新冠疫情下醫學免疫學居家實驗教學探索與實踐①

楊 敬 徐 勇 朱慧芬 林傳友 歐陽興飚 楊真榮 宗義強 吳雄文 鄭 芳 梁智輝

(華中科技大學同濟醫學院基礎醫學院，華中科技大學基礎醫學國家級實驗教學示范中心，武漢 430030)

2019年末，我國突發新冠肺炎疫情，為防止疫情在校園蔓延，教育部下發了延遲2020年春季開學的通知，并發布了關于在疫情防控期間做好普通高等學校在線教學組織與管理工作的指導意見，要求各高校通過多種方式保證疫情防控期間教學進度和教學質量[1]，為此，醫學免疫學實驗課也打破了傳統的教學方式，迎來了新的機遇和挑戰。

實驗教學是醫學課程體系的重要組成部分，是連接基礎醫學和臨床醫學的橋梁[2]，疫情防控期間，為響應教育部“停課不停教、停課不停學”的號召[3]，全國各高等院校均開展了理論課網上直播教學、實驗課虛擬實驗教學等在線教學模式，并取得顯著成效。但虛擬實驗也存在不足，在虛擬環境下，學生處于被動模擬狀態，不能鍛煉實際動手能力，沒有在實踐中發現問題、分析問題和解決問題的機會，不利于學生的全面發展，只有虛實相結合，方能保障“教學標準不降低，教學質量不打折”的實驗教學效果。

為彌補虛擬實驗的不足，我中心教師團隊，積極深化課堂教學改革，深入貫徹落實習近平總書記“堅決打贏疫情防控的人民戰爭、總體戰、阻擊戰”的重要指示精神，不忘初心，砥礪前行，結合醫學免疫學實驗特點，制定并開展了疫情期間系列居家實驗教學項目，全部實驗環節由學生在家里完成，培養了學生的科學精神、創新意識和實踐能力[4]，保障了特殊時期實驗教學工作的順利開展。

1 醫學免疫學居家實驗教學方案

采用“PIELS”(preview-interaction-experiment-labreport-summary)居家實驗教學模式，充分發揮學生主體作用，探索醫學免疫學居家實驗教學綜合改革和創新性人才培養模式。具體方案見圖1。

2 醫學免疫學居家實驗教學準備

2.1居家實驗可行性選擇 我校本科生免疫學實驗課根據專業和課時不同分為4～8次課，本學期有4次實驗課，分別是凝集與沉淀反應，ELISA，免疫器官識別與T細胞凋亡檢測，淋巴細胞分離與NK細胞活性檢測。其中“雙向瓊脂糖凝膠免疫擴散實驗”和“ELISA實驗”操作相對簡便，不受動物、細胞和儀器等實驗條件限制，且可通過目測法觀察到實驗結果，因此，本團隊選擇這兩項實驗作為居家實驗的首次探索和實踐內容。

2.2居家實驗條件摸索 由于同學們散居在全國各地、天南地北，實施居家實驗模式需要將實驗試劑與實驗材料打包通過快遞的方式郵寄至學生家中。湖北及其周邊地區順豐快遞可1～2 d內到達，其他地區一般需要3～4 d，少數地區如新疆則需更長時間。抗原與抗體是“雙向瓊脂糖凝膠免疫擴散實驗”和“ELISA實驗”中重要試劑，能否經過高溫與長途運輸后仍保持較高活性是決定居家實驗能否成功的關鍵因素，為此我們對實驗試劑的有效性、穩定性與實驗可行性進行了探索與優化。

