煙草NtAGPase 基因家族的鑒定及功能解析

陳 瑩，李 騰，高 宇，劉寶玲，薛金愛，李潤植

（山西農業大學分子農業與生物能源研究所，山西太谷030801）

煙草是我國乃至世界的主要經濟作物之一，綜合利用潛力極大。淀粉是煙葉中重要的碳水化合物，也是煙葉干物質的主要成分，其組成和性質直接影響著煙葉的經濟價值[1]。研究煙草淀粉合成機制可為煙草定向改良和優良品種選育提供一定的科學基礎。

已有研究顯示，在植物體內，淀粉的生物合成過程主要受ADP- 葡萄糖焦磷酸化酶（ADP-glucose pyrophosphorylase，AGPase）、淀粉合成酶（Starch synthase，SS）、淀粉分支酶（Starch branching enzyme，SBE）和淀粉去分支酶（Starch debranching enzyme，SDBE）的調控[2]。其中，AGPase 催化葡萄糖 -1- 磷酸（Glu-1-P）與三磷酸腺苷（ATP）作用生成ADPG 和焦磷酸（PPi），是淀粉合成過程中的關鍵性限速酶[3]。

在細菌內，AGPase 是由glgC 基因編碼的同源四聚體，由同一種亞基構成；在高等植物中，AGPase是一個異源四聚體，由2 個大亞基和2 個小亞基組成[4-5]，其中，小亞基行使催化功能，大亞基調控小亞基的活性[6]。不同作物AGPase 大小亞基的分子質量不同，大亞基分子質量多為55～60 ku，小亞基的分子質量則是50～55 ku[6]。根據在植物細胞內的分布位置，AGPase 可分為質體型和胞質型[7]，大多數植物的AGPase 屬于質體型，催化反應主要在質體中進行；然而，在部分禾木科植物中，AGPase 屬于胞質型，例如小麥、玉米等[8-9]。此外，不同植物體內AGPase大小亞基基因數目也有差異。例如，在擬南芥中，AGPase 由 4 個大亞基（ApL1～ApL4）和 2 個小亞基（ApS1 和 ApS2）基因組成[10]。馬鈴薯 StAGPase 基因含有3 個大亞基和1 個小亞基基因[11]。木薯中共鑒定出9 個AGPase 基因家族成員，包含6 個大亞基（LS）和 3 個小亞基（SS）基因[12]。

為了深入研究煙葉碳水化合物生物合成及調控機制，本研究以AGPase 為靶標，從全基因組水平鑒定煙草NtAGPase 基因家族成員，利用生物信息學工具分析各成員的基因結構、系統進化、基因順式調控元件，以及編碼酶蛋白的理化特性、高級結構、亞細胞定位和功能活性域等，研究結果將為利用基因工程進行煙草遺傳改良提供理論依據和分子修飾靶標。

1 材料和方法

1.1 煙草NtAGPase 家族成員鑒定

從擬南芥數據庫 Tair（https：//www.arabidopsis.org/）獲得AtAGPase 蛋白序列（包括4 條大亞基序列和2 條小亞基序列）。以AtAGPase 大小亞基氨基酸序列為索引序列，在煙草數據庫（https：//solgenomics.net/）進行Blast P 分析，對獲得的多條NtAGPase大小亞基氨基酸序列進行甄別，去除冗余序列；然后，用 CDD（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi） 和 SMART（http：//smart.embl-heidelberg.de/）在線軟件對候選NtAGPase 序列進行蛋白結構域分析，篩選鑒定出煙草NtAGPase 家族成員。

1.2 蛋白理化特性分析

利用ProtParam（http：//web.expasy.org/protparam/）分析NtAGPase 編碼蛋白的氨基酸組成、蛋白質分子質量、理論等電點、不穩定指數、疏水指數等理化性質；通過 DTU（https：//services.healthtech.dtu.dk/）中的在線工具 TMHMM、NetPhos、SignalP 分別預測NtAGPase 的跨膜結構域、磷酸化位點、信號肽位點；利用 Plant-mPLoc（http：//www.csbio.sjtu.edu.cn/bioinf/plant-multi/）預測其亞細胞定位；利用Expasy中 ProtScale 工 具（https：//web.expasy.org/protscale/）分析其疏水區域。

