七氟醚后處理對缺血缺氧性腦損傷新生大鼠海馬內磷酸化cAMP反應元件結合蛋白表達的影響

潘 峰

（浙江大學醫學院附屬婦產科醫院，浙江 杭州 310000）

CREB即cAMP反應元件結合蛋白是一種真核生物細胞核內蛋白質，其功能是調節基因的轉錄。CREB磷酸化（pCREB）可以調節多種基因的轉錄，對多項生命活動具有調控作用，尤其與細胞的生存、動物的學習記憶過程等分子神經機制密切相關[1]七氟醚后處理對缺血缺氧性腦損傷新生大鼠具有神經保護作用，但其與新生大鼠海馬內磷酸化cAMP反應元件結合蛋白表達的關系并未明確，本實驗通過建立新生大鼠缺血缺氧性腦損傷（Hypoxic-Ischemic brain injury，HIBI）模型，應用七氟醚對其進行后處理，探討七氟醚后處理對缺血缺氧性腦損傷的影響是否與CREB磷酸化表達增加有關。

1 材料與方法

1.1 實驗分組

7 d齡SD大鼠，體重12～16 g。將大鼠隨機分為3組：假手術組（sham組）；腦缺血缺氧模型組（HI組）；腦缺血缺氧+2%七氟醚后處理組（HI+2%sev組）。

1.2 模型制備

將7 d齡新生SD大鼠麻醉后，應用0.2%碘伏棉球消毒頸部皮膚，沿頸部正中線作縱行切口，解剖顯微鏡下分離出左側頸總動脈，用7-0絲線兩次永久結扎左側頸總動脈，大鼠清醒后，將其放回母鼠所在籠中繼續喂哺2 h，然后將實驗大鼠置于自制的半密閉箱內，經進氣孔向箱內持續輸入2 L/min流量的8%氧氣與92%氮氣的濕化混合氣體2 h。假手術組則不進行缺氧處理，僅呼吸室溫下空氣，模型組實驗動物低氧處理2 h后，置于室溫下自然恢復15 min后歸至母鼠所在籠中繼續喂哺，假手術組實驗動物不結扎左側頸總動脈，不吸入低氧的混合濕化氣體，其余操作與手術組相同。

1.3 七氟醚后處理

2%七氟醚后處理組于腦缺血缺氧后即刻置于自制的半密封箱內，吸入2%七氟醚（由濃度為30%的氧氣和70%的氮氣輸送）30 min，七氟醚后處理結束后，將實驗大鼠置于自然環境下恢復至完全清醒后歸于母鼠所在籠中繼續喂哺。

1.4 Western Blot檢測CREB磷酸化蛋白水平

七氟醚后處理48小時后，每組大鼠在深麻醉下取左側海馬，放入勻漿液中低溫勻漿，15000r/min，4℃離心20 min，取上清。按Bradford法測定樣本蛋白濃度后加入4倍樣本緩沖液（250 mmol/L Tris /HCl，0.01%考馬斯藍亮-G，8%SDS，200 mmol/L蔗糖，和300 mmol/L Dithiothreitol,pH6.8）,95℃ 5 min變性。30 μg等量的樣本加在10%的SDS聚丙烯酰胺凝膠上電泳（120 V，1.5 h），然后電轉至硝酸纖維素膜上（100 mA，2 h），5%脫脂奶粉封閉30 min后與兔抗pCREB多克隆抗體（1:400）和G-APDH兔抗大鼠抗體4℃孵育過夜，TBST沖洗3×10 min，加入堿性磷酸酶標記的羊抗兔二抗（1:1000），室溫振蕩孵育1 h，TBST沖洗3×10 min，ECL顯色，選用GAPDH為內參蛋白,應用美國Azure凝膠成像系統獲得圖像。

2 結 果

與sham組相比，HI組與HI+2%sev組左側海馬組織中磷酸化CREB表達明顯下降，差異有統計學意義（P＜0.05）；與HI組相比，HI+2%七氟醚后處理組海馬組織中磷酸化CREB表達明顯升高，差異有統計學意義（P＜0.05）。見表1。

表1 各組大鼠左側海馬組織pCREB的表達（n=6，±s）

表1 各組大鼠左側海馬組織pCREB的表達（n=6，±s）

組別 n pCREB的表達Sham組 6 0.96±0.02 HI組 6 0.38±0.03*HI +2%sev 6 0.63±0.07*△

3 結 論

2%七氟醚后處理30 min可上調缺血缺氧性腦損傷新生大鼠損傷側海馬組織中CREB的磷酸化水平，其減輕新生大鼠缺血缺氧性腦損傷可能與上調大鼠海馬中CREB的磷酸化水平有關。

4 討 論

在后處理的七氟烷的濃度上，有研究證實2.6%的吸入濃度可以產生成年大鼠1到1.5MAC值[2]，同時在7 d新生大鼠，通過鉗夾尾部中段，觀察體動來判斷，2%七氟烷的吸入濃度可以產生1MAC值[3]。同時，就后處理的吸入濃度上，已有文獻證實，1到1.5MAC可產生保護作用。所以本研究選擇吸入2%七氟烷后處理30 min，產生1MAC的麻醉效果。CREB磷酸化（pCREB）可以調節多種基因的轉錄，對多項生命活動具有調控作用，尤其與細胞的生存、動物的學習記憶過程等分子神經機制密切相關。大腦中的海馬區是與記憶活動密切相關的區域，早期研究表明小鼠海馬區長時程記憶增強是轉錄依賴性的，之后又有研究指出，在海馬神經原中加強凋節NMKA受體，也依賴CREB的磷酸化。CREB作為一種核內轉錄因子，磷酸化后能夠激活或促進一系列與學習記憶相關的基因表達，表達長時間記憶相關蛋白，在短時間記憶轉變為長時間記憶過程中起到關鍵的分子開關作用。本研究結果顯示CREB磷酸化水平的升高可能參與介導七氟烷后處理引起HIBI新生大鼠學習記憶能力的改善。七氟醚后處理的神經保護作用有很多可能的機制參與，其機理極其復雜，本實驗僅就CREB磷酸化表達的變化進行了探討，具體的信號轉導過程以及可能的機制還有待進一步研究。