PKC介導P38MAPK通路調控結直腸癌細胞MMP-9表達及侵襲的研究

姜媛 謝海娟 王毓興

[摘要] 目的 研究MAPK信號通路對結直腸癌SW480細胞MMP-9表達及細胞侵襲作用的影響。 方法 觀察蛋白激酶C激活劑TPA誘導下SW480細胞形態學的改變;蛋白免疫印跡法檢測MMP-9、P38MAPK蛋白的表達，zymography法檢測MMP-9蛋白的分泌，利用Transwell實驗觀察細胞侵襲能力。 結果 顯微鏡下觀察，隨著TPA濃度的升高，細胞形態逐漸改變成針尖樣;蛋白免疫印跡法顯示，TPA處理下P38磷酸化增加，MMP-9蛋白表達和分泌增加，呈時間依賴性;并且腫瘤細胞侵襲能力隨之增強;而通過預處理PKC抑制劑和P38抑制劑，可明顯抑制TPA誘導的MMP-9表達和細胞侵襲能力。 結論 在結直腸癌SW480細胞中PKC激動劑TPA通過激活P38 MAPK信號通路調控MMP-9表達及細胞侵襲，為阻止結直腸癌侵襲轉移研究提出多方位的作用靶點和新思路。

[關鍵詞] 基質金屬蛋白-9;促分裂原活化蛋白激酶P38;細胞侵襲;蛋白激酶C;結直腸癌

[中圖分類號] R735.35 ? ? ? ? ?[文獻標識碼] A ? ? ? ? ?[文章編號] 1673-9701（2020）26-0004-04

[Abstract] Objective To study the effect of MAPK signaling pathway on the MMP-9 expression and cell invasion in colorectal cancer SW480 cells. Methods The morphological changes of SW480 cells induced by TPA， the activator of protein kinase C（PKC）， were observed. Western blot method was adopted to detect the expression of MMP-9 and P38MAPK protein. Zymography was used to detect the secretion of MMP-9 protein. Transwell experiment was performed for the observation of cell invasion ability. Results Under microscope， with the increase of TPA concentration， the cell morphology gradually changed into pinpoint shape. Western blot method showed that after TPA treatment， the phosphorylation of P38 and the expression and secretion of MMP-9 protein increased in a time-dependent manner， and the tumor cell invasion ability was enhanced. However， the pretreatment of PKC inhibitor and P38 inhibitor can obviously inhibit the MMP-9 expression and cell invasion ability induced by TPA. Conclusion TPA， a PKC agonist， regulates and controls the MMP-9 expression and cell invasion through activating P38MAPK signaling pathway in colorectal cancer SW480 cells， which provides multi-directional targets and new ideas for the research on preventing the invasion and metastasis of colorectal cancer.

[Key words] Matrix metalloproteinase-9; P38 mitogen-activated protein kinase; Cell invasion; Protein kinase C; Colorectal cancer

結直腸癌（Colorectal cancer，CRC）約占全球所有新發癌癥病例的10%，也是我國最常見的消化道惡性腫瘤之一，15%～25%的CRC患者在初診時已發生遠處轉移[1，2]。細胞侵襲是腫瘤轉移過程的前提條件，是腫瘤患者治療失敗和致死的關鍵因素，腫瘤侵襲相關研究一直是結直腸癌研究的焦點。基質金屬蛋白酶（MMPs）是腫瘤浸潤轉移過程中的啟動因子，降解基底膜、細胞外基質等，促進腫瘤細胞向周圍組織浸潤、最終導致遠處轉移[3]。MMP-9是MMPs家族中的重要成員，它參與多種人類腫瘤的發展，通過基底膜和細胞外基質的降解促進腫瘤進展，包括侵襲、轉移、生長和血管生成[4]。國外報道證實結直腸癌患者MMP-9表達水平與預后密切相關[5]。蛋白激酶C（PKC）是調控細胞增殖、凋亡和遷移等多種過程的主要信號因子。有報道顯示，PKC與結直腸癌侵襲密切相關[6，7]。PKC激活劑TPA已被公認為腫瘤促進劑，也是MMPs的強激活劑，可促進乳腺癌細胞侵襲中MMP-9合成和分泌[8]。因此，抑制MMPs被認為是降低腫瘤細胞侵襲潛力的新策略。本研究旨在探討MAPK信號通路對結直腸癌細胞PKC/MMP-9表達和細胞侵襲的作用，為進一步了解結直腸癌侵襲遷移提供多方位的分子位點，現報道如下。