1.3 高級結構分析

利用 SOPMA（http：//metadatabase.org/wiki/SOPMA）預測NtAGPase 蛋白的二級結構；通過Phyer2（http：//www.sbg.bio.ic.ac.uk/phyre2/html/page）對 NtAGPase 酶蛋白的三級結構進行同源建模。

1.4 基因結構分析

利用在線軟件 GSDS 2.0（http：//gsds.cbi.pku.edu.cn/）分析NtAGPase 基因序列內含子、外顯子數量，并繪制基因結構圖；利用MEME（http：//meme-suite.org/tools/meme）分析NtAGPase 基因保守元件，設置最大元件數量為13 個，元件的最佳寬度為6～50。

1.5 啟動子區域順式作用元件預測

在煙草數據庫中獲得煙草NtAGPase 家族成員的啟動子序列（轉錄起始位點上游1.5 kb），通過PlantCARE（http：//bioinformatics.psb.ugent.be/webtool s/plantcare/html/）預測它們的啟動子區域順式作用元件，并通過GSDS 2.0 在線軟件進行作圖。

1.6 多序列比對及系統進化分析

表1 煙草、擬南芥和馬鈴薯AGPase 家族成員信息

利用Clustal W 軟件對擬南芥和煙草AGPase蛋白序列進行多序列比對，參數選為默認值；利用MEGA 6.0 軟件，采用鄰接法（Neighbor-Joining，N-J）對煙草NtAGPase 和其他已知物種的AGPase構建系統發育樹（表1），其中，校驗參數BootStrap設為1 000 次，其他參數均為默認值。

2 結果與分析

2.1 煙草NtAGPase 基因家族成員鑒定

以AtAGPase 大小亞基蛋白序列為探針，通過在煙草數據庫中進行Blast P 分析，得到多條煙草NtAGPase 大小亞基蛋白序列；通過CDD 和SMART分析，將同時含有NTP-transferase 和PbH1 結構域的氨基酸序列篩選出來，去除冗余后，共獲得3 條NtAGPase 大亞基蛋白序列和1 條NtAGPase 小亞基蛋白序列，分別命名為NtLSU1（XP_016509038.1）、NtLSU2（XP_016491048.1）、NtLSU3（XP_016497751.1）和 NtSSU（NP_001312588.1）。

2.2 NtAGPase 酶蛋白理化特性分析

ProtParam 分析結果顯示（表 2），NtLSUs 編碼蛋白的長度范圍在519（NtLSU3）～529 個氨基酸（NtLSU2），分子質量介于 57.03（NtLSU3）～58.43 ku（NtLSU2）。SSU 編碼蛋白的長度為520 個氨基酸，分子質量為57.38 ku。NtLSUs 的等電點均大于7，呈弱堿性；而NtSSU 等電點略小于7，呈弱酸性。NtLSUs 蛋白的不穩定性指數均小于40，屬于穩定蛋白；而NtSSU 蛋白的不穩定指數為43.67（大于40），屬于不穩定蛋白。NtLSUs 和 NtSSU 的平均親水值介于 -0.246（NtLSU1）～-0.122（NtLSU3），均屬于親水性蛋白。

分別利用 Plant-mPLoc、ProtScale、DTU 在線軟件對NtAGPase 大小亞基蛋白進行亞細胞定位、疏水區域、跨膜結構、磷酸化位點及信號肽的預測，結果表明，NtLSUs 和NtSSU 蛋白均定位于葉綠體上，說明NtLSUs 和NtSSU 分別屬于質體型大亞基和質體型小亞基。NtLSUs 和NtSSU 蛋白均無跨膜區，屬于親水性蛋白，這與Protparam 軟件預測結果一致。3 個NtLSUs 之間的理化性質基本一致，但是與NtSSU 理化性質不同。

表2 煙草NtAGPase 家族成員蛋白理化特性

2.3 NtAGPase 酶蛋白二級結構預測

SOPMA 軟件預測結果顯示，NtLSUs 和NtSSU蛋白的二級結構都只含有3 種結構，分別是α- 螺旋、延伸鏈和無規則卷曲，不包括β- 轉角；其中，無規則卷曲的比例最高，范圍在46.24%（NtLSU3）～54.25%（NtLSU2）；其次是α- 螺旋，比例范圍在25.15%（NtLSU2）～33.33%（NtLSU3）；延伸鏈占比最少，比例在 17.31%（NtSSU）～21.97%（NtLSU1）（圖 1）。

