精子DNA碎片率和精液常規參數與年齡的相關性研究

陳亞強　吳成亮　邢夢雪

[摘要] 目的 分析男性不育患者年齡與精子DNA碎片率和精液常規參數的相關性。 方法 選擇2018年1～12月在本院男科就診的患者725例，按照年齡將患者分為三組。20～29歲組（n=229），30～39歲組（n=371），40～49組（n=125），采用染色質擴散（SCD）實驗檢測精子DNA碎片率，按照《世界衛生組織人類精液檢查與處理實驗室手冊》（第5版）中標準檢測精液常規各參數。分析精子DNA碎片率（DNA fragmentation index，DFI）和精子參數在各組的差異及年齡與精子DNA碎片率和精液參數的相關性。 結果 年齡與DFI之間存在正相關關系（r=0.273，P<0.01），與精子活力（r=-0.131，P<0.01）、精液pH（r=-0.080，P<0.05）之間存在負相關關系，與精子濃度之間的相關性差異無統計學意義。精液pH與精子濃度之間存在正相關關系（r=0.285，P<0.05）。 結論 伴隨著男性年齡的增長，精子的活力會降低，并使男性的生育力下降以及對子代產生不良影響，精子DFI與精液常規各參數無相關性。故精子DNA碎片檢測可作為精液常規分析的補充，進一步反映男性的生育能力。

[關鍵詞] 男性不育;年齡;精子DNA碎片;精液常規參數

[中圖分類號] R698.2? ? ? ? ? [文獻標識碼] A? ? ? ? ? [文章編號] 1673-9701（2020）25-0033-04

A study of the correlation between age and sperm DNA fragmentation index and the routine semen parameters

CHEN Yaqiang1? ?WU Chengliang1? ?XING Mengxue2

1.Department of Assisted Reproduction， Maternal and Child Health Hospital of Jiujiang in Jiangxi Province， Jiujiang 332000， China; 2.Department of Clinical Laboratory， Maternal and Child Health Hospital of Jiujiang in Jiangxi Province， Jiujiang? ?332000， China

[Abstract] Objective To analyze the correlation between the age of male infertile patients and sperm DNA fragmentation index（DFI） and the routine parameters of semen. Methods 725 patients treated in Department of Andrology of our hospital from January to December 2018 were selected and divided into three groups according to their age. For the group at the age of 20-29（n=229）， the group at the age of 30-39（n=371）， and the group at the age of 40-49（n=125）， the sperm DFI was detected through sperm chromatin dispersion（SCD） test， and the various routine semen parameters were detected according to the standards in "WHO laboratory manual for the examination and processing of human semen"（The 5th Edition）. The differences of sperm DFI and sperm parameters among the groups and the correlation between age and sperm DFI and the semen parameters were analyzed. Results There was a positive correlation between age and DFI（r=0.273， P<0.01）， and a negative correlation between age and sperm motility（r=-0.131， P<0.01）， age and the semen pH（r=-0.080， P<0.05）， and the difference in the correlation between age and sperm concentration was statistically insignificant. There was a positive correlation between the semen pH and sperm concentration（r=0.285， P<0.05）. Conclusion With the increase of the age of men， sperm motility may decrease， affecting male fertility. Sperm DFI has no correlation with the various routine semen parameters. Therefore， the detection of sperm DNA fragments test can be used as a supplement to routine semen analysis， further reflecting the male fertility.

[Key words] Male infertility; Age; Sperm DNA fragment; Routine semen parameters

據世界衛生組織報道，近年來不孕不育癥患者增加，其中男性的比例占一半左右[1-2]，男性的年齡對生育和子代的影響越來越得到關注。有研究認為年齡與男性生育后代的兒童癌癥、神經系統疾病及自閉癥相關[3-5]。精液的常規檢查已經不能滿足臨床需求，約有15%男性精液常規分析結果正常仍不育[6]。隨著科學的進步，遺傳物質的完整性對生物的發育影響逐漸被人們重視。精子DNA碎片率可反映遺傳物質的完整性或損傷程度，精子DNA碎片率增加會導致IVF受精率下降和胚胎發育異常增加[7-10]，從而降低臨床妊娠率。同時也增加子代罹患認知神經疾病、常染色體顯性疾病、先天性疾病和其他疾病的風險[11]。本研究測定了725例男性患者精子DFI、精子濃度、精子活力和pH等參數，精子DFI和精液常規等多參數與年齡之間相關性分析，進而研究年齡在男性生育能力和對子代的影響方面的作用，現報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