1 材料與方法

1.1 材料來源

人結直腸癌SW480細胞株（中科院上海細胞庫），RPMI-1640培養基（Gibco公司）;胎牛血清（Hyclone公司）;TPA、GF109203X、SB203580（Sigma公司）;Bradford蛋白濃度測定試劑盒、ECL試劑盒（北京索萊寶公司）;anti-p38、anti-p-p38、anti-β-actin（Abcam公司）;anti-MMP-9、HRP標記IgG（Santa Cruz公司）;Transwell侵襲系統（costor公司）。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養 ?人結直腸癌細胞株SW480細胞使用10%胎牛血清（FBS）和1%抗生素的RPMI-1640培養基，在5%CO2、37℃培養箱中培養，當細胞生長至80%～90%時進行傳代培養。

1.2.2 細胞形態學觀察 ?取對數生長期SW480細胞，按所需濃度接種于6孔板中，待細胞長至50%～60%愈合后，更換新鮮培養基，給予不同濃度（0、20、50、100 nM）TPA處理24 h后，在倒置顯微鏡下觀察細胞形態學變化。

1.2.3 蛋白印跡法檢測蛋白表達 ?根據研究目的，100 nM TPA處理0、0.5、1、3、6、12、24 h，或用1 μM GF109203X、20 μM SB203580預處理SW480細胞1 h，然后與100 nM TPA共孵育24 h。用冰冷的蛋白提取液裂解細胞，用Bradford法測定裂解液中的蛋白質濃度。每組30 μg蛋白與2×SDS加樣緩沖液混勻制備成上樣液，進行SDS-PAGE電泳分離蛋白，并轉移到PVDF膜上，用5%脫脂牛奶封閉2 h，然后在4℃下與1∶2000稀釋的一抗孵育過夜，洗膜5次，以1∶2000稀釋的HRP-IgG二抗常溫孵育2 h，洗膜，用ECL試劑盒顯色，用圖像分析儀通過信號分析確定蛋白表達水平。

1.2.4 明膠酶譜法檢測MMP-9的活性 ?使用無FBS的培養基進行處理，用1 μM GF109203X、20 μM SB203580預處理SW480細胞1 h，然后與100 nM TPA孵育24 h。經24 h處理后收集培養基，與非還原樣品緩沖液混合，在含有0.1%明膠的聚丙烯酰胺凝膠中電泳，用2.5%Triton X-100溶液在室溫下洗滌30 min，然后用5 mM CaCl2，0.02% Brij，50 mM Tris-HCl（pH=7.5）溶液在37℃中孵育過夜。用0.25%考馬斯亮藍染色及脫色，并在圖像分析儀上拍照。

1.2.5 Transwell檢測細胞侵襲能力 ?利用Transwell侵襲實驗檢測各實驗組對SW480細胞的侵襲作用。侵襲實驗在24孔板中進行，用20 μL基質膠涂層。基質膠在培養基中重新水化30 min，各組細胞懸液分別加入上室，條件培養基加入下室孵育24 h。孵育后，用棉簽去除腔室上側的細胞，0.1%甲醇固定細胞并用臺盼藍溶液染色，利用光學顯微鏡隨機5個視野計數侵入細胞。

