放療聯合缺氧誘導因子-1抑制劑對荷乳腺癌小鼠治療的作用

劉凱　王紅梅

摘要：本文探討了放療聯合缺氧誘導因子-1（HIF-1）抑制劑對荷乳腺癌小鼠腫瘤生長的影響，構建了BALB/C小鼠4T1乳腺癌模型，隨機分為4組，每組4只，分別為對照組、放療組、HIF-1抑制劑組（因使用HIF-1抑制劑為PX478，以下稱PX478組）、放療聯合PX478治療組（以下稱聯合組），監測4組小鼠腫瘤生長的情況并繪制生長曲線。荷乳腺癌小鼠于25天后，無菌取腫瘤組織、淋巴結及脾臟，觀察免疫印跡分析HIF-1α和MMP-2蛋白含量的情況。結果發現，聯合組腫瘤生長明顯縮小，腫瘤組織的HIF-1α和MMP-2蛋白含量最少。由此可以看出，放療聯合缺氧誘導因子-1抑制劑可抑制荷乳腺癌小鼠腫瘤細胞的生長。

關鍵詞：放射治療? ?缺氧誘導因子? ?腫瘤

腫瘤已成為威脅人類死亡的重要原因，腫瘤的治療方法成為各國學者研究的熱點。免疫系統既可以引起機體抗腫瘤免疫效應，又可以誘導腫瘤細胞形成免疫耐受。免疫系統在腫瘤的發生、進展過程中發揮著雙重作用，可分為三個主要階段：免疫清除、免疫平衡、免疫逃逸。放療可以治療腫瘤，臨床上出現了一種有趣的現象，在腫瘤局部放療時，放射野外遠處轉移病灶也出現了縮小，即“遠位效應”。研究表明，這一現象是由放療激活機體免疫應答引起的。放療聯合免疫治療顯著優于任何單一療法，但對于放療促進抗腫瘤免疫反應的具體機制還需要進一步探討。隨著腫瘤的日益長大，組織缺氧也會變得越發嚴重，缺氧改變了腫瘤微環境，在腫瘤的發生、發展中起到了重要作用，缺氧還改變了腫瘤微環境中重要的免疫因子。下面，筆者將著重探討放療聯合HIF-1抑制劑PX478對荷乳腺癌小鼠腫瘤生長的影響。

一、實驗方法

1.4T1乳腺癌小鼠建模

取將處在對數生長期的4T1乳腺癌細胞注入BALB/C小鼠背部接近后肢處[1ml注射器注射0.1ml（含2×105細胞）細胞懸液]。

2.治療方法

每日觀察荷瘤小鼠腫瘤的生長

情況，按照體積= ×長徑×短徑2

計算腫瘤體積并繪制腫瘤生長曲線，待腫瘤體積≥150-300mm3后（大約7-12天）進行下一步治療。隨機將荷瘤小鼠分為4組（對照組、放療組、PX478組、聯合組），每組4只，每天給予PX478組和聯合組200ul PX478灌胃，對照組和放療組給予200ul PBS灌胃。第13天，對放療組和聯合組荷瘤小鼠進行10Gy的電離輻射放療后，繼續進行灌胃治療，并監測腫瘤大小。

3.取腫瘤組織、脾臟和淋巴結進行數據分析

荷瘤25天，脫頸椎法處死荷瘤小鼠，無菌下收集腫瘤組織，置電子天平稱重，收集脾臟、淋巴結放于5ml培養皿中。

4.腫瘤組織HIF-1α、MMP-2蛋白表達量測定

提取腫瘤組織蛋白，BCA法蛋白濃度測定，SDS-PAGE凝膠電泳、轉膜、免疫印跡及曝光。

5.統計學分析

采用SPSS 19.0統計軟件進行統計學分析，計量數據以均數±標準差（Mean±SD）顯示，兩組以上數據間比較采用單因素方差分析（ANOVA），組間兩兩比較采用LSD檢驗。統計結果值均以P<0.05作為差異，具有統計學意義。