2.2.1雙向瓊脂糖凝膠免疫擴散實驗 “沉淀反應”是檢測抗原抗體反應的實驗內容， 為保障居家實驗的可行性，我們對沉淀反應中“雙向瓊脂糖凝膠免疫擴散實驗”條件進行了改進。① 瓊脂糖濃度的調整：由于1.0%的瓊脂糖凝膠較軟，不利于學生打孔，我們將居家實驗所用瓊脂糖溶液濃度調整為1.5% 。② 瓊脂糖溶液的準備：考慮到學生在家中不方便稱重，我們先將1.5%的瓊脂糖鹽水配好，再分裝至50 ml離心管中凝固寄出，學生在家中取約15 ml凝膠移入50 ml玻璃燒杯中，微波爐低火加熱1～2 min或隔水煮至液體透明即可。③ 抗原、抗體使用濃度：我們在預實驗中將抗原、抗體先放置室溫72 h(武漢，陰雨天氣25～32℃)，以模擬郵寄途中溫度，結果顯示，抗原、抗體維持原濃度常溫放置數天后再進行實驗也可得到較好的實驗結果。

圖1 基于PIELS教學模式的醫學免疫學居家實驗課Fig.1 Experimental class of Medical Immunology at home based on PIELS teaching mode

2.2.2ELISA ELISA是通過抗原-抗體的特異性反應，應用免疫酶技術定量檢測可溶性抗原的常用方法之一，在多數醫學院校免疫學實驗課中均有開設。為保障居家實驗的可行性，我們對其在常溫狀態下的實驗條件進行了摸索、改進與優化。首先，將所有試劑均置于武漢常溫狀態下(武漢，陰雨天氣25～32℃)，72 h后再進行全室溫狀態下的ELISA實驗。實驗結果表明：全常溫狀態下居家實驗包中所有實驗試劑均能保持較高活性，標準曲線相關性好，與實驗室非常溫狀態下(抗原、抗體稀釋后4℃保存)幾乎一致(圖2)。此外，需要注意各實驗試劑的分裝與保存方式略有不同：酶標記羊抗人IgG抗體因疊氮鈉影響其酶活性，故不能添加疊氮鈉進行防腐，需要無菌分裝；其他試劑均可按1∶1 000比例加入的疊氮鈉保存液，以防細菌生長而影響實驗結果；包被、封閉緩沖液無需添加疊氮鈉可在普通環境下分裝。

2.3居家實驗包準備生理鹽水(1 ml/支，1支)；② ELISA實驗：包內試劑可滿足2次實驗需要,包被緩沖液(pH9.6 0.05 mol/L 碳酸鹽緩沖液，1.35 ml/支，2支)；羊抗人IgG抗體(按1∶10稀釋，180 μl，2支，包被時再次按1∶10稀釋)；封閉液(pH9.6 0.05 mol/L碳酸鹽緩沖液，6 ml/支，1支)；牛血清白蛋白(BSA，120 mg/支，實驗前用3 ml封閉液配制成4% BSA封閉液，2支)；標準品人IgG(12 μg/ml,150 μl，2支)；待檢樣本(按一定比例稀釋的人IgG，150 μl，2支)；陰性對照(6 μg/ml BSA溶液，150 μl，2支) ；稀釋液(pH7.4 0.01 mol/L PBS，1.5 ml/支，2支)；辣根過氧化物酶標記的抗人IgG抗體(HRP-Ab，二抗，1∶2 000稀釋，1.5 ml/支，2支)；洗滌液(PBS-T，含0.1%吐溫-20，pH7.4 0.01 mol/L PBS，50 ml/支,1支) ；底物溶液(TMB溶液，1.5 ml/支，2支)。

2.3.1試劑分裝 ①雙向瓊脂糖凝膠免疫擴散實驗：瓊脂糖凝膠(1.5%瓊脂糖溶液經微波爐加熱溶解后， 取30 ml至50 ml塑料管中冷卻，1管)；10 mg/ml 人IgG(50 μl/支，1支)；羊抗人IgG(出廠效價1∶32，實驗時按1∶2稀釋，60 μl/支，1支)；0.9%

圖2 全常溫與實驗室非常溫保存狀態下，ELISA實驗標準曲線Fig.2 Standard curve of ELISA experiment under room or low temperature