1.3 觀察指標

觀察各組細胞形態學變化、P38MAPK信號通路、MMP-9蛋白表達以及細胞侵襲能力的變化。觀察各種抑制劑對TPA誘導MMP-9蛋白表達及分泌的影響。

1.4 統計學方法

采用SPSS16.0統計學軟件對實驗結果進行分析。計量資料以均數±標準差（x±s）表示，多組數據比較采用單因素方差分析，組間比較采用獨立樣本t檢驗，P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 TPA對SW480細胞形態學的影響

觀察不同濃度（0、20、50、100 nM）PKC激動劑TPA誘導SW480細胞24 h后細胞形態學的變化，如封三圖1所示：空白對照細胞之間有緊密聯系，具有上皮細胞特點;隨著TPA濃度升高SW480細胞失去極性，排列松散，細胞間隙增寬，緊密聯接消失，細胞形態逐漸變成針尖狀，向類似間質細胞的形態轉化。

2.2 TPA對MMP-9蛋白表達水平的影響

為了觀察TPA對MMP-9蛋白表達水平的影響，利用Western Blot法檢測TPA處理0、0.5、1、3、6、12 h和24 h時SW480細胞中MMP-9蛋白表達的水平。如圖1所示，發現隨著TPA誘導時間的延長，MMP-9蛋白表達逐漸增高，呈時間依賴性，24 h時升高最明顯。

2.3 TPA對P38MAPK信號通路的影響

為了進一步驗證TPA誘導MMP-9的信號傳導通路，檢測TPA誘導0、0.25、0.5、1 h和3 h時P38 MAPK通路激活情況。P38的激活是通過其磷酸化為P-P38來實現的。如圖2所示，TPA誘導P-P38蛋白表達水平逐漸增高，0.5 h時P-P38水平升高最顯著，提示TPA誘導MMP-9過程中可激活P38MAPK通路。

2.4 各種抑制劑對TPA誘導MMP-9蛋白表達及分泌的影響

利用Western Blot法檢測MMP-9蛋白表達情況;利用明膠酶譜法檢測MMP-9細胞外分泌情況，各實驗組細胞MMP-9蛋白表達水平。如圖3所示，預處理PKC抑制劑GF109203X、P38抑制劑SB203580后，TPA誘導增加的MMP-9蛋白表達和分泌均被明顯抑制，提示TPA激活PKC-P38MAPK通路誘導MMP-9蛋白表達和分泌。

2.5 TPA對SW480細胞侵襲能力的影響

利用Transwell侵襲實驗檢測TPA對SW480細胞侵襲能力的影響。如封三圖2所示，與空白對照組相比，單用TPA后穿過基底膜的細胞數量明顯增加，差異有統計學意義（P<0.01）;與單用TPA組相比，TPA與PKC抑制劑GF109203X或P38抑制劑SB203580合用后，穿過基底膜的細胞數量明顯減少，差異有統計學意義（P<0.01），顯示TPA可明顯增強SW480細胞的侵襲能力，這種增強均可被PKC抑制劑GF109203X和P38抑制劑SB203580所抑制，再次證明TPA通過PKC-P38MAPK通路誘導SW480細胞MMP-9表達及細胞侵襲的作用。見表1、封三圖2。

3 討論

近年來研究顯示PKCs是一種轉化癌基因，PKC在腫瘤發生、發展及對抗瘤因子的反應均起到重要作用，可介導腫瘤細胞黏附、運動、侵襲及轉移過程[9]。然而，PKC誘導細胞侵襲的機制仍然撲朔迷離。本研究結果顯示，TPA通過PKC下游分子P38MAPK信號通路誘導結直腸癌細胞MMP-9表達及細胞侵襲。這些結果顯示，在結直腸癌細胞中PKC-P38 MAPK通路參與了MMP-9表達及侵襲過程，為阻止腫瘤侵襲轉移提供了可行的理論依據。

