高效液相色譜法測定特殊醫學用途嬰幼兒配方食品中乳鐵蛋白含量

朱丹丹　洪輝　吳紅宇　吳芝岳　辛正杰

摘 要：本研究以食品安全國家標準《食品中乳鐵蛋白的測定（征求意見稿）》為參考，優化預處理步驟和梯度洗脫條件，建立了一種用紫外高效液相色譜測定特殊用途嬰幼兒配方食品中乳鐵蛋白含量的方法。色譜柱為C4，5 μm，300A，250 mm×4.6 mm，流動相A為乙腈，流動相B為0.1%三氟乙酸，檢測波長為280 nm。結果表明，乳鐵蛋白的檢出限為2.3 mg/100 g，定量限為3.9 mg/100 g，在乳鐵蛋白濃度為10～140 μg·mL-1范圍內，檢測結果呈良好線性關系，回收率在98%～105%。用此方法檢測嬰幼兒配方奶粉中乳鐵蛋白含量，操作簡單，結果準確可靠，精密度高，重現性好。

關鍵詞：乳鐵蛋白;高效液相色譜法;特殊醫學用途嬰幼兒配方食品;紫外檢測器

Abstract：This study was based on the national food safety standards food on the determination of lactoferrin， optimizing the pretreatment steps and gradient elution conditions， establishing a method with a HPLC to determin the lactoferrin containingin infant special medical purposes formula food Chromatographic conditions： the chromatographic column was C4， 5 μm， 300A， 250 mm×4.6 mm， the mobile phase A was acetonitrile， the mobile phase B was 0.1% trifluoroacetic acid， and the detection wavelength was 280 nm. The results showed that the detection limit of lactoferrin was 2.5 mg/100 g， and the determination limit was 4.0 mg/100 g which is in the range of lactoferrin concentration of 10～140μg·mL-1. The detection results showed a good linear relationship， and the recovery rate was 98%～105%. The method on determining lactoferrin content in infant formula has more convenient operation， higher precision， higher accuracy and better repeatability.

Key words：Lactoferrin; HPLC; Formula foods for infants and young children for special medical purposes; Ultraviolet detector

中圖分類號：O657.72

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

特殊醫學用途嬰幼兒配方食品，市場購買;乳鐵蛋白標準品（純度≥95%），購自北京美正檢測技術有限公司;乙腈（CH3CN，色譜純，含量≥99.8%），購自美國天地試劑公司;磷酸氫二鈉（Na2HPO4，含量≥99.0%）、磷酸二氫鈉（NaH2PO4，含量≥99.0%）、氯化鈉（NaCl，含量≥99.5%）、氯化鉀（KCl，含量≥99.5%），購自國藥集團化學試劑有限公司;鹽酸（HCl，含量≥99.5%），購自浙江三鷹化學試劑有限公司;三氟乙酸（CF3CO2H，含量≥99.0%），購自上海麥克林生化科技有限公司。

1260高效液相色譜儀，美國安捷倫公司生產;MS105DU，瑞士梅特勒-托利多公司生產;pH計（精度為0.01），瑞士梅特勒-托利多公司生產;TGL-16M冷凍離心機，鹽城市安信實驗儀器有限公司生產;XW-80A渦旋混合器，上海醫大儀器有限公司生產;C4色譜柱，沃特世科技（上海）有限公司生產;乳鐵蛋白肝素免疫親和柱，北京美正檢測技術有限公司生產;0.22 μm微孔濾膜，天津市津騰實驗設備有限公司生產。

1.2 方法

1.2.1 實驗原理

樣品中的乳鐵蛋白經磷酸鹽緩沖液提取，肝素親和柱凈化后，利用C4色譜柱分離，于280 nm波長處紫外檢測器檢測，外標法定量。

1.2.2 試劑配制

（1）磷酸鹽緩沖溶液。稱取8.00 g氯化鈉、2.92 g

十二水磷酸氫二鈉、0.20 g磷酸二氫鉀、0.20 g氯化鉀，用900 mL水溶解后，用鹽酸調節pH至7.4，再加水至1 000 mL。

（2）結合緩沖液。稱取30.083 g十二水合磷酸氫二鈉，2.496 g二水合磷酸二氫鈉，加入20 mL試劑A（50×濃縮液），加入900 mL水溶解，最后定容至1 000 mL。試劑A為升級后此款肝素親和柱配套使用溶液，升級后產品測得回收率更高。

（3）洗脫液。稱取7.52 g十二水合磷酸氫二鈉、0.624 g二水合磷酸二氫鈉、29.2 g氯化鈉，加入400 mL水溶解，最后定容至500 mL。

（4）0.1%三氟乙酸溶液。取三氟乙酸1.00 mL，用水定容至1 000 mL，搖勻，過0.22 μm濾膜，超聲后備用。

如果磷酸氫二鈉和磷酸二氫鈉均為無水，需要進行折算。

1.2.3 樣品處理

（1）提取。稱取3 g（精確至0.01 g）樣本于50 mL螺口塑料離心管中，先加入約30 mL結合緩沖液渦旋振蕩至樣本充分溶解，再加入結合緩沖液定容至刻度，混勻。于4 ℃，9 800 r·min-1轉速條件下離心20 min，離心后輕輕取出中間層，上層有脂質，下面有沉淀，用大量程的移液器將中間液體部分吸出，注意不要吸取上層脂質和下面沉淀。取其中的10～15 mL作為上樣液。

