IL-6mRNA在促排卵小鼠種植窗期子宮內膜的表達

姜珊 張建偉

【摘要】 目的：觀察促排卵小鼠種植窗期子宮內膜成熟度及IL-6 mRNA表達。方法：選擇健康性成熟昆明種雌性小鼠20只，隨機數字表法分為觀察組和空白組，檢栓第4天（D4）比較兩組小鼠子宮內膜成熟度及IL-6 mRNA表達。結果：觀察組種植窗期子宮內膜成熟度低于空白組，差異有統計學意義（字2=5.051，P=0.025）;觀察組IL-6 mRNA表達水平低于空白組，差異有統計學意義（t=-2.164，P=0.044）。結論：促排卵小鼠種植窗期子宮內膜發育較正常小鼠延遲，成熟度及IL-6 mRNA表達降低。

【關鍵詞】 小鼠 促排卵 子宮內膜 種植窗期 白細胞介素-6

doi：10.14033/j.cnki.cfmr.2020.27.061 文獻標識碼 B 文章編號 1674-6805（2020）27-0-02

[Abstract] Objective： To observe the endometrial maturity and the expression of IL-6 mRNA in the implantation window of ovulation promoting mice. Method： Twenty healthy and sexually mature Kunming mice were selected， and were randomly divided into the experimental group and the blank group. The mice were killed off in the morning of the 4th day （D4） after being found having vaginal suppository. The endometrial maturity and the expression of IL-6 mRNA were compared. Result： The endometrial maturity in the observation group was lower than that in the blank group， the difference was statistically significant （字2=5.051， P=0.025）. The expression level of IL-6 mRNA in the observation group was lower than that in the blank group， the difference was statistically significant （t=-2.164， P=0.044）. Conclusion： The development of endometrium is delayed， the maturity and the expression of IL-6 mRNA are decreased when ovulation promoting mice are at implantation window.

[Key words] Mice Ovulation induction Endometrium Implantation window IL-6

First-authors address： Shandong First Medical University， Jinan 250062， China

圍著床期子宮內膜對胚胎的容受性是生殖領域的研究熱點。助孕治療應用的各種促排卵藥物，使人體內環境失衡，可能對子宮內膜的容受性存在負面影響[1-4]。本研究觀察促排卵藥物對小鼠圍著床期子宮內膜組織形態及白細胞介素-6（Interleukin- 6，IL-6）mRNA的表達變化，為促排卵臨床方案優化提供參考，具體如下。

1 材料與方法

1.1 一般材料

1.1.1 實驗動物 選取SPF（specific pathogen free）級昆明種雌性小鼠（山東大學實驗動物中心）20只，雄性小鼠10只，8～9周齡，體重（35±5）g。

1.1.2 藥物 注射用尿促性素（human menopausal gonadotropin，HMG，麗珠集團麗寶生物化學制藥公司，75 IU/支，國藥準字H10940097）;注射用人絨毛膜促性腺激素（human chorionic gonadotropin，HCG，麗珠集團麗寶生物化學制藥公司，2 000 U/支，國藥準字H44020674）。

1.1.3 試劑 梯度酒精（75%、80%、95%、100%）、蘇木素-伊紅液、10%中性甲醛液、二甲苯、中性樹膠、去RNase水、2 mol/L NaOAc（pH=4.0）、MMLV逆轉錄酶200 U/μl、逆轉錄反應體系（RT reaction buffer）、Taq DNA聚合酶1 U/μl、PCR反應體系（PCR reaction buffer）、GIT變性液、1.5%瓊脂糖凝膠。

1.1.4 實驗儀器 眼科手術器械、體視鏡（LEICA GZ6）、-80 ℃超低溫冰箱（日本SANYO）、倒置顯微鏡（OLYMPAS CK 40-32ph）、脫水機（ZT-12P）、展片機（ZPJ-1A）、XK96-A型快速混勻器（江蘇省新康儀器廠）、EC250-90多功能電泳儀（EC公司）、PTC-150型PCR擴增儀（美國MJ Research公司）。

1.2 方法

1.2.1 動物分組 20只雌性小鼠按隨機數字表分為觀察組和空白組，每組10只。每籠5只飼養。飼養室溫度20 ℃～22 ℃，相對濕度50%，控制12 h光照，12 h黑暗。

1.2.2 給藥方法 參照文獻[5]建立促排卵小鼠模型，以HMG/HCG聯合方案進行。連續觀察2個動情周期后，于上午9點行陰道涂片檢查為動情前期，觀察組于下午6點腹腔注射HMG 12 IU，空白組給予等量生理鹽水，48 h后觀察組小鼠腹腔注射HCG 12 IU，空白組仍給予等量生理鹽水。觀察組與空白組雌性小鼠均按雌∶雄=2∶1合籠飼養，待檢查雌性小鼠陰道出現陰栓時即為交配成功，此時對雌性小鼠進行標本采集，雄性小鼠則不參與后續標本制作。