2.3.2包裝、運輸 ①將“雙向瓊脂糖凝膠免疫擴散實驗”分裝試劑和下列實驗材料一起放入A密實袋中，封好袋口。實驗材料：打孔器(1個)、打孔模板(1張)、針頭(1個)、載玻片(3片)、50 ml玻璃燒杯(1個)、一次性滴管(2支)、Tip吸頭(若干)、酶標條(稀釋樣本用，2條)。②將“ELISA實驗”分裝試劑和下列實驗材料一起放入B密實袋中，封好袋口。實驗材料：酶標反應條(3條)、一次性吸管(3支)、一次性試管(1支，備用)、Tip吸頭(若干)。③10～100 μl量程加樣器1支、乳膠手套和紙質版居家實驗操作流程及須知。④將以上實驗物品一起放入居家實驗包中，用泡沫或硬紙板塞滿塑料盒以防震蕩，順豐快遞郵寄到學生家中。

3 醫學免疫學居家實驗教學實踐

3.1實驗步驟

3.1.1雙向瓊脂糖凝膠免疫擴散實驗(參考實驗教材[5]) ①溶膠：取出50 ml離心管中的瓊脂糖凝膠塊約15 ml置于50 ml玻璃燒杯中，微波爐低火1～2 min，或將裝有凝膠塊的燒杯放入水鍋中加熱，直至凝膠融化為透明液體。②瓊脂板的制備：將載玻片置于水平臺面上，用吸管吸取加熱的1.5%瓊脂糖溶液4 ml，均勻地澆注在載玻片上。③打孔：待瓊脂糖溶液凝固形成瓊脂板后，置于紙質模板上，用打孔器打出一個中央孔，6個周圍孔，針頭挑出孔內瓊脂糖凝膠塊。④加樣：用加樣器加入10 μl羊抗人IgG抗體于中央孔，周圍孔1～5分別加入1∶2～1∶32 稀釋的人IgG抗原10 μl，周圍孔6加入生理鹽水作為陰性對照。⑤反應：將瓊脂板放入濕盒內，常溫24 h后觀測結果。

3.1.2ELISA實驗(參考實驗技術[6]) ① 包被：取150 μl羊抗人IgG加入到包被緩沖液中(1∶10稀釋)，蓋上EP管蓋，顛倒混勻后加入酶標條孔中，100 μl/孔，置濕盒：室溫過夜。②封閉液配制(4% BSA溶液)：取1支一次性試管，并將BSA粉劑倒入試管中，吸取3 ml封閉液溶解，一次性吸管反復吹打混勻使其溶解，備用。③封閉：棄去包被液，吸水，紙上甩干液體，然后加入上述封閉液，200 μl/孔，置濕盒，室溫2 h。④洗滌：加入洗滌液200 μl/孔，室溫放置3 min傾去，反復3次。⑤加樣：前9孔加入100 μl稀釋液，按圖3將已知含量的參考蛋白IgG進行倍比稀釋，第10孔加待檢樣本， 第11孔加陰性對照，第12孔加入稀釋液作空白對照(各100 μl/孔)，置濕盒，室溫，孵育80 min。⑥洗滌：步驟同④。⑦加酶標記的抗人IgG抗體(即二抗)(100 μl/孔)。⑧孵育：置濕盒，室溫，60 min。⑨洗滌：步驟同④。⑩顯色：加TMB底物溶液，100 μl/孔 ，室溫避光5～15 min或待標準系列各孔呈明顯的顏色深淺梯度時拍照留存并肉眼判斷待測結果。

3.2實驗結果 圖4為學生居家所拍實圖。“雙向瓊脂糖凝膠免疫擴散實驗”結果見圖4A，周圍孔1∶2～1∶16與中央孔間出現清晰的白色沉淀線，抗原含量越高，沉淀線越粗，與中央孔的距離越近，1∶32和陰性對照與中央孔無沉淀線；“ELISA實驗”結果見圖4B，1～9孔標準品，隨著稀釋濃度的降低，顏色逐漸變淺，目測觀察，第10孔待測樣品與標準品第5孔顏色相當，陰性對照和空白對照無色。