收集2018年1～12月來我院輔助生殖不孕不育科門診就診的患者中725例標本，所有DNA碎片率結果的標本。標本均符合WHO實驗室手冊（第5版）要求的精液結果。按照年齡分成20～29歲組（n=229）、30～39歲組（n=371）、40～49組（n=125）三個組。排除標準：由支原體、衣原體、細菌等病原微生物感染所導致精子質量受到影響者;存在功能性、器質性等原因不育者;最近1個月內有使用過對精子功能產生影響的相關藥物進行治療者;且三組中無性功能障礙史者;無睪丸、附睪、輸精管等生理和解剖異常問題者;無染色體缺失、重排、異位等異常及性激素紊亂者。禁欲天數都控制在2～7 d之內，精液量完整，分組具有可比性。

1.2 方法

1.2.1 精液常規? 所有患者均已禁欲2～7 d，以手淫法留取標本于潔凈的一次性塑料容器中，液化后取4.5 μL，以江蘇瑞琪CFT-9202型精子質量檢測分析系統進行精液常規分析。每份標本檢測兩次，每次觀察至少5個視野且大于200條精子。檢測各組精液的精子濃度、活力PR+NR級精子百分率等參數。

1.2.2 精液pH? 采用上海三愛思試劑有限公司生產精密試紙pH 5.5～9.0。

1.2.3 DFI檢測? 采用精子染色質擴散法SCD（Sperm chromatin dispersion），由深圳華康生物科技有限公司生產的精子DNA碎片檢測試劑盒，該產品生產許可證編號：粵食藥監械生產許20030802號。實驗操作：①室溫調整至20℃～28℃;試劑盒取出放置室溫平衡30～60 min。②將低熔點瓊脂糖管放入90℃～100℃水浴1～2 min至瓊脂糖凝膠完全熔解，然后將管子放置于37℃水箱至溫度恒定。③稀釋精子密度至5×106～10×106/mL，再吸取60 μL上述已經稀釋的精子溶液加到已熔解低熔點瓊脂糖管中，充分混勻。冬天操作應防止瓊脂糖凝固，操作應迅速。④將含有精子的低熔點瓊脂糖懸浮液取出滴加到水平放置的預處理載玻片上，最好從一端緩緩蓋上蓋玻片，以避免產生多余氣泡。⑤將帶有上述瓊脂的載玻片置于2℃～8℃冰箱放置4～5 min，以使低熔點瓊脂糖完全凝固。從冰箱取出載玻片，移走蓋玻片。⑥將處理好后的載玻片沒入變性液中充分反應，取出載玻片，浸泡在蒸餾水中;之后取出載玻片使其垂直放置，用吸水紙吸干表面多余水珠，勿接觸標本區域;再將載玻片浸入裂解液中準確反應20 min。⑦反應完畢后，將預處理載玻片浸入洗滌液，以除去多余裂解液。由于裂解液為有毒性物質，此反應中應做好防護，如佩戴護目鏡、N95口罩、帽子等。之后取出依次浸入70%、90%、100%乙醇溶液中脫水。⑧讓預處理載玻片自然晾干。⑨用瑞氏染液進行染色。將染色液A液與B液按等比倒在棕色玻璃瓶中進行混合配制。水平放置預處理載玻片，將混勻好的染液加到玻片上，使其覆蓋滿整塊載玻片。染色后，看到表面覆蓋一層金黃色薄膜時，將染色后的載玻片以蒸餾水緩緩沖洗多次以便除去多余的染液殘渣。待其干燥后在40倍普通光學顯微鏡下觀察計數。精子DNA碎片判定標準參照相關文獻報道[12]。

1.3 統計學方法

采用SPSS19.0統計學軟件進行數據處理，計量資料以均數±標準差（x±s）表示，符合正態分布和方差齊性的數據，采用單因素方差分析，不符合正態分布和方差齊性的數據采用非參數秩和檢驗;相關性分析采用Pearson檢驗，P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 各年齡組間的精液多種參數與DFI的比較

