倒提壺多糖的含量測定

隆林　羅朝鳳　李天先　呂磊　周麗

【摘 要】 目的：優選最佳條件，建立倒提壺多糖的含量測定方法。方法：以葡萄糖為標準品，采用蒽酮-硫酸法測定。結果：確定檢測波長為625 nm，最佳提取方法為80%乙醇超聲脫脂及小分子物質，加熱回流提取多糖，測得不同產地的10批倒提壺中多糖的含量范圍為15.56%～29.52%，平均含量為20.60%。結論：本實驗建立的倒提壺多糖含量測定方法簡便，準確，易操作，重現性和準確度良好，可為倒提壺藥材質量研究提供新的依據。

【關鍵詞】 倒提壺;多糖;含量測定

【中圖分類號】R285?? 【文獻標志碼】 A??? 【文章編號】1007-8517（2020）18-0058-04

Determination of Polysaccharide Content in Inverted Kettle

LONG Lin1 LUO Chaofeng2 LI Tianxian1 LU Lei1 ZHOU Li3*

1.Qianxinan Prefecture Food and Drug Inspection and Testing Center， Xingyi 562400， China;

2. Southwest Guizhou Buyi and Miao Autonomous Prefecture Hospital， Xingyi 562400， China;

3. Xingyi National Teachers College， Xingyi 562400， China

Abstract：Objective Optimum conditions are optimized and a method for determining the content of polysaccharide in inverted kettle is established. Methods Glucose was used as the standard and determined by anthrone-sulfuric acid method. Results The detection wavelength was determined to be 625nm. The optimal extraction method was 80% ethanol ultrasonic degreasing and small molecular substances. The polysaccharides were extracted by heating under reflux. The polysaccharide content range of 10 batches of inverted pots from different regions was 15.56% to 29.52%. The average content is 20.60%.Conclusion The method for determining the content of polysaccharides in the inverted kettle pot is simple， accurate， easy to operate， and has good reproducibility and accuracy， which provides a new basis for the research on the quality of the herbs in the inverted kettle pot.

Keywords：Lnverted Pot;Polysaccharide;Content Testing

倒提壺為毛茛科翠雀屬植物云南翠雀花（Delphinium yunnanense Franch）的干燥根，又名飛燕草、小草烏、米草烏、月下參等，以根入藥。我國大部分地區均有分布[1-2] 。生于海拔1000～2400 m的草坡或灌木叢[3] ，其味苦、平，性溫熱，有毒，能驅風除濕、散寒止痛、補陰斂汗，用于治療風濕關節痛、胃寒疼痛、盜汗、跌撲損傷[4]。近年來的研究發現，多糖類化合物具有抗腫瘤、免疫調節、抗病毒、抗衰老、降血糖等多種藥理活性[5]。目前倒提壺多糖的研究分析還未見報道，故本實驗對其進行多糖的提取及含量測定研究，為今后科學分析倒提壺質量和藥用研究方向提供參考。

1 儀器與材料

1.1 儀器 TU-1901型紫外可見分光光度計（北京普析通用儀器有限責任公司）、日本島津AY220電子天平（萬分之一）;賽多利斯CPA225D電子天平（十萬分之一）;數顯恒溫水浴鍋（型號HH-4，金壇市中大儀器廠）。

1.2 材料 實驗所用倒提壺采于貴州各地和云南，將其新鮮的根洗凈，曬干，粉碎過4號篩備用。原植物標本由貴州中醫藥大學藥學院生藥實驗室孫慶文教授鑒定為毛茛科植物云南翠雀花（Delphinium yunnanense Franch）。D-無水葡萄糖對照品（中國食品藥品檢定研究院，批號110833-201508，含量99.9%），10批樣品來源見表1。試劑：蒽酮、硫酸和無水乙醇均為分析純，水為超純水。

2 方法與結果

2.1 對照品溶液的配制 精密稱取D-無水葡萄糖對照品11.14mg，置100mL容量瓶中，用水溶解并稀釋至刻度，搖勻，即得對照品儲備液。

2.2 提取條件的考察

2.2.1 不同前處理對倒提壺多糖提取的影響

2.2.1.1 索氏提取 取2號樣粉末0.25 g，精密稱定， 置索氏提取器中，加入80%乙醇200 mL，加熱提取4 h，取出，濾紙袋及殘渣揮干后置于錐形瓶中，加水100 mL，加熱回流1 h，趁熱抽濾，殘渣用少量熱水洗滌，殘渣重復加熱回流2次，合并濾液與洗液，濃縮放冷后轉移至100mL容量瓶中，加水至刻度，搖勻，取2 mL置50 mL容量瓶中，加水至刻度，搖勻，分別精密取2 mL，照2.5項下操作，依法檢測。