1.2.3 標本采集 合籠次晨查有陰栓作為妊娠第1天（D1），檢栓第4天（D4）于上午9點脫頸處死小鼠，取出子宮角，修去宮頸。一側宮角置10%中性甲醛溶液中，石蠟包埋，切片厚度4 μm;擠壓法分離另一側子宮內膜，置液氮中，轉移到-80 ℃超低溫冰箱待檢。

1.2.4 小鼠子宮內膜成熟度比較 光學顯微鏡檢測小鼠子宮內膜組織，根據內膜厚度、間質疏松程度、血管及腺體形態學特征判斷子宮內膜成熟度，觀察組及空白組進行比較。

1.2.5 小鼠子宮內膜IL-6 mRNA表達測定 采用RT-PCR

測定子宮內膜IL-6 mRNA的表達。根據基因序列，參照MEDLINE PubMed nucleotide query進行合成。IL-6引物序列：上游為5-TTGACAAACAAATTCGGTACA-3;下游為5-GAGGTGCCCATGCTACA-3;β-actin引物序列：上游為5-ATGGGTCAGAAGGACTCCTA-3，下游為5-ACGCTCGGTCAGGATCTTCAT-3。取子宮內膜組織約100 mg，加入1 ml Trizol試劑，勻漿器充分勻漿，參照說明書提取總RNA。RT-PCR擴增條件：94 ℃ 1 min;58 ℃ 1 min;72 ℃ 1 min;共35個循環，其后72 ℃延長7 min。經瓊脂糖凝膠電泳，擴增產物通過凝膠成像分析系統攝像測量，分析條帶灰度值，以IL-6 mRNA與內參照β-actin mRNA的光密度值（IOD）的比值作為目的基因mRNA的相對表達量。

1.3 統計學處理

應用SPSS 22.0軟件包行統計處理，計量資料以（x±s）表示，采用t檢驗;計數資料以率（%）表示，采用字2檢驗，P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 兩組種植窗期子宮內膜成熟度比較

觀察組小鼠子宮內膜發育成熟者3只，發育延遲者7只;空白組小鼠子宮內膜發育成熟者8只，發育延遲者2只。觀察組種植窗期子宮內膜成熟度低于空白組，差異有統計學意義（P<0.05），見表1。

2.2 兩組促排卵小鼠種植窗期子宮內膜IL-6mRNA表達比較

觀察組小鼠子宮內膜IL-6 mRNA表達水平為0.45±0.15，空白組小鼠子宮內膜IL-6 mRNA表達水平為0.61±0.17。觀察組IL-6 mRNA表達水平低于空白組，差異有統計學意義（t=-2.164，P=0.044）。

3 討論

子宮內膜容受性是胚胎植入的重要保證，胚胎與子宮內膜具有高度的時空特異性。借助定位、黏附、穿透過程，胚胎才能在子宮內膜著床，而只有建立了容受性的種植窗內膜才能接受胚胎植入[5-6]。促排卵作為助孕技術的重要環節，使患者獲得多個可利用的卵子成為可能，臨床治療方案發展日新月異，然而種植率并不理想。研究表明，誘導排卵藥物的應用，對內膜有不同程度的負面影響，直接或間接干擾內膜發育，并與胚泡發育不同步，而子宮內膜容受狀態的改變，與種植窗內膜組織形態和相關分子水平變化有關，從而對助孕治療結局產生影響[7-8]。人IL-6分子量為21～26 kD，由184個氨基酸組成，是一種重要的多功能細胞因子，能促進細胞增殖、黏附，是炎癥反應的敏感標記物，同時也是子宮內膜種植窗期的重要的分子標志物[9]。研究證實，不明原因不孕女性的子宮內膜IL-6水平降低[10]。孕早期小鼠腹腔注射不同劑量的IL-6對小鼠子宮內膜中白血病抑制因子（leukemia inhitory factor，LIF）mRNA及蛋白水平均有顯著上調作用，作用呈劑量依賴性，鑒于IL-6的生物學特性及其在胚泡著床過程中的特異表達，它可能通過旁/自分泌作用參與子宮內膜容受性的調節[11-12]。

本研究顯示HMG促排卵小鼠光鏡下內膜腺體和間質發育非同步化，部分腺腔直而窄，甚至缺乏應有的腺腔，內膜成熟度明顯延遲，與空白組小鼠比較差異有統計學意義（P<0.05），且子宮內膜IL-6 mRNA表達低于空白組，差異有統計學意義（P<0.05）。提示HMG促排卵對小鼠種植窗期子宮內膜發育存在不良影響，這可能是臨床促排卵治療出現高排卵率低妊娠率的原因之一。

綜上所述，借助小鼠動物實驗，由分子水平探討促排卵對子宮內膜成熟度及IL-6 mRNA表達的影響，為促排卵下的胚泡著床機制提供依據。然而胚胎著床影響因素繁雜，IL-6在子宮內膜的定位及相關的通信網絡及信號通路有待深入研究。

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（收稿日期：2020-04-01） （本文編輯：馬竹君）