將全部725例符合要求的標本納入研究，各組精子DFI、精子濃度、精子的活力、精液pH均數和方差總結表明，單因素方差分析顯示年齡與DFI、與精子活力、精液pH之間相關性差異有統計學意義（P<0.05），與精子濃度之間的相關性差異無統計學意義（P>0.05）。見表1。

2.2 年齡、DFI和精液參數相關性分析

年齡與精子DFI相關性分析結果顯示，年齡與DFI之間存在正相關關系（r=0.273，P<0.01），與精子活力之間存在負相關關系（r=-0.131，P<0.01），與精液pH之間存在負相關關系（r=-0.080，P<0.05），與精子濃度之間的相關性差異無統計學意義。

精子DFI與精子各參數相關性分析結果表明，精子DFI與精子濃度之間存在負相關關系（r=-0.083，P<0.05），與精子活力之間存在負相關關系（r=-0.359，P<0.01），與精液pH之間存在負相關關系（r=-0.049，P<0.05）。精液pH與精子濃度之間存在正相關關系（r=0.285，P<0.01），與精子活力之間存在正相關關系（r=0.082，P<0.05）。見表2。

3 討論

有研究表明[13-15]由于精子DNA作為遺傳信息的載體，遺傳信息的丟失會對自然生育或輔助生殖技術治療結局產生不良影響，并可能導致胎停、流產、生化妊娠等不良結局。精子在產生過程中某些程序出現異常，或者機體內環境、體外環境發生改變等多種因素影響下，精子DNA均可能受到損害[16]。目前已知精子DNA損傷的因素[17-21]為：（1）精子發生過程中某些因素誘導細胞的非程序性凋亡，從而產生大量DNA結構受損的精子，并且沒有得到及時清除，促使DFI升高;（2）精子易受自由基攻擊和氧化，活性氧過度產生，超過精子抗氧化的防御能力極限，而體內沒有足夠的氧自由基抑制劑，可誘導細胞內部發生氧化應激反應損失精子DNA，細胞質膜等結構被破壞，致使DFI升高;（3）染色質包裝的異常，精蛋白（P1，P2）的數量和比例異常，使得精子DNA雙鏈不完整，引起DFI升高;（4）放射療法和化學療法等治療方法引起DNA損傷;（5）環境中的微量元素、化學毒物等引起的DNA損傷，如微量元素鎬、硒和一些常見的鉛和鐵等。（6）生活方式等，如酗酒、吸煙、外賣食品、久坐、熬夜、肥胖等不良生活方式都會導致精子DNA異常凋亡。在精子DFI目前的檢測方法主要有精子染色質結構測定法（Sperm chromatin structure assay，SCSA）、SCD。有實驗表明兩種檢測方法的均值有顯著差異，而且SCD測得的精子DFI均值比SCSA較高[22]。本研究采用了SCD法檢測男性患者的精子DFI，并且用相關方法對精液常規各種參數進行檢測。本研究對年齡與精液各項參數進行比較，隨著年齡增加，精子DFI也會增加，這與劉樹沅等[23]研究結果一致。對精子DFI與精液各項參數進行比較，精子DFI與精子濃度、精子活力、精液pH呈負相關關系，精液pH與精子濃度呈正相關關系，這與袁人培等[23]、李非凡等[25]和劉依萍等[26]研究的報道相一致。本實驗設計由于沒有對禁欲時間進行更加詳細的分類統計，可能存在一定不足，會受到禁欲天數影響。但也有研究顯示[27]，禁欲時間與精子DNA完整性關系并非單純正負相關的關系，故本實驗不具體進行分析。

綜上所述，通過本實驗可以看出伴隨著男性年齡的增長，精子的活力會降低，使男性的生育力下降并對子代產生不良影響。常規精液檢查可以從精子的濃度、活力、活率和形態對男性生育力進行分析，但隨著時代的進步，常規精液檢查已經遠遠不能滿足臨床對男性生育力評估的需求。Jennings等[28]對是否應該因為年齡因素做胚胎植入前遺傳學診斷（PreImplantation genetic diagnosis，PGD）進行了研究，并沒有足夠的證據支持需要做PGD，而精子DNA碎片檢測可作為重要的一項檢查，可以較為全面地反映男性的生育能力。有望作為一種常規檢查，與精液常規、精子形態學、免疫學等相關檢查一起作為進行人類輔助生殖技術治療前的常規檢測，從而為臨床提供指導。

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（收稿日期：2020-05-25）