2.4 NtAGPase 酶蛋白三級結構預測

利用Phyer2 在線工具對煙草NtAGPase 酶蛋白進行了三級結構預測，結果以c1yp3C 膜結構蛋白為模板建模（圖2）。

從圖2 可以看出，煙草NtAGPase 酶蛋白是一個由不同亞基組成的異源四聚體，其與模板的相似性為84%，而擬南芥AtAGPase 酶蛋白與模板的相似性為82%。也就是說，NtAGPase 酶蛋白結構與AtAGPase 酶蛋白結構極為相似，推測它們在植物體內發揮著類似功能。

2.5 NtAGPase 基因結構和蛋白結構域分析

從NtLSUs 和NtSSU 的基因結構來看（圖3），NtAGPase 大小亞基均由外顯子、內含子和UTR 組成。NtLSU1 和 NtLSU2 均含有 14 個外顯子和 13 個內含子；NtLSU3 含有15 個外顯子和14 個內含子。然而，NtSSU 僅含有9 個外顯子和8 個內含子，明顯少于NtLSUs。

通過MEME 軟件預測出煙草NtAGPase 蛋白含有13 個蛋白保守元件（圖4）。

2.6 NtAGPase 基因啟動子區域順式作用元件分析

表3 煙草NtAGPase 基因啟動子順式作用元件

NtLSUs 和NtSSU 啟動子中均富含TATA-box、CAAT-box和多種光響應元件。其中，NtLSU1 中特有干旱脅迫響應元件（MBS），其在干旱條件下可能發揮一定的作用；NtLSU2 和NtLSU3 中均含有脫落酸響應元件（ABRE）和抗氧化響應元件（ARE）。NtSSU中含有較多與激素相關的反應元件，如乙烯響應元件（ERE）和茉莉酸響應元件（CGTCA-motif）。除NtLSU3 外，其他亞基基因都含有低溫脅迫響應元件（LTR），推測煙草NtAGPase 基因在響應低溫脅迫過程中行使功能。此外，NtLSUs 和NtSSU 啟動子中還含有多種與激素反應相關、逆境反應相關的響應元件，如生長素響應元件（TGA）、赤霉素響應元件（GARE-motif）、水楊酸響應元件（TCA）以及機械表示傷害響應元件（WUN-motif）、脅迫防御響應元件（TC-rich repeats）（表 3）。說明 NtAGPase 催化的酶反應可能參與煙草多種生理活動以及對環境的響應等。

2.7 NtAGPase 酶蛋白多序列比對

利用 Clustal W 軟件對 NtLSUs 和 NtSSU 分別進行多序列比對分析。選取擬南芥AtAPL 蛋白作為對照，在煙草NtLSUs 蛋白中發現4 個功能結構域（圖 5），分別是 AGPase signature 1、AGPase signature 2、AGPase signature 3 和葡萄糖腺苷轉移酶功能區（Glucose-1-phosphate adenylytransferase region）。煙草NtSSU 蛋白也按照同樣的方法進行分析，結果顯示，煙草NtSSU 蛋白序列與擬南芥AtAPS1 蛋白序列同源性高達87.50%，并且煙草NtSSU 蛋白保守結構域與擬南芥AtAPS1 類似，均包括5 個功能結構域，分別是AGPase signature 1、AGPase signature 2、AGPase signature 3、Glyco-tranf-GTA-type 超家族區域和葡萄糖腺苷轉移酶功能區（Glucose-1-phosphate adenylytransferase region）（圖 6）。

2.8 系統進化分析

為了研究AGPase 蛋白家族之間的進化關系，本研究使用MEGA 6.0 軟件對來自擬南芥、煙草、馬鈴薯AGPase 蛋白進行了進化分析，生成了一個鄰聯進化樹如圖7 所示，根據不同亞基類型，NtAGPase酶蛋白家族明顯被分為2 組（大亞基組和小亞基組），其中，NtLSUs（NtLSU1、NtLSU2 和 NtLSU3）、AtAPLs（AtAPL1、AtAPL2、AtAPL3 和 AtAPL4） 和 StLSUs（StLSU1、StLSU2 和StLSU3）被歸為大亞基組；NtSSU、AtAPSs（AtAPS1、AtAPS2）和 StSSUs（StSSU1、StSSU2）一起歸為小亞基組。