3.3居家實驗調查統計 以本校2017級中德班、2018級英護、法醫、中西醫、口腔和醫學檢驗班學生為居家實驗對象，共141人，發放問卷141份，截止7月30日共回收問卷125份。①實驗結果統計：“雙向瓊脂糖凝膠免疫擴散實驗”待測抗原稀釋度在預估區的學生人數為108人(占回收問卷人數86.4%)，偏離預估區1個稀釋度以上的學生人數為17人，(占回收問卷人數13.6%)；“ELISA”待測樣本稀釋度在預估區的學生人數為110人，(占回收問卷人數88.0%)，偏離預估區2個稀釋度以上的學生人數為15人，(占回收問卷人數12.0%)，說明多數同學居家實驗結果較好。②居家實驗體驗感：96人(占回收問卷人數76.8%)認為該居家實驗操作性強，安全性高，總體安排和設計很滿意，實驗有收獲；29人(占回收問卷人數23.2%)感覺居家實驗不便，個人操作容易失誤或試劑漏損等因素導致體驗感差，說明少數學生對居家實驗感到不適，我們的居家實驗教學工作有待進一步提高。

圖3 抗原標準品的倍比稀釋與樣品孔設置Fig.3 Multiple proportions dilution of standard antigen and the wells of sample

圖4 學生居家實驗結果Fig.4 Experiment results done by student at home

3.4居家實驗中出現的小問題與解決方法 雖然教師已盡量針對實驗中可能出現的問題提前進行了解決，但實際操作過程中仍出現了些許小問題，通過與老師在線交流、分析失誤原因，同學們采用改進方法、重配試劑等手段自主解決了以下問題。

3.4.1雙向瓊脂糖凝膠免疫擴散實驗 ①煮沸凝膠方法操作不當，導致水分揮發，膠量不足。解決方法：取膠時應盡量搗碎凝膠塊，并適量加入純凈水(約5 ml)，在鍋中融膠時需不斷攪拌，以便充分溶解。②實驗結果無沉淀線，查找原因：加樣時抗原抗體加反導致。解決方法：認真閱讀操作說明，重新再做。③EP管中的實驗抗原、抗體量較微量，運輸過程中試劑會沾到管壁上，學生誤認為試劑遺漏。解決方法：用力甩幾下EP管，讓試劑下沉。

3.4.2ELISA實驗 ①抗人IgG抗體遺漏。解決方法：兩次實驗試劑合并為一次；可以采用雙擴抗體，按比例稀釋。②空白管、陰性實驗管有較深顏色，濃度梯度不好。解決方法：認真閱讀操作說明和觀看操作視頻，查找原因，重新再做。

疫情期間，給醫學免疫學實驗教學帶來巨大挑戰，在師生異地條件下，雖不能像往常一樣在實驗室正常進行授課，但利用豐富的網絡資源和線上交流平臺以及方便的物流讓學生在家中也可以做實驗。與傳統教學模式和虛擬仿真實驗教學相比較[7，8]，PIELS居家實驗教學模式，充分尊重學生個性化發展，學生可通過課前預習、師生線上互動、獨立實驗、實驗報告、調查問卷和教師點評等環節，鞏固理論知識，提高居家獨立實驗操作技能，加深對基本概念和原理的理解，激發探索科學的好奇心，實現學生的全面發展；教師通過建立微信“家庭實驗討論群”對學生在實驗操作中遇到的各種問題進行遠程輔導和答疑，在拓展學生知識的同時，了解學生居家實驗難點，鼓勵學生自主解決實際操作問題，改進實驗方法，形成以學生為主體的實驗教學模式。我們通過系列居家實驗項目的首次探索，積累了一定的實驗教學經驗，保障了實驗教學進度和教學質量，得到學生們的認可，為重大疫情和災難下構建居家實驗教學新模式奠定了基礎，也為校內開展自助式實驗實踐訓練摸索了條件，值得各大高校推廣和應用。