二、結果

1.腫瘤生長

每日觀察腫瘤的變化并記錄生長情況，用體積公式計算出腫瘤大小，并繪制出腫瘤生長曲線，接瘤7天后，腫瘤生長至150-300 mm3，分別給予PX478和聯合組灌胃治療，第13天給予放療和聯合組10Gy放射治療后，繼續進行灌胃治療并監測腫瘤大小。

如圖1中A所示每日記錄腫瘤體積，實驗期間計算每組腫瘤體積平均值，其中，放療組與PX478組腫瘤平均體積無明顯差異（P=0.1894），而聯合組與其余三組腫瘤平均體積的差異均存在統計學意義（P<0.05）。

圖1中B為荷瘤第25天處死小鼠后剝離腫瘤的情況，可以直觀地看出放療組、PX478組、聯合組的腫瘤生長明顯小于對照組。

圖1中C為剝離的腫瘤測重，聯合組與放療組、PX48組腫瘤重量的差異具有統計學意義（P<0.05），而且聯合組與對照組腫瘤重量的差異則有顯著統計學意義（P<0.01）。以上結果提示放療聯合PX478治療可以顯著地抑制荷乳腺癌小鼠腫瘤的生長。

2.PX478對腫瘤組織中HIF-1α、MMP-2蛋白表達影響

我們用Western Blot法檢測使用PX478和放療后腫瘤組織中HIF-1α、MMP-2表達的情況，如圖2所示。結果顯示，聯合組與PX478組的HIF-1α蛋白水平無明顯差異（P=0.1791），聯合組與放療組的HIF-1α蛋白水平的差異具有統計學意義（P<0.05），而且聯合組與對照組的HIF-1α蛋白水平的差異有顯著統計學意義（P<0.01）。由此可見，PX478聯合放療可以導致腫瘤的HIF-1α蛋白水平降低，從而引起的MMP-2蛋白也出現低表達的情況。

三、討論

放療成為腫瘤治療的重要方法之一，1895年11月，倫琴首次發現了X射線。1896年1月，格魯比就用X射線治療了第一例乳腺癌的患者，已有100多年的歷史。研究人員發現放療不同劑量，分割模式對不同腫瘤的治療效果也不一樣。放療通過促進HMGB-1釋放，再刺激抗原呈遞細胞（APC）活化和成熟，促使T細胞的活化，使腫瘤容易被機體免疫識別而被清除。

腫瘤生長需要大量營養，組織缺氧是很多分子信號通路的潛在驅動子，這些驅動子使腫瘤細胞得以存活，并在微環境中生長，使得腫瘤細胞放射敏感度降低。克拉克的團隊于2014年證實在通過高氧預處理多形性成神經膠質瘤后放療效果更好。張玉春的團隊通過較低劑量的照射，抑制低氧誘導因子1（hypoxia-inducible factor-1，HIF-1）等mRNA的表達，改善裸小鼠荷SKOV-3卵巢瘤的缺氧狀況，提高放射敏感性。利用PX478抑制小鼠體內缺氧的微環境，提高放療的敏感度能否提高腫瘤的治療效果是一個值得嘗試的課題。

四、結語

本研究通過構建小鼠4T1乳腺癌模型，用放療聯合PX478可以促進小鼠機體產生抗腫瘤免疫應答，抑制腫瘤生長。與此同時，探索放療的最佳劑量及分割模式以及聯合最優劑量的免疫抑制劑對不同腫瘤的治療效果是一項煩瑣而富有挑戰性的工作。

參考文獻：

[1]胥蕓蕓，洪梅，李桂香.放療對機體抗腫瘤免疫效應機制的影響[J].現代腫瘤醫學，2016（24）.

（作者單位：劉凱? 南昌市衛生學校;王紅梅? 南昌大學基礎醫學院）