2.2.1.2 超聲提取 取2號樣粉末0.25g，精密稱定，置于具塞錐形瓶中，用80%乙醇100 mL超聲提取（50 ℃ 40KHz）0.5 h，棄其乙醇液，重復提取1次，取出，濾紙袋及殘渣揮干后置于錐形瓶中，按2.2.1.1項下“加水100 mL”起操作，依法檢測。結果見表2。由表2可知，前處理結果多糖含量超聲提取和索氏提取相當，但索氏提取耗時過長，故選用超聲提取。

2.2.2 不同提取方法對倒提壺多糖提取的影響 取2號樣粉末約0.25 g，精密稱定， 共6份樣，80%乙醇超聲提取后，濾紙袋及殘渣揮干，置錐形瓶中，加入100mL水，分別按以下三種方法進行提取：

2.2.2.1? 加熱回流[6] 加熱回流1 h，趁熱抽濾，殘渣用熱水洗滌3次，重復加熱回流2次，合并濾液;

2.2.2.2? 超聲提取[7] 超聲提取（50 ℃40 KHz）1h，趁熱抽濾，殘渣用熱水洗滌3次，重復提取2次，合并濾液;

2.2.2.3? 冷浸提取[8] 冷浸提取24 h，過濾，殘渣用水洗滌3次，重復提取2次，合并濾液。

將濾液濃縮放冷后轉移至100mL容量瓶中，加水至刻度，搖勻，取2mL置50mL容量瓶中，加水至刻度，即得倒提壺多糖供試品溶液。分別精密量取供試品溶液各2 mL，照2.5項下操作，依法檢測。結果見表3。由測定結果可知，三種提取方法中加熱回流提取優于超聲提取和冷浸法提取，故選用加熱回流提取。

2.3 供試品溶液制備 通過比較得出供試液最佳制備方法為：精密稱取倒提壺粉末0.25 g于濾紙袋中，置錐形瓶中，加80%乙醇100 mL超聲提取（50 ℃ 40 KHz）0.5 h，棄其乙醇液，重復提取1次，取出，濾紙袋及殘渣揮干后置于錐形瓶中，加水100 mL，加熱回流1 h，趁熱抽濾，殘渣用少量熱水洗滌，重復加熱回流2次，合并濾液與洗液，濃縮放冷后轉移至100 mL容量瓶中，加水至刻度，搖勻，取2 mL置50 mL容量瓶中，加水至刻度，即得倒提壺多糖供試品溶液。

2.4 檢測波長的確定 精密量取2.1項下對照品儲備液0.5 mL和2.3項下的供試品溶液2.0 mL，置于25 mL比色管中，加水至2.0 mL，分別精密加入預先用冰水冷卻的蒽酮-硫酸溶液（蒽酮0.2 g加硫酸溶解至100 mL）4 mL，混勻，置沸水浴中加熱10 min，冰水浴中迅速冷卻，約20 min時，以相應試劑為空白，在400～700 nm范圍掃描吸光度光譜。掃描結果表明：對照品溶液及供試品溶液勻在625 nm波長處有最大吸收，確定該波長為測定波長。

2.5 標準曲線的繪制 精密量取2.1項下對照品儲備液0.1 mL、0.2 mL、0.3 mL、0.4 mL、0.5 mL、0.6 mL，分別置于25 mL比色管中，加水至2.0 mL，分別精密加入預先用冰水冷卻的蒽酮-硫酸溶液（蒽酮0.2 g加硫酸溶解至100 mL）4 mL，混勻，置沸水浴中加熱10 min，冰水浴中迅速冷卻，約20 min時，以相應試劑為空白，照紫外-可見分光光度法在625 nm的波長處分別測定吸光度，以葡萄糖溶液濃度為橫坐標，吸光度為縱坐標繪制標準曲線，并計算回歸方程和相關系數。得回歸方程為y=0.0565x+ 0.0046， R2=0.999，線性范圍為1.8548～11.1289 μg/mL。標準葡萄糖溶液的濃度與吸光度之間的關系如圖1所示。