（2）凈化。取出肝素親和柱，注射器針筒直接穿透柱塞，連接肝素親和柱，去掉親和柱下方堵頭，加壓排出柱內的保存液，待柱內保存液與篩板齊平后，取5 mL結合緩沖液平衡親和柱。

（3）上樣。待結合緩沖液液面接近篩板后取凈化步驟處理完畢后樣品提取液15 mL過柱（若樣本量大可分次加入，用SPE流速調節閥控制上樣流速，約0.3 mL·min-1），棄去全部流出液。

（4）淋洗。待樣品提取液加完，液面與篩板齊平后，加10 mL結合緩沖液，進行親和柱的洗雜。

（5）洗脫。進行洗雜后，排干柱內結合緩沖液，向肝素親和柱內加入4 mL洗脫緩沖液，靠重力流速滴出，流速≤1滴/s，收集全部洗脫液，并定容至4 mL，將收集液過0.22 μm濾膜，進樣。

1.2.4 標準曲線的制作

乳鐵蛋白標準儲備液（10 000 μg·mL-1）：在已購買的10 mg乳鐵蛋白標準品小瓶中準確加入1.00 mL磷酸鹽緩沖溶液，渦旋混勻1 min。該標準溶液在-20 ℃下可保存6個月。

乳鐵蛋白標準工作液（1 000 μg·mL-1）：準確吸取標準儲備液50 μL于進樣小瓶中，再準確加入450 μL結合液渦旋混勻。該標準工作液在0～4 ℃冰箱中可保存2周。

乳鐵蛋白標準工作溶液的配制：分別準確吸取標準工作液10、30、50、70 μL和140 μL于5個進樣小瓶中，再分別加入990、970、950、930 μL和860 μL洗脫緩沖液，渦旋混勻，得到10～140 μg·mL-1系列濃度標準液。以濃度為橫坐標，峰面積為縱坐標做曲線回歸方程。

乳鐵蛋白含量計算：

（1）

式（1）中，W-乳鐵蛋白含量，單位為mg/100 g;ρ-樣液檢測濃度，單位為μg·mL-1;4-洗脫體積，單位為mL;V-定容體積，單位為mL;15-上樣體積，單位為mL;m-樣品稱樣量，單位為g;1 000-濃度單位換算系數;n-稀釋倍數。

1.2.5 高效液相色譜條件

色譜柱：Waters Symmetry300tm C4 5μm，4.6×250 mm

Column;柱溫30 ℃;進樣體積30 μL;流速

1.0 mL·min-1;檢測波長280 nm;流動相：0.1%三氟乙酸溶液和乙腈。流動相梯度洗脫程序如表1所示。

2 結果與分析

2.1 乳鐵蛋白的標準工作曲線及標準品

將濃度為10、30、50、70 μg·mL-1和140 μg·mL-1工作液分別進樣，以濃度為橫坐標，峰面積為縱坐標，作曲線回歸方程。結果表明，標準曲線為y=1.878 1x-14.337 4，

線性相關系數R2=0.999 0，線性關系良好。標準曲線圖譜見圖1，標準品圖譜見圖2，樣品圖譜見圖3。

2.2 檢出限和定量限

依據藥典2010版第二部附錄XIX A《藥品質量標準分析方法驗證指導原則》，認為信噪比為3∶1時相應濃度為方法檢出限，信噪比為10∶1相應濃度為方法定量限。從曲線最低點開始分別稀釋至1、3、5、7 μg·mL-1和9 μg·mL-15個濃度，分別得到信噪比約為0.86、3.35、9.08、14.49和21.49，故認為本方法的檢出限為3 μg·mL-1，定量限為5 μg·mL-1。用公式

（1）換算得到相應乳鐵蛋白含量，

（2）

式（2）中：X-試樣中乳鐵蛋白的含量，單位mg/100 g;C-待測液中乳鐵蛋白的濃度，單位μg·mL-1;3.5-洗脫液體積;V-定容體積;15-上樣液體積;m-稱樣量，單位g。計算檢出限時稱樣量以3 g計，定容體積為100 mL。

故本研究中乳鐵蛋白檢出限為2.3 mg/100 g，定量限為3.9 mg/100 g。

2.3 方法回收率

根據《實驗室質量控制規范 食品理化檢測》

（GB/T 27404-2008）的要求，結合實際檢測樣品中的乳鐵蛋白含量以及親和柱的柱容量，對樣品進行3水平的加標測定，同時做空白實驗?；厥章试?8%～105%，表明本方法準確度較高。加標回收結果見表2。

2.4 方法精密度

利用特殊醫學用途嬰幼兒配方食品同一天進行同一樣品進行6個平行試驗，RSD結果1.61%，小于10%，表明本方法的精密度較好，測定見表3。

2.5 方法重現性

對同一批特殊醫學用途嬰幼兒配方食品分別進行6次獨立測定，RSD結果小于10%，表明本方法的重現性較好。測定結果見表4。

3 結論

本方法采用肝素免疫親和柱凈化，C4色譜柱分離，外標法定量。初步建立了一種準確、高效的特殊醫學用途嬰幼兒配方食品中乳鐵蛋白的含量測定方法，結果表明：在10～140 μg·mL-1濃度范圍內，標準曲線具有良好的線性關系，方法的檢出限為2.3 mg/100 g，定量限為3.9 mg/100 g，平均回收率為102%，同一天同一樣品檢測結果RSD為1.61%，耐受性實驗中檢測結果的RSD為3.58%。各數據均符合相應國家標準，且結果良好，能滿足目前大部分市面上嬰幼兒配方奶粉中乳鐵蛋白含量測定。