3 結論與討論

有研究發現，淀粉是煙草中主要的碳水化合物，在成熟的煙葉中淀粉含量高達40%[14]，但過多的淀粉會嚴重影響煙葉的外觀和煙草制成品的品質[1]。已有大量研究表明，AGPase 活性大小決定著淀粉的合成速率及合成量。例如，在木薯（Manihot esculenta Crantz）中異位表達大腸桿菌glgC 基因，可使木薯塊莖中淀粉含量明顯增加[15]。而在馬鈴薯（Solanum tuberosum）中反義表達StAGPase 會導致馬鈴薯塊莖中淀粉水平顯著降低，同時降低直鏈淀粉與支鏈淀粉的比率[16]。因此，深入探究煙草NtAGPase基因的調控機制，并通過基因工程手段調節煙葉淀粉含量，對提高煙葉品質具有重要意義。

在高等植物中，AGPase 是一個由大亞基和小亞基構成的異源四聚體，并且在不同的植物中編碼AGPase 大小亞基的基因數目不同[10-13]。本研究以擬南芥AtAGPase 蛋白為探針，通過Blast P 和SMART分析得到了編碼煙草NtAGPase 酶蛋白的基因序列；通過功能結構域分析，篩選出含有NTP-transferase 和PbH1 結構域的3 個大亞基的編碼基因（NtLSU1、NtLSU2、NtLSU3）和 1 個小亞基的編碼基因（NtSSU）。

NtAGPase 大小亞基編碼蛋白長度和分子質量相近，但在部分理化性質上有所差異。NtLSUs 的理論等電點值均大于7，偏堿性，其不穩定系數均小于40，屬于穩定蛋白；而NtSSU 的理論等電點值小于7，偏酸性，其不穩定系數大于40，屬于不穩定蛋白。其中，NtAGPase 大小亞基基因的外顯子數目差異較大，其中，NtLSUs 含有 14～15 個外顯子，NtSSU僅含有9 個外顯子，明顯少于NtLSUs。這與已有研究結果一致[17]。

本研究對煙草NtAGPase 基因啟動子順式作用元件分析發現，NtAGPase 基因中含有大量的光響應 元 件 ， 如 G-Box、AE-Box、GT1-motif、GA-motif等，推測其在光合作用中發揮作用或者受到光信號因子的調控。此外，NtAGPase 基因還含有多種與激素反應、逆境反應相關的響應元件，推測該基因不僅參與植物的生長發育過程，還在多種逆境反應中發揮作用，例如低溫脅迫、干旱脅迫等。

本研究對煙草和擬南芥AGPase 大小亞基分別進行多序列比對，結果表明，煙草NtAGPase 家族成員之間同源性為69.48%；而煙草NtLSUs 和NtSSU序列與擬南芥AtAPLs 和AtAPSs 蛋白序列同源性分別為75.54%和87.50%。說明同一物種大小亞基的同源性低于不同物種同一亞基之間的同源性；不同物種同一亞基之間小亞基更加保守，大亞基趨于歧化[18]。此外，本研究還發現，NtAGPase 和AtAGPase大小亞基蛋白序列的差異性主要表現在N 端，推測N 端序列很可能影響著NtAGPase 酶蛋白的功能。系統進化分析結果顯示，NtLSUs 和NtSSU 蛋白分別歸為大亞基組和小亞基組，這與其他高等植物中AGPase 的分類一致[19-20]。有研究推測，植物體內AGPase 大小亞基基因來源于同一基因，但該基因在進化過程中，由于選擇壓力或最適活性需求不同而出現分離，從而產生了2 種不同的亞基[13]。此外，煙草NtAGPase 與馬鈴薯StAGPase 的親緣關系明顯高于其與擬南芥AtAGPase 的親緣關系，這是因為煙草與馬鈴薯同屬于茄科植物，進化上比較一致。

本研究鑒定獲得了4 個煙草NtAGPase 家族成員，包括3 個大亞基和1 個小亞基基因；通過生物信息學技術對其基因結構和編碼蛋白結構及理化特性等進行了詳細分析，為后續探索煙草NtAGPase 基因功能及煙草淀粉生物合成調控機制等提供了相應的理論基礎。