2.6 精密度試驗 精密量取2.1項下對照品儲備液0.3 mL，置25 mL比色管中，照2.5項下標準曲線制備項下的方法，以相應試劑為空白，在625nm下進行檢測，連續測定6次。記錄其吸光度值，計算RSD為0.76%，表明儀器精密度良好，符合要求。

2.7 穩定性試驗 精密量取2號樣多糖供試品溶液2 mL，置25 mL比色管中，照2.5項下標準曲線制備項下的方法顯色，以相應試劑為空白，每隔20 min測定其吸光度，連續2 h考察其穩定性，計算RSD值為1.36%，結果表明，本法測定樣品在2 h內穩定。

2.8 重現性試驗 精密稱取2號樣粉末6份，按2.3項下制備倒提壺多糖供試品溶液，取2.0 mL按2.5項下顯色并測定吸光度，計算其含量，結果6份平均含量為24.98%，其RSD為1.87%，說明該方法重現性良好。

2.9 加樣回收試驗 精密稱取已知含量的5號樣粉末6份，每份0.125 g，加80%乙醇100 mL超聲提取（50 ℃ 40 KHz）0.5 h，棄其乙醇液，重復提取1次，取出，濾紙袋及殘渣揮干后置于錐形瓶中，按表5中的量精密加入D-無水葡萄糖對照品，按2.3項下自“置錐形瓶中，加水100 mL，加熱回流1 h”起同法操作，按2.5項下操作并測定吸光度，計算加樣回收率及RSD。

2.10 倒提壺多糖的含量測定 精密量取2.3項下的倒提壺多糖供試品溶液2 mL，置于25 mL比色管中，照2.5項下標準曲線制備項下的方法，自“分別精密加入預先用冰水冷卻的蒽酮-硫酸溶液”起，依法測定吸光度，根據回歸方程，計算倒提壺多糖的含量，結果見表5，多糖的含量范圍15.56%～29.52%，平均含量為20.60%。

3 討論

倒提壺中含有豐富的化學成份，如脂質、蛋白質、氨基酸、生物堿及黃酮等，為不影響多糖的測定，應先除去脂質等小分子物質，本實驗采用80%乙醇來前處理。結果多糖含量超聲提取和索氏提取相當，但索氏提取耗時過長，故選用超聲提取。

多糖含量測定中常用的提取方法有回流提取、超聲提取和冷浸等，為證明哪種方法更適合倒提壺中多糖的提取，本實驗比較了回流提取、超聲提取與冷浸提取。回流提取操作簡單，成本低廉，超聲提取操作簡便、快速，冷浸耗時長，提取不完全。回流提取法多糖含量較超聲提取和冷浸提取更高，故選用回流提取法。本實驗以云南和貴州產的倒提壺為實驗對象，對10個批次的樣本中多糖的含量進行了測定，結果顯示10批次倒提壺多糖含量存在差異，多糖的含量范圍為15.56%～29.52%，平均含量為20.60%，其中興仁魯礎營野生的含量最高，云南宜良人工種植的含量最低。倒提壺為多年生草本植物，所采集的樣品多為野生品，種植的只有一批，樣本量較少，生長環境和生長年限的不同，致其根大小不一，多糖含量的高低是否與其有關，還需做進一步研究。

參考文獻

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[5]劉江，馮銳，鄭穎，等.含多糖類中藥抗腫瘤作用的研究進展[J].中國藥房，2013，24（47）：4497.

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[7]黃芯琦，周小媚，鐘可，等.黔產淡黃花百合中多糖含量的測定[J].中醫藥學報，2019，47（2）：50-53.

[8]國家藥典委員會.中國藥典（四部）[M].北京：中國醫藥科技出版社，2015：2101.

（收稿日期：2020-04-14 編輯：程鵬飛）

基金項目：貴州省科技廳聯合基金：黔科合LH字[2014]7417。

作者簡介：隆林（1976-），女，彝族，本科，副主任藥師，研究方向為藥品檢驗。E-mail：2674312470@163.com

通信作者：周麗（1978-），女，漢族，碩士，教授，研究方向為民族藥用生物資源研究與開發。E-mail：zhouli@xynun.edu.cn