惡性腫瘤的浸潤和轉移過程從降解細胞外基質開始，MMPs通過降解基底膜、細胞外基質等，向周圍浸潤，并侵襲血管和淋巴管向遠處轉移，因此患者腫瘤組織中MMPs的含量和腫瘤的侵襲、轉移往往密切相關[10]。現已在多種人類腫瘤中檢測到MMPs的存在，在人類結腸癌中MMP-2、MMP-7和MMP-9均表達增高[11]。已有研究表明MMP-9與結直腸癌的發生有相關性，且作為結直腸癌的早發事件和影響預后的風險因子，MMP-9表達水平是評估結直腸癌患者復發風險的有效指標[5]。

PKC是蛋白激酶家族中的一個重要成員，參與各種細胞功能的調節，在細胞的增殖、分化、神經遞質的運輸、釋放及腫瘤發生等起重要作用。早期的研究表明PKC能夠被具有促腫瘤增殖作用的佛波醇所激活，提示PKC在腫瘤的增殖過程中可能起重要作用，被認為可能是腫瘤治療中的一個新靶點[9，12]。據報道激活的PKC能夠進一步磷酸化P38 MAPK信號通路[13]。

促分裂原活化蛋白激酶（MAPK）是細胞內一類絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，是細胞內主要信息傳遞途徑之一，其包括三大信號通路：P38MAPK信號通路、ERK細胞外信號調節蛋白激酶（ERK）通路及應激活化蛋白激酶（SAPK）/c-Jun氨基末激酶（JNK）信號通路[14]。P38是MAPK家族中的重要成員，是介導細胞反應的重要信號系統。P38信號通路是一種應激反應通路，它可被不同的外部與細胞內刺激所激活，從細胞凋亡至細胞增殖周期，到誘導細胞基因的表達、分化中都有廣泛的參與及應答。P38的激活是蘇氨酸和酪氨酸殘基的特定位置發生雙重磷酸化的過程[15-16]。

TPA是PKC的激活劑，作為促癌劑能促進腫瘤的發展[9]。而在分子腫瘤研究中，TPA作為經典促癌劑，其對細胞黏附的能力也有部分相關報道。有研究指出，TPA能在動態和靜態環境中增加HT-29細胞的黏附能力[17]。TPA與PKC有高親和性，一方面TPA可以與PKC穩定的結合，從而下調PKC活性，另一方面TPA可以充分激活PKC，促進癌細胞的侵襲及轉移。PKC的激活與結直腸癌侵襲轉移高度相關[18]。

本研究結果顯示，PKC激動劑TPA可以誘導SW480細胞向類似間質細胞的形態轉化，為結直腸癌細胞侵襲提供啟動因子。隨之，發現TPA時間依賴性誘導MMP-9蛋白表達增高，并且預處理PKC抑制劑可明顯阻滯TPA誘導的MMP-9表達及分泌，說明激活PKC可誘導結直腸癌細胞MMP-9蛋白的表達。進一步檢測TPA對PKC下游信號P38MAPK的作用，發現TPA激活PKC可誘導下游P38被磷酸化，說明激活PKC可誘導下游P38信號通路的激活;為再次證明P38 MAPK信號通路對MMP-9的調控作用，利用P38抑制劑預處理，發現PKC激活誘導的MMP-9蛋白表達可被P38抑制劑所明顯抑制。發現激活PKC可誘導結直腸癌細胞的侵襲能力增強，而這種增強可被PKC抑制劑和P38抑制劑所抑制，再一次證實了PKC誘導的結直腸癌細胞MMP-9表達及侵襲過程是介導P38MAPK通路來完成。

綜上所述，PKC可能是誘導結直腸癌侵襲的一個因子，初步探索了PKC誘導MMP-9蛋白表達的信號通路。PKC-P38-MMP-9可能是PKC誘導結直腸癌細胞侵襲的重要信號傳導通路之一，可能會為結直腸癌治療提供新的分子靶點。

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（收稿日期：2020-06-12）