優化靶向PRL-3的抗腫瘤免疫治療方案。

本研究結果尚需進一步擴大樣本量驗證，需要值得注意的是具有和MDSC相同表型卻沒有免疫抑制活性的細胞群命名為未成熟髓樣細胞（immature myeloid cells，IMC），這就需要做體外抑制試驗和真正具有免疫抑制功能的MDSC相鑒別[8]，也提示我們在靶向PRL-3的抗腫瘤研究需進一步提取脾臟、外周血及腫瘤組織中MDSC進行更多免疫標志物的篩選和功能驗證，以期更全面地揭示MDSC在機體不同部位組織中的功能。

綜上所述，本研究前期工作的基礎上，運用流式細胞術和一系列體內、體外實驗，明確以PRL-3為靶點的腫瘤模型基因免疫中外周血及腫瘤免疫微環境內MDSC的表達變化，在此基礎上，實施特異性細胞刪除以期達到免疫預防優化目的，從而為全面認識PRL-3在腫瘤發生發展中的作用、提高和發展新的腫瘤治療方案奠定基礎，同時也有可能為研發針對PRL-3的靶向藥物提供一定的理論依據，擴展了PRL-3的研究領域，對于MDSC細胞的相關研究也具有理論參考價值。此次初步探索有助于進一步闡述MDSC與惡性克隆、抗腫瘤效應細胞間的相互關系，為免疫治療提供新靶點，開拓新思路。

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（收稿日期：2020-06-07）